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Drosophila melanogaster中内分泌干扰检测方法

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DOI：

10.3791/59535

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2019年7月3日

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1Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology, UniNa "Federico II"

通讯作者： Ennio Giordano <egiordan@unina.it>, Filomena Anna Digilio <filomenaanna.digilio@cnr.it>

本文内容

摘要

内分泌干扰物（EDCs）对生物体及自然环境构成了严重问题。Drosophila melanogaster 是研究EDCs在体内效应的理想模型。本文介绍了在果蝇中研究内分泌干扰的方法，涵盖EDCs对果蝇繁殖力、生育力、发育时间以及寿命的影响。

摘要

近年来，越来越多的证据表明，所有生物体及其环境都暴露于一类具有激素样作用的化学物质，即内分泌干扰物（endocrine disruptor chemicals, EDCs）。这些化学物质可能扰乱内分泌系统的正常平衡，导致不良效应，例如人群中激素相关疾病的发生率不断上升，或野生动物出现生长异常和繁殖能力下降。对于某些内分泌干扰物，已有明确的健康危害记录，并对其使用实施了限制；然而，大多数此类化学物质在此方面的科学证据仍然缺乏。为了验证某种化学物质在完整生物体中潜在的内分泌干扰效应，我们需要在合适的模型系统中进行测试，其中包括果蝇Drosophila melanogaster。本文报道了在果蝇中研究内分泌干扰的详细体内实验方案，重点评估EDCs对果蝇繁殖力/生育力、发育时间以及寿命的影响。近年来，我们利用这些果蝇的生活特征，研究了17-α-乙炔基雌二醇（EE2）、双酚A（BPA）和双酚AF（BPA F）暴露所产生的效应。总体而言，这些检测涵盖了果蝇的全部生活史阶段，使得评估所有激素介导过程中的内分泌干扰成为可能。繁殖力/生育力检测和发育时间检测分别可用于衡量EDCs对果蝇生殖表现和发育阶段的影响。最后，寿命检测则涉及对成虫进行慢性EDCs暴露，并记录其存活情况。然而，这些生活特征也可能受到多种实验因素的影响，因此必须严格控制。为此，本文提出了一系列我们已优化的实验操作步骤，以确保上述检测获得可靠结果。这些方法可帮助科研人员在果蝇中确定任何单一EDC或多种EDCs混合物是否具有内分泌干扰作用；但若要明确产生效应的具体内分泌作用机制，则可能需要进一步开展其他实验。

引言

人类活动已向环境中释放了大量化学物质，这些物质对生物体和自然生态系统构成了严重问题1。在这些污染物中，据估计约有1000种不同的化学物质可能干扰内分泌系统的正常平衡；根据这一特性，它们被归类为内分泌干扰物（endocrine disrupting chemicals, EDCs）。具体而言，根据内分泌学会最近的定义，EDCs是指“一种外源性化学物质，或多种化学物质的混合物，能够干扰激素作用的任何方面”2。在过去三十年中，越来越多的科学证据表明，EDCs会影响动植物的繁殖和发育3,4,5,6,7,8。此外，EDCs暴露还与某些人类疾病发病率的上升相关，包括癌症、肥胖症、糖尿病、甲状腺疾病以及行为障碍9,10,11。

内分泌干扰物的普遍作用机制

由于其分子特性，环境内分泌干扰物（EDCs）可表现出类似激素或激素前体的作用3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。在此意义上，它们能够与激素受体结合，并通过模拟激素活性或阻断内源性激素与受体的结合，干扰内分泌系统。在前一种情况下，EDCs 与受体结合后可像天然激素一样激活该受体；在后一种情况下，EDCs 与受体结合后会阻止天然激素与其结合，从而使受体被阻断，即使存在天然激素也无法被激活3。因此，EDCs 可影响多种生理过程，例如内源性激素的合成、分泌、转运、代谢或外周作用，而这些激素正是维持机体稳态、生殖、发育和/或行为所必需的。受体结合并非迄今所描述的 EDCs 作用的唯一途径。目前明确的是，EDCs 还可通过在酶促通路中募集共激活因子或共抑制因子，或通过修饰表观遗传标记物从而扰乱基因表达10,11,12,13,14，其影响不仅限于当代个体，还可能波及后代的健康8。

果蝇激素

已对多种内分泌干扰物（EDC）的潜在效应在野生动物物种以及若干内分泌机制相对明确的模式系统中进行了广泛研究。对于无脊椎动物而言，由于昆虫在生物研究领域被广泛使用、具有重要的经济意义，以及能够开发出特异性干扰害虫昆虫激素系统的杀虫剂，因此昆虫中影响生长、发育和繁殖的内分泌系统已得到深入表征。

在昆虫中，果蝇 D. melanogaster 尤其被证明是评估环境内分泌干扰物（EDC）潜在内分泌效应的极为有力的模式系统。在 D. melanogaster 中，与脊椎动物类似，激素在整个生命周期中均发挥着重要作用。该生物体内存在三个主要的激素系统，分别涉及类固醇激素20-羟基蜕皮酮（20E）15,16、倍半萜类激素保幼激素（JH）17，以及神经肽和肽/蛋白质类激素18。第三类激素包含多种近年来新发现的肽类物质，明确参与多种生理与行为过程，如寿命调控、稳态维持、代谢、繁殖、记忆及运动控制。20E 与胆固醇衍生的类固醇激素（如雌二醇）具有同源性，而 JH 则与视黄酸具有一定相似性；这两者是果蝇中研究较为深入的激素19,20。它们之间的平衡对于协调蜕皮和变态过程至关重要，同时也调控多种发育后的生理过程，如繁殖、寿命和行为21，因而为在果蝇中检测内分泌干扰效应提供了多种可能。此外，蜕皮激素和保幼激素是所谓第三代杀虫剂的主要作用靶点，这类杀虫剂旨在干扰昆虫体内由内分泌介导的发育和生殖过程。这些化学物质的激动剂或拮抗剂作用机制已被充分阐明，因此可作为评估潜在 EDC 对昆虫生长、繁殖和发育影响的参考标准22。例如，甲氧普烯被广泛用于控制蚊子及其他水生昆虫23,24，其作为 JH 激动剂可抑制 20E 诱导的基因转录和变态过程。

