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方法文章

一种用于筛选绝经后心血管功能障碍外源性雌激素治疗的体内雌激素缺乏小鼠模型

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DOI：

10.3791/59536

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2019年8月13日

 ,  , 
1Institute of Medicinal Plant Development (IMPLAD), Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Shandong University of Traditional Chinese Medicine

本文内容

摘要

临床上，绝经期女性雌激素缺乏可能加剧脂质代谢紊乱和动脉粥样硬化的发生。我们通过双侧背部外侧切口行双侧卵巢切除术，在apoE-/-小鼠中建立了体内雌激素缺乏模型。该小鼠模型可用于筛选绝经后心血管功能障碍的外源性雌激素治疗方法。

摘要

与绝经前女性相比，绝经后女性患心血管疾病的风险更高。在断奶期进行双侧卵巢切除术（OVX）的雌性小鼠，其主动脉中的动脉粥样硬化病变较保留卵巢功能的雌性小鼠明显增加。然而，目前尚缺乏将雌激素缺乏与易发动脉粥样硬化状态相结合的实验小鼠模型。这一缺失尤为关键，因为临床中绝经女性的雌激素缺乏可能加剧已存在或正在进行的脂质代谢紊乱和动脉粥样硬化进程。在本研究中，我们通过在载脂蛋白E（apoE）-/-小鼠中采用双侧背外侧切口法进行双侧卵巢切除术，建立了一种体内雌激素缺乏的小鼠模型。随后，我们比较了经口给予榛子酱形式的17β-雌二醇与拟原薯蓣皂苷（PPD）（一种植物雌激素）的作用效果。我们发现，尽管PPD在降低OVX apoE-/-小鼠最终体重和血浆甘油三酯（TG）方面具有一定作用，但其抗动脉粥样硬化和心脏保护能力与17β-雌二醇相当。PPD是一种已被报道具有抗肿瘤特性的植物雌激素。因此，本研究所提出的方法可用于通过经口给予植物雌激素来筛选可替代传统激素替代疗法的化合物，后者已被报道可能具有潜在的促肿瘤风险。通过榛子酱进行经口给药是一种非侵入性方法，适用于广泛的患者群体。本文包含在apoE-/-小鼠中采用双侧背外侧双切口法进行双侧卵巢切除术的逐步演示，以及通过榛子酱进行经口给予17β-雌二醇或植物雌激素替代治疗的操作步骤，并随后采用超声心动图分析血浆脂质水平和心血管功能。

引言

流行病学和临床研究表明，绝经后女性患心血管疾病的风险显著高于绝经前女性1,2。激素替代疗法（HRT）可将心血管疾病的相对风险降低至0.37–0.793。在心血管疾病引发的多种并发症中，动脉粥样硬化是全球最主要的死亡原因4。然而，目前尚缺乏能够模拟动脉粥样硬化易感状态的雌激素缺乏小鼠实验模型。本方案提供了一种体内雌激素缺乏小鼠模型，用于筛选针对绝经后心血管功能障碍的外源性雌激素治疗方法。

既往研究表明，在饲喂高胆固醇饮食的动脉粥样硬化啮齿类动物中应用双侧卵巢切除术（OVX），可模拟绝经后女性动脉粥样硬化的病理状态5,6,7,8。建立一种可重复且便捷的、模拟绝经期女性动脉粥样硬化状态的动物模型，是外源性雌激素研究的基础。本研究在易发生动脉粥样硬化的载脂蛋白E基因敲除（apoE-/-）小鼠中，采用双侧背外侧切口行双侧卵巢切除术9,10。与腹部正中切口或背部正中切口相比，双侧背外侧切口操作更简便、耗时更短，且可避免严重的腹腔粘连和炎症反应。通过榛子酱（见材料表）进行经口给药是一种无创且便捷的方法，适用于长期给药模式11。缓释颗粒植入法也较为常用6。然而，植入物可能增加感染风险，尤其是在接受OVX的小鼠中。其他无创给药方式，如灌胃和饮水给药，也存在诸多缺点。灌胃通常会引起小鼠应激反应，并可能导致食管损伤。通过饮水给予激素具有诸多优势，但由于外源性雌激素不溶于水，不可避免地需要添加DMSO作为乳化剂。因此，本研究选择通过榛子酱经口给予17β-雌二醇或植物雌激素，以实现长期激素替代治疗。

