一种用于筛选绝经后心血管功能障碍外源性雌激素治疗的体内雌激素缺乏小鼠模型

摘要

临床上，绝经期女性雌激素缺乏可能加剧脂质代谢紊乱和动脉粥样硬化的发生。我们通过双侧背部外侧切口行双侧卵巢切除术，在apoE^-/-小鼠中建立了体内雌激素缺乏模型。该小鼠模型可用于筛选绝经后心血管功能障碍的外源性雌激素治疗方法。

摘要

与绝经前女性相比，绝经后女性患心血管疾病的风险更高。在断奶期进行双侧卵巢切除术（OVX）的雌性小鼠，其主动脉中的动脉粥样硬化病变较保留卵巢功能的雌性小鼠明显增加。然而，目前尚缺乏将雌激素缺乏与易发动脉粥样硬化状态相结合的实验小鼠模型。这一缺失尤为关键，因为临床中绝经女性的雌激素缺乏可能加剧已存在或正在进行的脂质代谢紊乱和动脉粥样硬化进程。在本研究中，我们通过在载脂蛋白E（apoE）^-/-小鼠中采用双侧背外侧切口法进行双侧卵巢切除术，建立了一种体内雌激素缺乏的小鼠模型。随后，我们比较了经口给予榛子酱形式的17β-雌二醇与拟原薯蓣皂苷（PPD）（一种植物雌激素）的作用效果。我们发现，尽管PPD在降低OVX apoE^-/-小鼠最终体重和血浆甘油三酯（TG）方面具有一定作用，但其抗动脉粥样硬化和心脏保护能力与17β-雌二醇相当。PPD是一种已被报道具有抗肿瘤特性的植物雌激素。因此，本研究所提出的方法可用于通过经口给予植物雌激素来筛选可替代传统激素替代疗法的化合物，后者已被报道可能具有潜在的促肿瘤风险。通过榛子酱进行经口给药是一种非侵入性方法，适用于广泛的患者群体。本文包含在apoE^-/-小鼠中采用双侧背外侧双切口法进行双侧卵巢切除术的逐步演示，以及通过榛子酱进行经口给予17β-雌二醇或植物雌激素替代治疗的操作步骤，并随后采用超声心动图分析血浆脂质水平和心血管功能。

引言

流行病学和临床研究表明，绝经后女性患心血管疾病的风险显著高于绝经前女性^1,2。激素替代疗法（HRT）可将心血管疾病的相对风险降低至0.37–0.79³。在心血管疾病引发的多种并发症中，动脉粥样硬化是全球最主要的死亡原因⁴。然而，目前尚缺乏能够模拟动脉粥样硬化易感状态的雌激素缺乏小鼠实验模型。本方案提供了一种体内雌激素缺乏小鼠模型，用于筛选针对绝经后心血管功能障碍的外源性雌激素治疗方法。

既往研究表明，在饲喂高胆固醇饮食的动脉粥样硬化啮齿类动物中应用双侧卵巢切除术（OVX），可模拟绝经后女性动脉粥样硬化的病理状态^5,6,7,8。建立一种可重复且便捷的、模拟绝经期女性动脉粥样硬化状态的动物模型，是外源性雌激素研究的基础。本研究在易发生动脉粥样硬化的载脂蛋白E基因敲除（apoE^-/-）小鼠中，采用双侧背外侧切口行双侧卵巢切除术^9,

方案

所有动物护理和实验方案均经中国医学科学院和北京协和医学院机构动物护理和使用委员会批准（许可编号：SYXK（北京）2013-0023）。apoE^-/-小鼠的品系来源为C57BL/6J^9,10。

1. 通过双背外侧切口在apoE^-/-小鼠中进行双侧卵巢切除术

1. 在断奶时（28日龄），使用戊巴比妥（三溴乙醇；200 mg/kg；腹腔注射）对雌性apoE^-/- C57BL/6J小鼠进行麻醉。
   注意：将32只apoE^-/-小鼠随机分为4组：假手术组（SHAM）、卵巢切除组（OVX）、卵巢切除+雌二醇治疗组（OVX/E2）和卵巢切除+人参皂苷PPD治疗组（OVX/PPD）（每组n = 8）。
2. 将动物俯卧位放置于加热垫上。在麻醉期间使用眼用润滑剂保护眼睛。
3. 维持体温在36 ± 0.5 °C范围内。皮下注射5 mg/kg体重的镇痛药卡洛芬，注射部位为小鼠颈部侧面。
4. 在髂嵴头侧剃除一块3 × 5 cm²面积的小鼠体表毛发。 在覆盖带有3 × 5 cm²开口的手术巾前，先用碘液彻底清洁剃毛区域，再用70%乙醇擦拭....