除了激素之外，果蝇中的核受体（NR）超家族也广为人知，它包含18个在进化上保守的转录因子，参与调控激素依赖性的发育通路以及生殖和生理过程25。这些激素类核受体属于核受体超家族的全部六个亚型，包括参与神经传递的核受体26、两类视黄酸核受体，以及类固醇核受体——在脊椎动物中，后者是环境内分泌干扰物（EDCs）的主要靶标之一27。

利用果蝇作为研究环境内分泌干扰物的模式系统

目前，基于分子特性，全球多个环境机构已将干扰内分泌系统的潜在能力归因于多种人工化学物质。鉴于环境内分泌干扰物（EDCs）对环境和生物体而言是一个全球性且普遍存在的问题，该领域研究的总体目标是减轻其导致的疾病负担，并保护生物体免受其有害影响。为了深入理解某种化学物质潜在的内分泌干扰效应，有必要在活体（in vivo）条件下对其进行测试。在此方面，D. melanogaster 是一个有效的模型系统。迄今为止，果蝇已被广泛用作活体模型，以评估多种环境内分泌干扰物的影响；已有研究报道，暴露于多种内分泌干扰物，如邻苯二甲酸二丁酯（DBP）28、双酚A（BPA）、4-壬基酚（4-NP）、4-叔辛基酚（4-tert-OP）29、对羟基苯甲酸甲酯（MP）30、对羟基苯甲酸乙酯（EP）31,32、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）33 和17-α-乙炔基雌二醇（EE2）34，会影响其代谢和内分泌功能，其效应与在脊椎动物模型中观察到的结果相似。果蝇被用作该研究领域的模型，其原因有多种。除了对其内分泌系统已有深入的了解外，其他优势还包括生命周期短、成本低、基因组易于操作、长期的研究历史以及多种技术手段（参见 FlyBase 网站，http://flybase.org/）。D. melanogaster 还为研究环境因素的跨代效应和种群响应提供了强有力的模型8，并避免了在高等动物中进行活体研究相关的伦理问题。此外，果蝇与人类在基因上具有高度保守性，这使得利用果蝇进行EDC检测可能有助于预测或提示这些化学物质对人类健康的潜在影响。除了拓展对人类健康影响的理解外，果蝇还有助于评估EDC暴露对环境的风险，例如生物多样性丧失和环境退化。最后，果蝇的另一优势在于其可在实验室中使用，其中可能影响其发育、繁殖和寿命的因素均可被严格控制，从而可将任何观察到的变化归因于待测物质。

基于此，我们优化了简单且稳健的适合度检测方法，用于确定环境内分泌干扰物（EDC）对某些果蝇激素性状的影响，比如果蝇的繁殖力/生育力、发育时间以及成虫寿命。这些检测方法已被广泛应用于一些EDC的研究23,24,25,26,27。特别是，我们已使用以下实验方案评估了暴露于合成雌激素EE234、双酚A（BPA）以及双酚AF（BPAF）的影响（未发表数据）。这些实验方案可轻松修改，用于研究单一EDC的作用，也可用于研究多种EDC在D. melanogaster中的联合效应。

方案

1. 食物制备

  1. 用于果蝇品系保种及幼虫生长，使用含3%干酵母粉、10%蔗糖、9%预煮玉米粉、0.4%琼脂的玉米粉培养基，后文简称玉米粉培养基（CM）。
    1. 将30 g酵母加入100 mL自来水中，煮沸并持续沸腾15分钟。
    2. 另取900 mL自来水，充分混合90 g预煮玉米粉、100 g蔗糖和4 g琼脂。
    3. 将上述溶液煮沸，调低火力，持续搅拌并煮5分钟。
    4. 5分钟后，加入热的酵母溶液，继续小火加热15分钟。
    5. 关闭热源，使溶液冷却至约60 °C。
    6. 加入5 mL/L的10%对羟基苯甲酸甲酯乙醇溶液，充分混匀，静置10分钟。
      注意：需谨慎控制对羟基苯甲酸甲酯的用量，因其浓度过高可能对幼虫具有致死性。
    7. 将培养基分装至小管或瓶子中：  每支果蝇小管（25 mm × 95 mm）分装8 mL，每支果蝇小管（22 mm × 63 mm）分装3 mL，每瓶果蝇培养瓶（250 mL）分装60 mL。 
    8. 用纱布覆盖管口，在室温（RT）下干燥24小时后储存。
    9. 通过调整琼脂用量和/或冷却/干燥时间，实验校准CM培养基的合适稠度和含水量。
      注意：未加塞、装盒并包裹的小管在4 °C下可稳定保存约15天。 
  2. 对于果蝇成虫，使用含10%干酵母粉、10%蔗糖、2%琼脂的培养基，后文简称成虫培养基（AM）。
    1. 将10 g干酵母粉、10 g蔗糖和2 g琼脂加入100 mL蒸馏水中混合均匀。
    2. 使用微波炉将混合物煮沸两次，每次间隔3分钟，或持续加热至琼脂完全溶解。 
    3. 当溶液冷却至60 °C时，加入5 mL/L的10%对羟基苯甲酸甲酯乙醇溶液，充分混匀后分装至小管中（每管10 mL）。
    4. 用纱布覆盖管口，在室温（RT）下干燥24小时后储存。 
      注意：未加塞、装盒并包裹的小管在4 °C下可稳定保存约15天。
  3. 用于繁殖力/生育力检测时，使用果蝇番茄汁-玉米粉培养基。
    1. 将70 mL温热的玉米粉培养基倒入100 mL烧杯中，加入30 mL番茄汁（体积分数30%）。
    2. 使用食物搅拌器充分混匀，并用移液器将3 mL混合液分装至小管中。
    3. 用纱布覆盖管口，在室温（RT）下干燥24小时后储存。 
      注意：未加塞、装盒并包裹的小管在4 °C下可稳定保存约15天。
  4. 用于胚胎收集时，使用含3%琼脂、30%番茄酱和3%蔗糖的琼脂平板。 
    注意：将培养基倒入平板时需避免产生气泡。