近期，女性健康倡议（WHI）试验对激素替代疗法（HRT）在绝经后女性心血管系统中的有益作用提出了争议12。一方面，外源性雌激素单独使用对心血管系统具有保护作用；另一方面，当其与醋酸甲羟孕酮联合使用时，可能增加心血管事件的风险。更严重的是，HRT可能促进乳腺和子宫肿瘤的进展，这一效应显著限制了其临床应用13,14。目前，研究更多关注那些在肿瘤细胞中无有丝分裂活性的外源性雌激素在心血管保护方面的作用15,16,17。大量人类和动物研究表明，结构与雌激素相似的植物雌激素在心血管保护中可能发挥有益作用15,18。

因此，本研究的目的在于：（i）通过双侧背部外侧切口对apoE-/-小鼠进行双侧卵巢切除术，建立体内雌激素缺乏小鼠模型；（ii）通过榛子酱载体经口给予17β-雌二醇和伪原薯蓣皂苷（PPD），比较二者对心血管系统的保护作用。17β-雌二醇是一种外源性雌激素，属于女性性激素6,11,19。PPD是一种来自薯蓣属（Dioscorea）植物的甾体皂苷类植物雌激素，既往已有研究报道其具有抗肿瘤特性20。

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方案

所有动物护理和实验方案均经中国医学科学院和北京协和医学院机构动物护理和使用委员会批准（许可编号：SYXK（北京）2013-0023）。apoE-/-小鼠的品系来源为C57BL/6J9,10。

1. 通过双背外侧切口在apoE-/-小鼠中进行双侧卵巢切除术

  1. 在断奶时（28日龄），使用戊巴比妥（三溴乙醇；200 mg/kg；腹腔注射）对雌性apoE-/- C57BL/6J小鼠进行麻醉。
    注意：将32只apoE-/-小鼠随机分为4组：假手术组（SHAM）、卵巢切除组（OVX）、卵巢切除+雌二醇治疗组（OVX/E2）和卵巢切除+人参皂苷PPD治疗组（OVX/PPD）（每组n = 8）。
  2. 将动物俯卧位放置于加热垫上。在麻醉期间使用眼用润滑剂保护眼睛。
  3. 维持体温在36 ± 0.5 °C范围内。皮下注射5 mg/kg体重的镇痛药卡洛芬，注射部位为小鼠颈部侧面。
  4. 在髂嵴头侧剃除一块3 × 5 cm2面积的小鼠体表毛发。 在覆盖带有3 × 5 cm2开口的手术巾前，先用碘液彻底清洁剃毛区域，再用70%乙醇擦拭。实验过程中使用无菌器械和手套。 
  5. 使用剪刀和镊子在腹中线外侧1 cm、肋缘外侧1 cm处做一切口。
  6. 用镊子钝性分离皮下组织。
  7. 使用解剖显微镜（见材料表）识别腹腔内的白色脂肪组织。
  8. 使用显微剪刀和显微镊子穿过筋膜做0.5–1 cm切口，直至进入腹腔。
    注意：对于假手术组，直接关闭切口。使用单股缝线分别缝合肌肉层和皮肤。
  9. 当可见腹腔内白色脂肪组织时，用显微镊子夹住脂肪组织并轻轻拉出。此时可见腹腔内被脂肪组织包裹的粉红色桑葚状卵巢。
  10. 使用单股缝线结扎近端0.5–1 cm处的血管及子宫角。用显微剪刀切除卵巢，并将剩余组织放回腹腔。
    注意：卵巢切除术的主要不良症状是输尿管结扎，这会导致卵巢切除小鼠的高死亡率。通过使用解剖显微镜识别组织可避免此问题。
  11. 关闭切口。使用单股缝线分别缝合肌肉层和皮肤。
  12. 在另一侧腹中线外侧1 cm、肋缘外侧1 cm处再次使用剪刀和镊子做切口。重复上述操作（步骤1.5至1.11）。
  13. 让动物从麻醉中苏醒。术后第一天单独饲养小鼠。
  14. 在恢复期间频繁清洁或更换笼具。
  15. 术后约24小时，再次皮下注射5 mg/kg体重的镇痛药卡洛芬。