结果

本研究中采用的典型实验处理方案如图1所示。在断奶时（28日龄），对雌性apoE^-/- C57BL/6J小鼠以戊氨基三乙醇（三溴乙醇；200 mg/kg；腹腔注射）进行麻醉。小鼠通过背部1 cm切口行双侧卵巢切除术（OVX）或假手术。双侧卵巢切除术后一周，小鼠开始饲喂高胆固醇饮食（含1.25%胆固醇，不含胆酸），持续12周。在治疗的最后9周内，通过榛子酱同时经口给予17β-雌二醇（0.1 mg·kg^-1）或PPD（0.5 mg·kg^-1）。所有小鼠每周称重一次。如图2所示，评估了外源性雌激素（17β-雌二醇和PPD）在雌激素缺乏后对apoE^-/-小鼠血浆脂质水平及每周体重的影响。经过12周高胆固醇饮食后，OVX小鼠血浆总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）浓度显著升高。通过榛子酱经口给予17β-雌二醇或PPD的OVX小鼠，其血浆TC浓度显著低于假手术小鼠（

讨论

本文所述方法是一种模拟绝经后女性脂质代谢紊乱及动脉粥样硬化的鼠类模型。已有充分证据表明，绝经后女性雌激素缺乏会加剧已有或持续性高胆固醇血症的发生，并导致动脉粥样硬化病变逐渐变得更为复杂且广泛¹。为了模拟临床上易发动脉粥样硬化的状态，本研究采用了载脂蛋白E基因缺陷（apoE-deficient）小鼠，该模型是研究动脉粥样硬化发生机制时可重复性高且使用便捷的动物来源^23,24,25。如本研究所示，断奶后行卵巢切除术（OVX）的雌性apoE^-/- 小鼠相较于保留卵巢功能的雌性apoE^-/- 小鼠，其主动脉中的动脉粥样硬化病变明显增加。在该动物模型中，我们在严格控制饮食条件下，还比较了不同外源性雌激素替代疗法对动脉粥样硬化病变面积的影响。

与apoE^-/-小鼠双侧卵巢切除术的中背侧切口或中腹部.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
17β-雌二醇, >98%	Sigma-Aldrich	E8875-250MG	雌激素
一次性注射器（带25 G针头）	湖南泸州汇康发展有限公司	0.5*19TWLB	心脏出血
高胆固醇小鼠饮食	华福康生物技术	N/A	1.25% 胆固醇，0% 胆酸盐
高分辨率活体微成像系统	VisualSonics	Vevo®770	内膜-中膜厚度测量与心脏功能障碍评估
2-甲基-2-丁醇	Sigma-Aldrich	152463-250ML	阿佛丁溶液的配制
显微解剖镊，弯型，8毫米	康惠医疗设备有限公司		手术器械
微型解剖镊，直头，8 mm	康华医疗设备有限公司		手术器械
微型解剖剪，弯型/尖头，8 毫米	康惠医疗设备有限公司		手术器械
微型解剖剪，直头/尖头，8 毫米	康华医疗设备有限公司		手术器械
4-0 单股缝合线，1/2 弧，5 x 12，19 mm	上海浦东金环医疗用品有限公司	R413	组织缝合与结扎
坚果酱（能多益）	Ferrero	N/A	口服用培养基 17β雌二醇或PPD
OptiVisor 光学玻璃双目放大镜	Dohegan Optical Company Inc.	N/A	卵巢切除术中识别组织的辅助方法
pH 7.4 的磷酸盐缓冲液	SIGMA	P3813	配制1升生理盐水
Pro MultiLabel 微孔板读板仪	Tecan	Infinite M1000	血浆总胆固醇和甘油三酯测定
Pseudoprotodioscin	上海维和医药科技有限公司 & T 发展	W-0427	CAS 登记号 102115-79-7
Rimadyl，50 mg/mL	辉瑞制药有限公司	462986	卵巢切除术后镇痛
芝麻油	Sigma-Aldrich	S3547-1L	溶解17β雌二醇或PPD
Solcoseryl 眼用凝胶	Menarini, Solco Basle有限公司		麻醉期间的眼部保护
体视显微镜	MCALON	MCL-6STV	主动脉内膜区域图像
台式高速离心机	SIGMA	1-14K	血浆的制备
剪刀，微弯（14 cm）	康华医疗设备有限公司		手术器械
剪刀，直头扁平型（14 cm）	康华医疗设备有限公司		手术器械
带齿组织镊，微弯（14 cm）	康华医疗设备有限公司		手术器械
带齿镊子，直头平端（14 cm）	康华医疗设备有限公司		手术器械
三溴乙醇	Sigma-Aldrich	T48402-5G	阿佛丁溶液的配制
甘油三酯（TG）检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A110-1	血浆TG测定
总胆固醇（TC）检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A111-1	血浆总胆固醇测定