2. 果蝇 EDC 给药

  1. 配制适当浓度的储备液：将所选的内分泌干扰物（EDC）溶解于合适的溶剂中。对于乙炔雌二醇（EE2，分子量为296.403），取1.48 g溶于10 mL 100%乙醇中，配制成0.5 M的储备液，并于-80 °C保存。
    注意：内分泌干扰物被视为环境污染物，操作时应采取适当防护措施。 
  2. 用10%乙醇水溶液（v/v）稀释EE2储备液，获得100 mM的溶液。随后在玉米粉培养基（CM）食物中进行进一步稀释（0.1 mM、0.5 mM和1 mM），从最低浓度开始，并确保各处理组中溶剂的终浓度一致。对照组小瓶中加入等体积的纯溶剂。 
    注：建议尽可能降低溶剂的终浓度，注意乙醇在果蝇食物中的终浓度不应超过2%。
  3. 在培养基凝固前，将含有适当稀释浓度EDC的溶液加入玉米粉培养基中，使用食物处理器充分混匀，分装10 mL至各小瓶中，覆盖棉纱布，室温下静置干燥16小时后使用。 
    注：该培养基应在配制后立即使用。
  4. 对于成虫饲养，分别用10%乙醇水溶液（v/v）配制不同工作浓度的EE2溶液（10 mM、50 mM和100 mM），并将每种溶液各取100 µL铺加至AM培养基表面，以获得目标浓度的EE2（0.1 mM、0.5 mM和1 mM）。对照组使用等体积的纯溶剂。
    注：也可将含有适当稀释浓度EDC的溶液加入少量AM培养基中，置于50 mL锥形管内，充分涡旋混匀，再取1 mL分层铺于AM小瓶表面。
    1. 用棉纱布覆盖小瓶，在室温下轻轻振荡条件下干燥12–16小时，随后立即使用。 
      注：干燥时间需根据实验条件调整，因其受环境湿度影响。
  5. 进行摄食实验时，在CM培养基凝固前同时加入含有适当稀释浓度EDC的溶液（EE2 0.1 mM、0.5 mM和1 mM）以及染色食物（例如，红色染料40号，浓度为1 mg/mL）35，强力混匀后分装至小瓶中。

3. 果蝇的饲养

  1. 使用遗传背景稳定的同基因型品系（如 Oregon R），并在实验室中连续培养多代。 
  2. 将果蝇饲养于湿度和温度可控的培养箱中，在25 °C条件下采用12小时光照:12小时黑暗的自然光周期，培养基为含CM食物的试管。
  3. 每次实验时，使用处于室温（RT）条件下的试管。

4. 喂养实验

注意：建议使用本实验检测培养基中选定的EDC是否存在可能影响果蝇摄食的情况。

  1. 将15只年轻果蝇放入含有添加了不同浓度目标环境内分泌干扰物（EDC）及染色食物的CM培养基的小瓶中，让果蝇取食培养基1天。
    注意：例如，使用红色染料40号35（1 mg/mL）。 
  2. 将15只年轻果蝇放入含有仅添加溶剂和染色食物的CM培养基的小瓶中作为对照组，让果蝇取食培养基1天。 
  3. 用乙醚单独麻醉每组果蝇。
    1. 将每组果蝇转移至一个圆柱形玻璃容器（麻醉瓶）中，容器开口端插入一个漏斗，将小瓶倒置在漏斗上，并轻轻敲击两个容器，使果蝇落入麻醉瓶中。 
      注意：  漏斗可防止果蝇逃出麻醉瓶。
    2. 将麻醉瓶在柔软表面（如鼠标垫）上轻轻敲击使果蝇跌落，然后迅速用浸有乙醚的棉塞和纱布塞住瓶口。
    3. 等待约1分钟，直至果蝇落至瓶底且不再移动。 
      注意：麻醉时间不可过长，否则果蝇会死亡。
  4. 将麻醉后的果蝇置于体视显微镜下，比较各处理组与对照组果蝇腹部的着色情况。 