2. 通过榛子酱经口给予17β-雌二醇或PPD

  1. 将17β-雌二醇或PPD充分溶解于芝麻油中，然后将芝麻油与榛子酱混合（见材料表）。每只30 g小鼠每日剂量包含3 μg 17β-雌二醇或15 μg PPD、4 μL芝麻油和60 mg榛子酱。每只30 g小鼠的对照剂包含4 μL芝麻油和60 mg榛子酱。
    注意：每日给予的17β-雌二醇或PPD剂量依据先前研究6,11及预实验结果确定。
  2. 卵巢切除术后一周，给予小鼠高胆固醇饮食（1.25%胆固醇，0%胆酸盐），持续12周。本研究中采用的典型实验处理方案如图1所示。
  3. 在第4周开始经口给予榛子酱前5天，训练小鼠食用含约30 mg榛子酱的对照剂，每次训练2–5只小鼠，持续5天。前3天在小鼠原饲养笼内以组为单位进行训练；第4天和第5天将小鼠分别放入单独笼中进行训练，每日给药方式应模拟正式实验条件。
  4. 在最后9周内，将小鼠分别置于单独笼中，每次喂食时给予一份每日剂量的榛子酱。
    注意：OVX/E2组和OVX/PPD组小鼠通过榛子酱分别给予含17β-雌二醇（0.1 mg·kg-1）或PPD（0.5 mg·kg-1）的每日剂量；SHAM组和OVX组小鼠则给予不含激素的榛子酱。

3. 使用微型超声系统测定内膜-中膜厚度和心脏功能障碍

  1. 超声生物显微镜检查
    1. 在终止实验前1天，使用微型超声系统（见材料表）按照先前描述的方法21检测内膜-中膜厚度及心脏功能障碍（每组 n = 8 只小鼠）。
    2. 检查前，对每只小鼠腹腔注射200 mg/kg的戊巴比妥（阿佛丁，tribromoethanol）进行麻醉。
    3. 小心剃除每只小鼠颈部的毛发，并充分涂抹温热的超声耦合剂，以确保最佳成像质量。
    4. 使用30 MHz探头，聚焦于12.7 mm处，分辨率为40 μm，获取主动脉根部和升主动脉的基线超声图像。
    5. 采用II导联心电图进行实时监测。
    6. 在收缩期，于同一平面获取升主动脉、主动脉弓及头臂动脉分支的右侧胸骨旁长轴图像（图3）。
  2. 内膜-中膜厚度与最大斑块厚度的测量
    1. 灵活调整换能器与动脉部位之间的距离，以获得清晰图像。
    2. 将10秒的动态图像序列以数字方式存储，供后续在图像分析系统上离线分析。
    3. 手动选择一幅最佳的静态超声图像进行进一步测量。检查升主动脉小弯侧的图像区域。若可见升主动脉内的斑块，则测量最大斑块厚度；若未见斑块，则测量最大内膜-中膜厚度（IMT）。
    4. 测量IMT（即血管腔-内膜界面与中膜-外膜界面之间的距离）；测量最大斑块厚度（即血管腔边界与外膜层之间的最厚距离）。
    5. 取三个病变部位的数据平均值（图3）。
  3. 利用超声心动图评估心脏功能障碍
    注意：    采用微型超声系统通过超声心动图评估心脏功能，方法如前所述22。
    1. 将超声束对准心脏，靠近乳头肌区域。
    2. 实现基于心电图的千赫兹级二维可视化成像。
    3. 使用30 MHz探头对左心室进行活体经胸超声心动图检查。
    4. 从M型记录图像中以数字化方式测量与心脏功能相关的参数。
    5. 取三至五个心动周期的数据平均值（表1）。
  4. 观察者内与观察者间变异性的评估
    1. 为验证观察者内变异性，由同一名操作者在两个不同时间点对数据进行分析。
    2. 为评估观察者间变异性，由另一名操作者对数据进行分析。

