内分泌干扰物（EDCs）对生物体及自然环境构成了严重问题。Drosophila melanogaster 是研究EDCs在体内效应的理想模型。本文介绍了在果蝇中研究内分泌干扰的方法，涵盖EDCs对果蝇繁殖力、生育力、发育时间以及寿命的影响。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
近年来，越来越多的证据表明，所有生物体及其环境都暴露于一类具有激素样作用的化学物质，即内分泌干扰物（endocrine disruptor chemicals, EDCs）。这些化学物质可能扰乱内分泌系统的正常平衡，导致不良效应，例如人群中激素相关疾病的发生率不断上升，或野生动物出现生长异常和繁殖能力下降。对于某些内分泌干扰物，已有明确的健康危害记录，并对其使用实施了限制；然而，大多数此类化学物质在此方面的科学证据仍然缺乏。为了验证某种化学物质在完整生物体中潜在的内分泌干扰效应，我们需要在合适的模型系统中进行测试，其中包括果蝇Drosophila melanogaster。本文报道了在果蝇中研究内分泌干扰的详细体内实验方案，重点评估EDCs对果蝇繁殖力/生育力、发育时间以及寿命的影响。近年来，我们利用这些果蝇的生活特征，研究了17-α-乙炔基雌二醇（EE2）、双酚A（BPA）和双酚AF（BPA F）暴露所产生的效应。总体而言，这些检测涵盖了果蝇的全部生活史阶段，使得评估所有激素介导过程中的内分泌干扰成为可能。繁殖力/生育力检测和发育时间检测分别可用于衡量EDCs对果蝇生殖表现和发育阶段的影响。最后，寿命检测则涉及对成虫进行慢性EDCs暴露，并记录其存活情况。然而，这些生活特征也可能受到多种实验因素的影响，因此必须严格控制。为此，本文提出了一系列我们已优化的实验操作步骤，以确保上述检测获得可靠结果。这些方法可帮助科研人员在果蝇中确定任何单一EDC或多种EDCs混合物是否具有内分泌干扰作用；但若要明确产生效应的具体内分泌作用机制，则可能需要进一步开展其他实验。
引言
人类活动已向环境中释放了大量化学物质，这些物质对生物体和自然生态系统构成了严重问题1。在这些污染物中，据估计约有1000种不同的化学物质可能干扰内分泌系统的正常平衡；根据这一特性，它们被归类为内分泌干扰物（endocrine disrupting chemicals, EDCs）。具体而言，根据内分泌学会最近的定义，EDCs是指“一种外源性化学物质，或多种化学物质的混合物，能够干扰激素作用的任何方面”2。在过去三十年中，越来越多的科学证据表明，EDCs会影响动植物的繁殖和发育3,4,5,6,7,8。此外，EDCs暴露还与某些人类疾病发病率的上升相关，包括癌症、肥胖症、糖尿病、甲状腺疾病以及行为障碍9,10,11。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 食物制备
- 用于果蝇品系保种及幼虫生长，使用含3%干酵母粉、10%蔗糖、9%预煮玉米粉、0.4%琼脂的玉米粉培养基，后文简称玉米粉培养基（CM）。
- 将30 g酵母加入100 mL自来水中，煮沸并持续沸腾15分钟。
- 另取900 mL自来水，充分混合90 g预煮玉米粉、100 g蔗糖和4 g琼脂。
- 将上述溶液煮沸，调低火力，持续搅拌并煮5分钟。
- 5分钟后，加入热的酵母溶液，继续小火加热15分钟。
- 关闭热源，使溶液冷却至约60 °C。
- 加入5 mL/L的10%对羟基苯甲酸甲酯乙醇溶液，充分混匀，静置10分钟。
注意：需谨慎控制对羟基苯甲酸甲酯的用量，因其浓度过高可能对幼虫具有致死性。 - 将培养基分装至小管或瓶子中： 每支果蝇小管（25 mm × 95 mm）分装8 mL，每支果蝇小管（22 mm × 63 mm）分装3 mL，每瓶果蝇培养瓶（250 mL）分装60 mL。
- 用纱布覆盖管口，在室温（RT）下干燥24小时后储存。
- 通过调整琼脂用量和/或冷却/干燥时间，实验校准CM培养基的合适稠度和含水量。
注意：未加塞、装盒并包裹的小管在4 °C下可稳定保存约15天。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本部分以简化的示意图形式展示上述方案中的关键步骤。由于果蝇倾向于回避难吃的化合物，因此首先需要检测所选环境内分泌干扰物（EDC）的味道。可通过将食用色素（例如红色食用染料40号）35 与添加了不同剂量所选EDC的食物或仅含溶剂的食物混合来实现。将果蝇饲喂于这些培养基后，在体视显微镜下观察其腹部着色情况，以此估算摄食量（图1）。图1 展示了一种典型的理想情况：两只成年雌蝇，一只饲喂含有选定EDC的培养基，另一只饲喂不含EDC的培养基，二者腹部均呈现相同的着色。