5. 繁殖力/生育力检测

  1. 针对每种 EDC 浓度，准备 3 瓶果蝇，此后称为亲代瓶，每瓶含 8 只雌性和 4 只雄性，置于 10 mL CM/EDC 培养基中；对照组则准备 6 瓶果蝇，每瓶含 8 只雌性和 4 只雄性，置于 10 mL 添加溶剂的 CM 培养基中。将果蝇置于 25 °C 培养箱中培养。 
    注意：避免幼虫在发育过程中过度拥挤，并尽量在不同处理组之间保持一致的幼虫密度。
  2. 4 天后，移除亲代果蝇，并将培养瓶重新放回培养箱中继续培养 5 天。
  3. 第 9 天傍晚，从培养瓶中移除所有新羽化的果蝇，并将培养瓶置于 18 °C 培养箱中过夜。 
    注意：此步骤必须非常小心操作，需仔细检查培养基表面。
    1. 第 10 天早晨，对每个处理组，在轻度 CO2 麻醉条件下收集处女雌蝇和年轻雄蝇，分为两组。将每组果蝇随机分成若干小群（每瓶 10 只雌蝇和 20 只雄蝇），分别放入装有新鲜对应 CM 培养基的独立培养瓶中。 
      1. 重复步骤 5.3.1，注意在收集前 8–10 小时仔细移除培养瓶中所有果蝇，并将培养瓶保持在 18 °C，直至每个 EDC 浓度组至少获得 30 只处女雌蝇和 30 只雄蝇，对照组至少获得 90 只处女雌蝇和 90 只雄蝇。 
    2. 将这些果蝇群体在 25 °C 下饲养至羽化后第 4 天，每隔两天转移至装有新鲜对应培养基的新培养瓶中。
      注意：4 天足以使果蝇发育为成熟成虫，但远未达到衰老初期。
    3. 两天后确认雌蝇培养瓶中无幼虫存在。若发现幼虫，则该批果蝇不可用，因其非处女蝇，应予以丢弃。
  4. 每个处理组每种性别取 20 只单只果蝇，建立 20 个单对交配组合，分别放入不含 EDC 的新鲜 CM-番茄培养基小瓶中，具体操作如下。 
    1. 为每个处理组分配不同的连续编号序列，以唯一标识该组，并标记相应培养瓶；例如，第 1 组（仅溶剂）编号为 1 至 20，第 2 组（EDC 浓度 x）编号为 20 至 40，依此类推。
    2. 制作一个生育力电子表格，用于记录不同编号序列，每个序列对应一个处理组。
    3. 对每种性别的各处理组果蝇，在轻度 CO2 麻醉下麻醉全部个体，并按以下方式随机转移。
      1. 将一只经溶剂处理的雌蝇转移至一个含新鲜 CM-番茄培养基但不含 EDC 的小瓶中，并加入一只经溶剂处理的雄蝇进行对照交配。 
        ​注意：番茄汁应在培养基制备过程中加入，因为深色培养基可增强与白色胚胎的对比度。
      2. 将一只经 EDC 处理的雌蝇转移至一个含新鲜 CM-番茄但不含 EDC 的小瓶中，并加入一只经溶剂处理的雄蝇，用于各处理组。
      3. 将一只经 EDC 处理的雄蝇转移至一个含新鲜 CM-番茄培养基但不含 EDC 的小瓶中，并加入一只经溶剂处理的雌蝇，用于各处理组。
    4. 将所有这些单对交配组合置于 25 °C 下饲养。
  5. 在接下来的十天内，每天将每对交配果蝇转移至不含 EDC 的新鲜 CM-番茄培养瓶中。对每一系列的重复培养瓶进行连续编号；例如 1-a、1b、1c……20a、20b、20c，并将这些编号记录在生育力电子表格中。 
  6. 每天目视检查每个培养瓶中的卵，并将卵的数量记录在生育力电子表格中。
  7. 保留每个培养瓶，当新果蝇开始羽化时，记录 10 天期间每日成年子代的数量。 从初次交配起 10 天后，移除亲代果蝇。 
    注意：若一个或两个亲代死亡，则丢弃该培养瓶；若一个或两个亲代逃逸，则分析时仅包含逃逸前的数据。
  8. 汇总每个处理组每日产卵数和每日成年子代数，以获得总繁殖力/生育力、每只果蝇在十天内的平均产卵数和成年子代数，以及总子代数与总产卵数的比值。计算各处理组数值相对于对照组的百分比差异。 
  9. 对每组果蝇进行三次独立实验，每次实验每处理组至少使用 10 只果蝇。 
  10. 进行统计分析以比较不同组之间的差异。 