4. 每周体重测量及血浆总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）测定

  1. 每周体重测量
    1. 从第 -1 周到第 12 周，每周测量一次体重。
      注意：每组 n = 8 只小鼠。
  2. 血浆制备
    1. 在通过心脏穿刺采集血液样本前，准备好注射器和试管。使用 EDTA 作为抗凝剂。向每支 2 mL 注射器中加入 10 µL 的 0.5 M EDTA，向每支 1.5 mL 试管中加入 8 µL 的 0.5 M EDTA。
    2. 在第 12 周，经过一夜禁食后，通过腹腔注射 avertin（三溴乙醇；200 mg/kg）对小鼠进行麻醉。
      注意：每组 n = 3 只小鼠。
    3. 用 70% 乙醇清洁胸部腹侧区域。
    4. 使用剪刀和镊子打开胸腔并剪开肋骨，直至暴露出跳动的心脏。
    5. 将 25 G 针头插入右心室。缓慢抽吸，直到血液开始流入注射器。
      注意：我们使用带有 25 G 针头的无菌一次性注射器（参见 材料表）。
    6. 持续以稳定均匀的压力抽吸。若未见血液流出，调整针头位置并重复抽吸。
    7. 在采集所需血量期间，保持小鼠处于深度麻醉状态。通常可采集最多 1 mL 血液。在此深度麻醉条件下，通过颈椎脱位法处死小鼠。
    8. 将血液样本用移液器转移至 1.5 mL 试管中，并充分颠倒混匀，确保 EDTA 与血液充分混合。随后立即将血液样本置于冰上。
    9. 在采血后 30 分钟内，于 4 °C 条件下以 400 × g 离心 20 分钟。
    10. 小心收集上清液。分装后将血浆样本储存在 -80 °C。
  3. 构建总胆固醇（TC）或甘油三酯（TG）含量测定的标准曲线
    1. 对于 TC 标准曲线，配制不同浓度的胆固醇标准品：0 mmol/L、0.52 mmol/L、1.03 mmol/L、2.07 mmol/L、4.14 mmol/L、6.20 mmol/L、8.27 mmol/L 和 10.34 mmol/L。测定每个胆固醇标准品的吸光度（O.D.），取其平均值作为纵坐标（Y 轴），浓度作为横坐标（X 轴），使用统计软件绘制标准曲线。
    2. 对于 TG 标准曲线，配制不同浓度的 TG 标准品：0 mmol/L、0.45 mmol/L、0.90 mmol/L、1.81 mmol/L、3.62 mmol/L、5.42 mmol/L、7.23 mmol/L 和 9.04 mmol/L。测定每个 TG 标准品的吸光度（O.D.），取其平均值作为纵坐标（Y 轴），浓度作为横坐标（X 轴），使用统计软件绘制标准曲线。
      注意：本研究采用四参数 Logistic 曲线拟合（4-pl）方法构建标准曲线。在测定血浆样本前应检查标准曲线，确保 r2 大于 0.995。
  4. 总胆固醇（TC）含量测定
    1. 将 TC 检测试剂盒中的显色试剂瓶（25 mL）标记为“TC 工作液”。
    2. 短暂涡旋混匀冷藏的样本。进行稀释：将 20 μL 血浆加入 80 μL 蒸馏水中。短暂涡旋混匀稀释液。
    3. 向 96 孔板的相应孔中加入 2.5 μL 胆固醇标准品（5.17 mmol/L）、2.5 μL 稀释后的血浆或 2.5 μL 蒸馏水（空白）。建议每个样本设三个复孔。
    4. 向所有孔中加入 250 μL 显色试剂。
    5. 在 37 °C 下孵育 10 分钟。
    6. 打开酶标仪，预热 10 分钟。
    7. 从孵育箱中取出板，于 510 nm 波长读取吸光度。确保微孔板的孔内无气泡或灰尘，板底亦无污染。
    8. 按以下公式计算 TC 浓度：
      ​TC 浓度 = 胆固醇标准品浓度 × (血浆样本吸光度 - 空白吸光度) / (胆固醇标准品吸光度 - 空白吸光度)
  5. 甘油三酯（TG）含量测定
    1. 将 TG 检测试剂盒中的显色试剂瓶（25 mL）标记为“TG 工作液”。
    2. 短暂涡旋混匀冷藏的样本。
    3. 向 96 孔板的相应孔中加入 2.5 μL TG 标准品（2.26 mmol/L）、2.5 μL 稀释后的血浆或 2.5 μL 蒸馏水（空白）。建议每个样本设三个复孔。
    4. 向所有孔中加入 250 μL 显色试剂。
    5. 在 37 °C 下孵育 10 分钟。
    6. 打开酶标仪，预热 10 分钟。
    7. 从孵育箱中取出板，于 510 nm 波长读取吸光度。
      注意：确保微孔板的孔内无气泡或灰尘，板底亦无污染。
    8. 按以下公式计算 TG 浓度：
      TG 浓度 = TG 标准品浓度 × (血浆样本吸光度 - 空白吸光度) / (TG 标准品吸光度 - 空白吸光度)