人们普遍认为，环境内分泌干扰物（EDCs）与天然激素类似，在极低剂量下即会产生效应，且其剂量与效应之间并不存在简单的线性关系29，较高剂量未必产生更强的效应36,37。因此，为了全面评估其影响，建议.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
果蝇 D. melanogaster 被广泛用作体内模型系统，以研究环境内分泌干扰物（如 DBP28、BPA、4-NP、4-叔-OP29、MP30、EP31,32、DEHP33 和 EE234）的潜在影响。该研究领域选择果蝇作为模型的原因有多个。除了其作为模型系统的公认优势外，果蝇与人类在基因上具有高度保守性，因此果蝇的内分泌干扰物检测可能有助于预测或提示对人类健康的潜在影响。此外，果蝇属于无脊椎动物，而无脊椎动物在所有生态系统中均广泛存在，亟需加强保护措施以抵御内分泌干扰物的损害作用。无脊椎动物位于食物链的底层，在其生存环境中发挥着极为重要的功能。已有报道指出，释放到环境中的多种内分泌干扰物可能对多种动物物种的发育和繁殖产生有害影响。果蝇的另一优势在于其适用于实验室.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Orsolina Petillo提供的技术支持。作者感谢CNR的Mariarosaria Aletta博士提供的文献支持。作者感谢Gustavo Damiano Mita博士向他们介绍EDC领域。作者感谢Leica Microsystems和Pasquale Romano提供的协助。本研究由项目PON03PE_00110_1“面向组织再生与重建、种植学及牙科/眼科传感技术的纳米技术开发”，简称“SORRISO”；委托方：PO FESR 2014-2020 CAMPANIA；以及坎帕尼亚大区PO FESR 2007-2013项目“用于生物活性分子可控释放的纳米技术”资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 17α-乙炔雌二醇 | Sigma | E4876-1G | |
| 用于Drosophila培养基的琼脂 | BIOSIGMA | 789148 | |
| 双酚A | Sigma | 239658-50G | |
| 双酚AF | Sigma | 90477-100MG | |
| 玉米粉 | CA' BIANCA | ||
| 乙醚 | Sigma | ||
| 果蝇培养管 | BIOSIGMA | 789008 | 25 mm × 95 mm |
| 果蝇培养管 | BIOSIGMA | 789009 | 29 mm × 95 mm |
| 果蝇培养管 | Kaltek | 187 | 22 mm × 63 mm |
| 胚胎收集笼 | Crafts | 聚甲基丙烯酸甲酯圆筒（12.5 mm × 7 cm），一端开口，另一端由带槽的矩形底座封闭，槽口用于插入产卵专用托盘 | |
| 乙醇 | FLUKA | 2860 | |
| 乙醚麻醉瓶 | Crafts | 带棉塞的圆柱形玻璃容器 | |
| 玻璃瓶 | 250 mL 瓶 | ||
| 玻璃小瓶 | Microtech | ST 10024 | 平底管 100 × 24 |
| 手持式搅拌器 Pimmy | Ariete | 食物料理机 | |
| 速溶酵母 | ESKA | 粉末状酵母 | |
| 产卵托盘 | Crafts | 聚甲基丙烯酸甲酯托盘（11 cm × 2.6 cm），用于倾注产卵培养基 | |
| 对羟基苯甲酸甲酯 | SIGMA | H5501 | |
| 培养皿 | Falcon | 351016 | 60×5 |
| 红色染料40号 | SIGMA | 16035 | |
| 带LED光源的体视显微镜 | Leica | S4E | |
| 蔗糖 | HIMEDIA | MB025 | |
| 番茄酱 | Cirio |
参考文献
- Kareiva, P. M., Marvier, M. Managing fresh water for people and nature. Conservation Science: Balancing the Needs of People and Nature. Kareiva, P. M., Marvier, M. , Roberts and Company Publishers. Greenwood Village, CO. 460-509 (2011).
- Zoeller, R. T., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