6. 发育时间

注意： 在接下来的两种替代方案中，通过每日统计形成的蛹数以及每日羽化的成虫子代数来评估发育时间。

  1. 羽化实验方案1
    1. 对于每个处理组，准备10个装有年轻（<2天）、健康的果蝇的试管，每管含6只雌蝇和3只雄蝇，置于10 mL不含内分泌干扰物（EDC）的玉米粉培养基中。
    2. 让果蝇在培养基中饲养24小时，并使其交配。
    3. 为每个处理组准备10个平行试管，每管加入10 mL新鲜玉米粉培养基，并添加不同浓度的EDC或仅含溶剂的对照组。将已交配的果蝇转移至这些新试管中。 
      注意：为每个处理组分配一组不同的连续编号，以唯一标识该组，并标记相应的试管。
    4. 建立一个发育记录电子表格，用于记录不同的编号系列。
    5. 让果蝇产卵16小时，然后将亲代果蝇从试管中移除。 
      注意：亲代果蝇可通过转移到其他对应的试管中，重复使用以执行步骤6.1.5。
    6. 将试管在25 °C下培养3-4天，或直至不再形成新的蛹。每天统计每个试管中新形成的蛹的数量，并记录在发育电子表格中。为避免重复计数，使用永久性记号笔在试管外壁对每个蛹按顺序编号。 
    7. 从第9天开始，每天统计羽化的成虫数量，直至无新成虫出现，并将数据记录在发育电子表格中。
    8. 根据这些原始数据，计算平均幼虫期、平均蛹期，以及各处理组相对于对照组的百分比差异。 
    9. 对每组果蝇进行三次独立实验，每次实验每个处理组至少使用5个试管。
    10. 进行统计分析以比较不同组之间的差异。 
  2. 羽化实验方案2
    1. 将约150只年轻健康的雌蝇和约50只雄蝇饲养于收集笼（材料表）中，培养基于番茄-玉米粉培养基并添加新鲜酵母糊（3 g酵母溶于5 mL水中），此后称为产卵盘，在25 °C下饲养2天。
    2. 在这两天内，将果蝇置于黑暗、安静的环境中适应，开始收集卵之前每天更换产卵盘两次。
    3. 第三天清晨更换产卵盘。1小时后更换新的产卵盘，并丢弃此次产下的卵。 
    4. 让果蝇产卵2小时，然后更换为新的产卵盘。 
      注意：到第3天时，良好的产卵盘应在2小时内产出100-200个卵。 
    5. 为每个处理组准备一系列三个60 mm培养皿，内含添加相应浓度EDC或仅含溶剂的番茄玉米粉培养基，并将每组记录在发育时间电子表格中。也可根据需要选择使用试管代替培养皿。
    6. 在显微镜下用画笔或探针轻轻拾取卵，并将其转移至每个培养皿/试管培养基表面。为便于计数，可在产卵盘上将卵排列成每组10个，共5组，依次转移。 
      注意：根据需要重复步骤6.2.4，以获得足够的胚胎。
    7. 将所有培养皿/试管置于25 °C培养。同时将每个产卵盘也保存在25 °C，并统计总产卵数。
    8. 24-30小时后，在体视显微镜下检查每个培养皿/试管，统计白色未受精卵和黑色死亡胚胎的数量。 
    9. 从转移的50个卵中减去白色未受精卵的数量，得到每个培养皿/试管的“总胚胎数”。黑色死亡胚胎的数量可用于评估EDC在胚胎发育期间可能的毒性效应。
    10. 重复羽化实验方案1中的步骤6.1.6-6.1.10。

7. 寿命实验方案

  1. 准备20个装有培养基（每管10 mL）的离心管，每管放入8只雌蝇和4只雄蝇，并在25 °C条件下饲养。 
  2. 4天后弃去果蝇，将离心管重新放回培养箱。 
    注意：这些果蝇可用于重新启动实验，以获得其他年龄同步的果蝇群体。 
  3. 在第9天的傍晚，从离心管中移除所有新羽化的果蝇，并将离心管放回培养箱。 
    注意：少数成虫可能早在第9天就开始羽化；弃去这些果蝇有助于收集最大数量的同步化果蝇，避免因过早羽化的个体造成选择偏差。 
  4. 16–24小时后，将两种性别的成年果蝇（1日龄）转移至四个装有AM食物的250 mL瓶中，其中三组分别添加不同浓度的EDC，另一组仅添加溶剂。如有需要，可在次日收集另一批果蝇。
  5. 在25 °C条件下维持果蝇培养2–3天，使其交配。 
    注意：转移至AM食物离心管的当天记为成虫期的第一天。
  6. 两到三天后，在轻微CO2麻醉条件下按性别对每组果蝇进行分选。将每种性别的果蝇随机分为五管一组，每管20只，每种处理条件下每个性别共设置三个重复，每个重复包含五个平行管。
    注意：操作时应使用小群体果蝇，以避免因长时间暴露于CO2而导致潜在的健康问题。
  7. 准备一个寿命记录电子表格，通过从上一次转移时的存活果蝇数中减去死亡果蝇数，自动计算每次转移时的存活个体数量。
  8. 每隔3天在同一时间将果蝇转移至含有对应食物的新离心管中，并检查死亡情况。
    注意：转移过程不得使用麻醉，以免对果蝇寿命产生长期负面影响。
    1. 每次转移时，记录果蝇的年龄及死亡果蝇数量。 
      注意：存活果蝇数量将在电子表格中自动计算，但仍建议进行目视核对。在转移过程中意外逃逸或死亡的果蝇不应计入统计。需注意避免将被带入新管中的死蝇重复计数，应在电子表格中注明此情况。
    2. 重复步骤7.8和7.8.1，直至所有果蝇死亡。
  9. 针对每种处理组，绘制如图6所示的生存曲线，以展示果蝇在任一特定时间点的存活概率。 
  10. 对每种处理组的果蝇进行三次独立实验，每次实验使用100只新羽化的果蝇。 
  11. 制作一个表格，用于报告各组的平均寿命（每组所有果蝇的平均存活天数）、半数死亡时间（达到50%死亡率所需的天数）以及最大寿命（达到90%死亡率所需的最长天数）。 
  12. 计算各处理组相对于对照组的百分比差异。 
  13. 进行统计分析，比较不同处理组之间的差异。 

结果

本部分以简化的示意图形式展示上述方案中的关键步骤。由于果蝇倾向于回避难吃的化合物，因此首先需要检测所选环境内分泌干扰物（EDC）的味道。可通过将食用色素（例如红色食用染料40号）35 与添加了不同剂量所选EDC的食物或仅含溶剂的食物混合来实现。将果蝇饲喂于这些培养基后，在体视显微镜下观察其腹部着色情况，以此估算摄食量（图1）。图1 展示了一种典型的理想情况：两只成年雌蝇，一只饲喂含有选定EDC的培养基，另一只饲喂不含EDC的培养基，二者腹部均呈现相同的着色。