5. 主动脉粥样硬化病变的 en face 分析

  1. 主动脉的分离与切除
    1. 第12周时，在过夜禁食后，通过腹腔注射阿佛丁（三溴乙醇；200 mg/kg）麻醉小鼠。在深度麻醉状态下通过颈椎脱位处死小鼠。
      注意：我们每组使用3只小鼠。
    2. 用70%乙醇处理小鼠腹侧胸部区域。使用剪刀和镊子打开胸腔并剪断肋骨，直至暴露出跳动的心脏。
    3. 用pH 7.4的磷酸盐缓冲液（见材料表）填充50 mL注射器。将25 G针头插入左心室，并剪开右心房以避免灌注时压力过高。
    4. 以0.05–0.08 mL/min的流速进行原位灌注。用纸巾吸收流出的灌注液。
    5. 使用剪刀和镊子移除胸腔内的肋骨和肺组织。然后打开腹腔并移除内部器官，以便更清楚地观察主动脉。
    6. 用显微镊夹住心脏，用显微剪从背侧将主动脉从脊柱分离，直至髂动脉分叉处。
      注意：在肾动脉分支附近解剖时，应使用显微剪深入剪切，以避免损伤主动脉。
    7. 将心脏和主动脉在4%多聚甲醛中固定48小时。将主动脉储存于室温或2–8 °C的生理盐水中数小时。
      注意：此步骤有助于后续清洗操作。
  2. 主动脉的制备
    1. 移除心脏。在体视显微镜下，使用显微镊和显微剪小心去除主动脉外膜组织。清洗过程中使用生理盐水保持组织湿润。
      注意：操作时需小心，避免撕裂或损伤主动脉及其重要分支，如无名动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉。
    2. 保留1 mm长的无名动脉和左颈总动脉，完全切除左锁骨下动脉。
    3. 从无名动脉开始，沿主动脉外侧弯曲处纵向剪开，依次延伸至左颈总动脉和左锁骨下动脉。
    4. 沿升主动脉内侧弯曲处剪开，一直延伸至腹主动脉末端。
    5. 将主动脉平铺固定在黑色塑料板上，并滴加生理盐水防止组织干燥。
  3. 主动脉内膜区域的成像
    1. 使用体视显微镜拍摄主动脉内膜面（en face）图像。图像中需包含毫米刻度尺，用于校准测量。
    2. 将主动脉弓和胸主动脉区域置于同一图像中，腹主动脉区域另拍一张图像。图像保存为JPEG或TIFF格式。
      注意：主动脉弓区域定义为从心肌连接处至左锁骨下动脉远端3 mm处；胸主动脉区域为左锁骨下动脉远端3 mm至最后一对肋间动脉；腹主动脉区域为最后一对肋间动脉至髂动脉分叉处。
  4. 动脉粥样硬化病变的定量分析——内膜面法
    1. 校准
      1. 使用图像分析软件（见材料表）打开图像，进入空间校准界面并按照说明操作。
      2. 将参考单位设为毫米，通过将标尺对准图像中的刻度线完成校准。
    2. 测量
      1. 为每张图像设置正确的校准参数。
      2. 在标尺上测量3 mm长度。
      3. 主动脉弓和胸主动脉区域测量：从心肌连接处至左锁骨下动脉远端3 mm处勾画主动脉弓区域，从左锁骨下动脉远端3 mm至最后一对肋间动脉处勾画胸主动脉区域。在显微镜下追踪主动脉弓和胸主动脉区域的病变区域。
      4. 腹主动脉区域测量：从胸主动脉末端至髂动脉分叉处勾画腹主动脉区域。在显微镜下追踪腹主动脉区域的病变区域。
      5. 计算病变面积占主动脉内表面积的比例。
      6. 由第二位对实验分组不知情的研究人员进行独立验证，以确认定量结果的准确性。

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结果

本研究中采用的典型实验处理方案如图1所示。在断奶时（28日龄），对雌性apoE-/- C57BL/6J小鼠以戊氨基三乙醇（三溴乙醇；200 mg/kg；腹腔注射）进行麻醉。小鼠通过背部1 cm切口行双侧卵巢切除术（OVX）或假手术。双侧卵巢切除术后一周，小鼠开始饲喂高胆固醇饮食（含1.25%胆固醇，不含胆酸），持续12周。在治疗的最后9周内，通过榛子酱同时经口给予17β-雌二醇（0.1 mg·kg-1）或PPD（0.5 mg·kg-1）。所有小鼠每周称重一次。如图2所示，评估了外源性雌激素（17β-雌二醇和PPD）在雌激素缺乏后对apoE-/-小鼠血浆脂质水平及每周体重的影响。经过12周高胆固醇饮食后，OVX小鼠血浆总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）浓度显著升高。通过榛子酱经口给予17β-雌二醇或PPD的OVX小鼠，其血浆TC浓度显著低于假手术小鼠（