人们普遍认为，环境内分泌干扰物（EDCs）与天然激素类似，在极低剂量下即会产生效应，且其剂量与效应之间并不存在简单的线性关系29，较高剂量未必产生更强的效应36,37。因此，为了全面评估其影响，建议采用多种剂量进行实验，起始剂量应选择对环境或其他生物具有相关性的浓度，而非仅依赖剂量-效应关系的研究方法。无论何种情况，都应在每个使用的浓度下检测EDCs的味觉效应，以确保各处理组果蝇摄入的EDCs量具有可比性（图2）。

内分泌干扰会影响动物生理的许多重要特征，例如生育力、寿命和发育，因此这些特征可作为检测环境内分泌干扰物（EDC）的有效终点。对于上述实验方案，我们已优化其用于测量EDC对黑腹果蝇（Drosophila）这些生命特征的影响，其中首要考虑因素是必须使用年轻且健康的果蝇，并在测试前对其进行正确的操作。基于此，必须高度重视所用培养基的制备、操作和储存过程。此外，应谨慎选择适合目标EDC的溶剂，并确保其最终浓度适当（例如，二甲基亚砜[DMSO]的浓度应低于1%，乙醇的浓度应低于2%）30。

产卵力和生育力已被用于评估黑腹果蝇（D. melanogaster）的繁殖成功率。图3展示了所用实验方案的示意图。产卵力通过记录产卵总数进行实验测定，而生育力则通过记录成年子代总数来测定。考虑到成虫生命前10天的产卵量可作为整个成虫期产卵/子代数量的良好参考指标38,39，因此可采用暴露后孵化的4日龄果蝇进行为期10天的生育力和产卵力检测。应尽量使每组平行试管获得相近的数据，否则将难以判断应从分析中剔除哪一支试管。因此，建议每天检查每个重复试管，以避免出现食物干燥或液化等不良环境；从20个单对交配开始，建议至少获得10支状态良好的试管，其中双亲均存活满10天。每日收集的卵数和成年子代数应记录在表格中（如图3所示），并用于计算每只果蝇在10天内的平均产卵数和平均成年子代数。随后，可通过以下公式计算经EDC处理的果蝇相对于对照组果蝇的产卵力/生育力变化百分比：产卵力/生育力变化百分比 = [(对照组 - 处理组) / 对照组] × 100。每组至少需获得三个独立的重复实验结果。

激素在D. melanogaster一生中的发育转变过程中发挥着至关重要的作用40，因此这些生长阶段可能特别容易受到环境内分泌干扰物（EDCs）不利影响。在25 °C条件下，幼虫生长期和蛹期各持续约4天。暴露于EDCs后，这些阶段的平均持续时间可能受到影响41。基于此，已优化发育时间测定方案，以确定暴露于EDCs后，与未处理果蝇相比，幼虫向蛹、蛹向成虫转变的百分比和时间。本实验可采用两种替代性方案，二者均有效，且均基于对幼虫进行为期4天的慢性EDCs暴露处理。根据该幼虫处理方式，第一种方案未考虑胚胎的年龄，这些胚胎是在16–18小时（过夜）期间收集的。然而，这种幼虫间的年龄差异应存在于每种处理组的所有试管中，因此会增加组内变异，但不会显著影响不同处理间发育时间估计值。相反，第二种方案使用固定数量的同步早期胚胎，从而还可评估所选EDCs在胚胎发生期间的潜在效应42,43。此外，通过最小化幼虫间的年龄差异，可降低组内变异，提高检测不同处理间真实差异的能力。图4展示了羽化实验的示意图。在两种方案中，均需每天检查培养板/试管，并分别记录暴露于EDCs和未暴露于EDCs的蛹和成虫数量，如图4中的表格所示。所有形成的蛹和成虫均需计数，无论其存活与否。随后，利用这些原始数据计算幼虫到蛹、蛹到成虫的转变百分比和时间，并计算EDCs处理组果蝇相对于对照组果蝇这些数值的变化百分比。预期在EDCs暴露后，与对照组果蝇相比，整体发育进程可能出现提前或延迟。每组果蝇的选定方案需进行三次重复实验。建议在进行羽化实验方案2时，针对某一特定EDCs浓度的每一轮重复实验，均使用来自同一次产卵过程的胚胎，以确保在不同EDCs浓度下胚胎分期的可靠性和准确性。

最后，图5展示了测量寿命的关键步骤。在本方案中，所有用于分析的果蝇必须在年龄和性别上保持同步，且为成对交配状态，并维持在足够低的密度以保证自由活动。寿命实验必须分别在两种性别中进行，因为众所周知，雄性和雌性之间的寿命存在显著差异44。

为维持果蝇种群健康，需每3天更换一次食物，同时每3天评估一次死亡率。在寿命记录表格中（如图5所示），记录死亡果蝇的数量，该数值将自动从上一次传代时存活果蝇的数量中扣除。针对每种EDC浓度以及仅含溶剂的对照组，绘制累积存活率随时间变化的曲线，以获得寿命曲线。典型的存活率曲线如图6所示：在初始较长的一段时间内，存活率保持在较高水平，约60天后则呈指数式下降。经EDC处理后，处理组果蝇的存活率曲线可能受到显著影响。为确定该效应是否由所选EDC引起，建议至少进行两次，更理想的是三次独立且非同时进行的重复实验。