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讨论

本文所述方法是一种模拟绝经后女性脂质代谢紊乱及动脉粥样硬化的鼠类模型。已有充分证据表明，绝经后女性雌激素缺乏会加剧已有或持续性高胆固醇血症的发生，并导致动脉粥样硬化病变逐渐变得更为复杂且广泛1。为了模拟临床上易发动脉粥样硬化的状态，本研究采用了载脂蛋白E基因缺陷（apoE-deficient）小鼠，该模型是研究动脉粥样硬化发生机制时可重复性高且使用便捷的动物来源23,24,25。如本研究所示，断奶后行卵巢切除术（OVX）的雌性apoE-/- 小鼠相较于保留卵巢功能的雌性apoE-/- 小鼠，其主动脉中的动脉粥样硬化病变明显增加。在该动物模型中，我们在严格控制饮食条件下，还比较了不同外源性雌激素替代疗法对动脉粥样硬化病变面积的影响。

与apoE-/-小鼠双侧卵巢切除术的中背侧切口或中腹部...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（81202526，项目负责人：J.X.）、国家自然科学基金（81302769，项目负责人：B.S.）、北京市自然科学基金（47144226，项目负责人：B.S.）、中国博士后科学基金（20110490325，项目负责人：J.X.）以及教育部博士点基金（20121106120031，项目负责人：B.S.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
17β-雌二醇, >98%Sigma-AldrichE8875-250MG雌激素
一次性注射器（带25 G针头）湖南泸州汇康发展有限公司0.5*19TWLB心脏出血
高胆固醇小鼠饮食华福康生物技术N/A1.25% 胆固醇，0% 胆酸盐
高分辨率活体微成像系统VisualSonicsVevo®770内膜-中膜厚度测量与心脏功能障碍评估
2-甲基-2-丁醇Sigma-Aldrich152463-250ML阿佛丁溶液的配制
显微解剖镊，弯型，8毫米康惠医疗设备有限公司手术器械
微型解剖镊，直头，8 mm康华医疗设备有限公司手术器械
微型解剖剪，弯型/尖头，8 毫米康惠医疗设备有限公司手术器械
微型解剖剪，直头/尖头，8 毫米康华医疗设备有限公司手术器械
4-0 单股缝合线，1/2 弧，5 x 12，19 mm上海浦东金环医疗用品有限公司R413组织缝合与结扎
坚果酱（能多益）FerreroN/A口服用培养基 17β雌二醇或PPD
OptiVisor 光学玻璃双目放大镜Dohegan Optical Company Inc.N/A卵巢切除术中识别组织的辅助方法
pH 7.4 的磷酸盐缓冲液SIGMAP3813配制1升生理盐水
Pro MultiLabel 微孔板读板仪TecanInfinite M1000血浆总胆固醇和甘油三酯测定
Pseudoprotodioscin上海维和医药科技有限公司 & T 发展W-0427CAS 登记号 102115-79-7
Rimadyl，50 mg/mL辉瑞制药有限公司462986卵巢切除术后镇痛
芝麻油Sigma-AldrichS3547-1L溶解17β雌二醇或PPD
Solcoseryl 眼用凝胶Menarini, Solco Basle有限公司麻醉期间的眼部保护
体视显微镜MCALONMCL-6STV主动脉内膜区域图像
台式高速离心机SIGMA1-14K血浆的制备
剪刀，微弯（14 cm）康华医疗设备有限公司手术器械
剪刀，直头扁平型（14 cm）康华医疗设备有限公司手术器械
带齿组织镊，微弯（14 cm）康华医疗设备有限公司手术器械
带齿镊子，直头平端（14 cm）康华医疗设备有限公司手术器械
三溴乙醇Sigma-AldrichT48402-5G阿佛丁溶液的配制
甘油三酯（TG）检测试剂盒南京建成生物工程研究所A110-1血浆TG测定
总胆固醇（TC）检测试剂盒南京建成生物工程研究所A111-1血浆总胆固醇测定

参考文献

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