在上述每种实验方案中，均可能出现异常的样品管（例如，无卵或出现异常死亡的情况）；这些异常样品管可能由多种原因引起，如食物质量差或感染等，并可能显著影响测量结果的数值。应对这些异常情况的最佳方法是通过良好的实验操作来避免其发生。因此，必须强调的是，对于上述所有实验方案，都需要进行大量且细致的工作，包括准确地重复设置样品管、保持果蝇健康，以及小心处理果蝇——因为果蝇在暴露于内分泌干扰物（EDC）后可能变得脆弱，从而在操作过程中增加死亡风险。

进食实验示意图；使用EDC处理的同基因型品系测试，对照培养基，观察黑腹果蝇的反应。
图1：进食实验。 将成年果蝇置于含有添加染料的完全培养基（CM）并补充选定EDC（上图）或仅含溶剂（下图）的试管中，让其自由进食24小时。进食了添加EDC培养基（上图）或仅含溶剂培养基（下图）的两只果蝇，其腹部呈现出相似的染色情况。请点击此处查看该图的放大版本。

EDC 给药示意图，等基因品系果蝇的培养基给药，对照组，浓度标签。
图 2：EDC 给药。 通过饮食途径向果蝇施加 EDC 的示意图。来自等基因品系的成年果蝇被暴露于不同浓度的 EDC（上方）或仅溶剂（下方）。N = EDC 的参考浓度。请点击此处查看该图的放大版本。

生育力检测示意图，包含同基因型品系、EDC/对照培养基、卵发育、交配设置。
图3：生育力检测。 实验流程示意图，展示从果蝇在适宜培养基中生长、 virgin 蚊的收集，到单对交配的各个步骤。步骤1：将来自同基因型品系的成虫（10个试管，每个含8只雌性和4只雄性）转移至含有CM/EDC（上方）或仅含溶剂的CM（下方）的试管中。（注：为简化起见，图中仅显示三个试管中的一个。）步骤2：4天后，弃去成虫，让所产卵继续发育9天，直至成虫阶段。步骤3：将新羽化的成虫按性别分类，并收集到试管中（每管最多20只雄性或10只virgin雌性）。步骤4：成虫在幼虫生长阶段所用的相应培养基上继续培养4天。步骤5：对EDC处理的果蝇设置40个单对交配组合，其中20组为一只EDC处理的雄性与一只对照雌性交配，另20组为一只对照雄性与一只EDC处理的雌性交配（上方）；对对照果蝇设置20个单对交配组合，均为一只对照雄性与一只对照雌性交配（下方）。黄色培养基为添加了EDC的CM（上方）或作为对照的溶剂（下方），红色培养基为不含EDC或溶剂的番茄/CM培养基。请点击此处查看该图的放大版本。

发育时间图示；卵子沉积，含EDC/对照的培养基；追踪未受精胚胎。
图4：发育时间（羽化检测方案2）。 左侧图示为收集笼的示意图，其中放置成虫（约150只雌性和50只雄性），在黑暗条件下适应并交配，随后进行产卵（见实验方案）。两天后，将旧的滑动托盘更换为含新鲜食物的新托盘，并弃去接下来1小时内产下的卵，因其发育不同步。此后，每隔2小时在新的滑动托盘上收集一次卵，计数后转移至含有番茄/CM培养基的培养皿中，培养基中添加EDC或仅含溶剂。相关数据（总产卵数、未孵化卵数、蛹数及羽化成虫数）记录于一系列发育时间电子表格中（右侧）。请点击此处查看该图的放大版本。

寿命实验流程图；EDC组与对照组的果蝇转移及存活数据。
图5：寿命测定实验。 将同步化一天的果蝇转移至含有成虫食物（AM）的250 mL瓶中，实验组添加EDC（上图），对照组添加溶剂（下图），以供取食（示意图左侧）。2-3天后，按性别分选果蝇，并将每种性别的果蝇以每瓶20只的形式分别转移至5个试管中（试管内含起始瓶对应的培养基）。每3天将成虫转移至新的试管，直至不再需要为止（示意图中部）。右侧为每日记录数据表格的示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

生存率分析；表格和图表比较对照组与实验组在90天内的寿命。
图6：寿命曲线。 左侧为一个代表性表格，记录了在整个实验期间，每3天统计一次处理组（培养基 + EDC [0.05 mM EE2]）和对照组（培养基 + 溶剂）中死亡果蝇的数量。各组的平均寿命通过MATRIX SUM.PRODUCT计算得出；与对照组相比，处理组的平均寿命缩短。右侧显示了雄性果蝇在饲喂含EE2（0.05 mM）培养基或仅含乙醇的对照培养基后的典型生存曲线。与对照组相比，处理组果蝇的生存率曲线下降更快，并且更早出现明显的下降拐点。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

果蝇 D. melanogaster 被广泛用作体内模型系统，以研究环境内分泌干扰物（如 DBP28、BPA、4-NP、4-叔-OP29、MP30、EP31,32、DEHP33 和 EE234）的潜在影响。该研究领域选择果蝇作为模型的原因有多个。除了其作为模型系统的公认优势外，果蝇与人类在基因上具有高度保守性，因此果蝇的内分泌干扰物检测可能有助于预测或提示对人类健康的潜在影响。此外，果蝇属于无脊椎动物，而无脊椎动物在所有生态系统中均广泛存在，亟需加强保护措施以抵御内分泌干扰物的损害作用。无脊椎动物位于食物链的底层，在其生存环境中发挥着极为重要的功能。已有报道指出，释放到环境中的多种内分泌干扰物可能对多种动物物种的发育和繁殖产生有害影响。果蝇的另一优势在于其适用于实验室研究，实验中可严格控制可能影响发育、繁殖和寿命的各种因素，从而将任何观察到的变化归因于待测物质。

本文提供了在该模型系统中研究环境内分泌干扰物（EDC）暴露对激素调控的生命特征（如繁殖力/生育力、发育速率和寿命）影响的详细实验方案。我们已优化了这些方案，使其能够用于研究 EE234、BPA 和 BPAF（未发表数据）暴露的影响，但这些方案也可轻松调整以适用于其他 EDC 的研究。特别是，这些检测方法可用于研究单一 EDC 以及多种 EDC 的复合效应，从而更真实地模拟自然界中的实际情况。尽管这些实验表面上看似简单的生长检测，但必须严格按照适当的操作规范进行，以确保结果的准确性和可重复性45。众所周知，D. melanogaster 的生育力、发育时间和寿命可受到内外因素的影响。这些关键因素包括光周期、温度、湿度、营养、种群密度、遗传结构和年龄，在实施本研究所述方案时必须严格控制。为最大限度减少遗传变异带来的影响，应使用同基因型品系。该品系需在湿度可控、温度恒定的培养箱中精心培养，保持自然的 12 小时光照:12 小时黑暗光周期，温度维持在 25 °C。

除了维持受控环境外，还必须避免幼虫和成蝇的过度拥挤。已有报道指出，幼虫过度拥挤会影响其发育时间，并诱导多种基因的表达，包括热激蛋白基因或免疫相关基因，从而影响成蝇的整体适应性46。此外，成蝇的饲养密度必须足够低，以确保其自由活动，从而最大限度地减少成蝇的应激反应。同时，必须确保各处理组的果蝇摄入的内分泌干扰物（EDC）量具有可比性，需考虑化合物在不同浓度下的味道，因为果蝇倾向于回避难吃的饲料。这些实验方案的另一个重要方面是饲料质量：饲料外观应良好，无气泡、细菌污染、裂纹等47,48。此外，必须考虑待测果蝇的同步化程度、交配状态以及性别共养情况。在所有报道的实验方案中，用于平行分析的试管必须高度一致，否则将难以判断应舍弃哪一组，因此需要最大程度的关注和良好的实验操作规范。最后，在利用这些方案评估所选EDC的内分泌效应时，必须考虑其与培养基中其他可能存在的EDC（如对羟基苯甲酸甲酯或塑料试管中的双酚A）之间的潜在相互作用。为此，可考虑更换抗真菌剂、使用玻璃试管，或在有无潜在污染物的情况下分别进行预实验。

通过评估化学物质或化学混合物（如内分泌干扰物）对激素调控的生命特征（如繁殖、发育和寿命）的潜在影响，所报道的果蝇检测方法可有效用于任何化学物质或化学混合物的评估。然而，这些检测方法无法明确识别导致内分泌干扰物有害效应的内分泌作用机制。为克服这一局限性，可使用已知的参考内分泌干扰物进行相同的实验方案，这些参考物质可引发代表特定作用模式的反应，作用于昆虫内分泌系统（例如作为保幼激素或蜕皮类固醇激动剂/拮抗剂的第三代杀虫剂）22。或者，也可采用分子终点指标，对受激素调控且被视为内分泌干扰特异性和预测性生物标志物的特定基因进行分子分析34。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Orsolina Petillo提供的技术支持。作者感谢CNR的Mariarosaria Aletta博士提供的文献支持。作者感谢Gustavo Damiano Mita博士向他们介绍EDC领域。作者感谢Leica Microsystems和Pasquale Romano提供的协助。本研究由项目PON03PE_00110_1“面向组织再生与重建、种植学及牙科/眼科传感技术的纳米技术开发”，简称“SORRISO”；委托方：PO FESR 2014-2020 CAMPANIA；以及坎帕尼亚大区PO FESR 2007-2013项目“用于生物活性分子可控释放的纳米技术”资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
17α-乙炔雌二醇SigmaE4876-1G
用于Drosophila培养基的琼脂BIOSIGMA789148
双酚ASigma239658-50G
双酚AFSigma90477-100MG
玉米粉CA' BIANCA
乙醚Sigma
果蝇培养管BIOSIGMA78900825 mm × 95 mm
果蝇培养管BIOSIGMA78900929 mm × 95 mm
果蝇培养管Kaltek18722 mm × 63 mm
胚胎收集笼Crafts聚甲基丙烯酸甲酯圆筒（12.5 mm × 7 cm），一端开口，另一端由带槽的矩形底座封闭，槽口用于插入产卵专用托盘
乙醇FLUKA2860
乙醚麻醉瓶Crafts带棉塞的圆柱形玻璃容器
玻璃瓶250 mL 瓶
玻璃小瓶MicrotechST 10024平底管 100 × 24
手持式搅拌器 PimmyAriete食物料理机
速溶酵母ESKA粉末状酵母
产卵托盘Crafts聚甲基丙烯酸甲酯托盘（11 cm × 2.6 cm），用于倾注产卵培养基
对羟基苯甲酸甲酯SIGMAH5501
培养皿Falcon35101660×5
红色染料40号SIGMA16035
带LED光源的体视显微镜LeicaS4E
蔗糖HIMEDIAMB025
番茄酱Cirio

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