该方法为研究复杂宿主来源中外源性脂肪酸掺入细菌膜（特别是Staphylococcus aureus）提供了框架。为此，本文描述了从鸡蛋蛋黄中富集脂蛋白颗粒的方案，以及利用质谱技术对细菌磷脂进行脂肪酸谱分析的方法。
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本文内容
摘要
摘要
Staphylococcus aureus 及其他革兰氏阳性病原菌可将环境中存在的脂肪酸整合到膜磷脂中。在感染过程中，外源性脂肪酸主要存在于宿主的脂蛋白颗粒内。目前尚不明确宿主脂肪酸的具体储存库，以及细菌从脂蛋白颗粒中获取脂肪酸的作用机制。本研究中，我们描述了从鸡蛋蛋黄中富集低密度脂蛋白（LDL）颗粒的实验方案，并验证LDL是否可作为S. aureus的脂肪酸来源。该方法利用非偏向性脂质组学分析和鸡源LDL——一种研究LDL与细菌相互作用的有效且经济的模型系统。通过高分辨率/精确质量质谱和串联质谱技术，分析S. aureus从LDL中整合外源性脂肪酸的情况，从而表征细菌膜的脂肪酸组成，并非偏向性地鉴定细菌膜脂质在暴露于LDL后所产生的新型脂肪酸组合。这些先进的质谱技术能够揭示被整合至磷脂中的特定外源性脂肪酸，为研究脂肪酸的摄取提供了前所未有的视角。本文所述方法可推广应用于其他细菌病原体及复杂脂肪酸不同来源的研究。
引言
耐甲氧西林S. aureus（MRSA）是医疗机构相关感染的首要致病原因，其伴随的抗生素耐药性构成了重大的临床挑战1,2,3。因此，开发新型治疗策略具有高度优先性。针对革兰氏阳性病原菌的一种有前景的治疗策略是抑制脂肪酸合成，该过程是膜磷脂生成所必需的，在S. aureus中包括磷脂酰甘油（PG）、赖氨酰-PG和心磷脂4。在细菌中，脂肪酸的生成通过脂肪酸合成II途径（FASII）进行5，该途径与真核生物中的对应途径存在显著差异，使得FASII成为抗生素开发的有吸引力靶点5,6。FASII抑制剂主要靶向FabI，即脂肪酸碳链延长所必需的一种酶7。FabI抑制剂三氯生被广泛用于消费品和医疗用品中8,9。多家制药公司正在开发其他FabI抑制剂，用于治疗S. aureus感染10
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方案
注意：以下从鸡蛋蛋黄中富集低密度脂蛋白（LDL）颗粒的实验方案源自 Moussa 等人 2002 年的研究33。
1. 准备鸡蛋黄以富集低密度脂蛋白颗粒
- 用70%乙醇溶液清洗两个大型鸡蛋的蛋壳以进行消毒，并使其自然风干。
- 使用70%乙醇溶液对蛋清分离器进行消毒，并使其自然风干。将蛋清分离器固定在中等大小烧杯的边缘。
- 将每个鸡蛋单独打入蛋清分离器中，使蛋清流入烧杯，完整的蛋黄则被分离器保留。
- 用30 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗蛋黄两次，以去除残留的蛋清。
- 将蛋黄轻轻放置在滤纸上。
- 用无菌移液器吸头刺破卵黄膜，将膜内内容物排入无菌的50 mL锥形离心管中。弃去卵黄膜和滤纸。
2. 从鸡蛋蛋黄中分离含低密度脂蛋白（LDL）的血浆组分
- 向蛋黄中加入约两倍体积的 0.17 M NaCl（pH 7.0），并剧烈混合。然后在 4 °C 下搅拌该溶液 60 分钟。
- 在 10 °C 下以 10,000 x g 离心蛋黄稀释液 45 分钟。将血浆组分（上清液）从颗粒组分（沉淀）中分离，转移至无菌的 50 mL 锥形管中。
- 重复步骤 2.2。
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结果
从鸡蛋蛋黄中富集低密度脂蛋白（LDL）的实验方案如图1所示。该过程首先用生理盐水稀释全蛋黄，将蛋黄中的固体部分（称为颗粒）与含有LDL的可溶性或血浆组分分离（图1）33。通过沉淀分子量约为30–40 kDa的β-卵黄蛋白，可进一步富集血浆组分中的LDL含量（图2）33。在140、80、65、60和15 kDa处出现的蛋白条带与LDL的载脂蛋白相对应（图2）33,39。三氯生可在无外源脂肪酸的培养基中抑制S. aureus的生长32。我们先前已证明，在培养体系中添.......
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讨论
S. aureus 可将外源性脂肪酸整合到其膜磷脂中27,32,43。利用外源性脂肪酸进行磷脂合成可绕过FASII的抑制作用，但也会改变膜的生物物理特性27,32,44。尽管外源性脂肪酸整合入革兰氏阳性病原菌磷脂的过程已有充分记载，但关于宿主脂肪酸储存库的具体身份，以及外源性脂肪酸整合后对金黄色葡萄球菌三种主要磷脂类型的结构改变，目前仍存在研究空白。本文描述了可用于以下目的的实验方案：i）从鸡蛋蛋黄中富集低密度脂蛋白（LDL）颗粒，作为脂肪酸来源；ii）测定外源性脂肪酸对S. aureus生长的影响；以及iii）采用非偏倚的脂质组学分析方法，监测外源性脂肪酸在S. aureus膜磷脂中的整合情况。本研究提供的先进质.......
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致谢
我们感谢Hammer实验室的成员对本文稿的批判性评价以及对本工作的支持。科罗拉多大学医学院的Alex Horswill博士惠赠菌株AH1263。密歇根州立大学Chris Waters实验室提供了试剂。本工作由美国心脏协会资助项目16SDG30170026及密歇根州立大学启动资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 硫酸铵 | Fisher | BP212R-1 | ≥99.5% 纯度 |
| 细胞培养箱 | Thermo | MaxQ 6000 | |
| 离心机 | Thermo | 75-217-420 | Sorvall Legen XTR，转子 F14-6x250 LE |
| Costar 检测板 | Corning | 3788 | 96 孔 |
| 滤纸 | Schleicher & Schuell | 597 | |
| 大型鸡卵 | N/A | N/A | 普通市售鸡蛋 |
| 微孔板分光光度计 | BioTek | Epoch 2 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| S. aureus 菌株 AH1263 | N/A | N/A | 由科罗拉多大学 Alex Horswill 提供 |
| 透析管 | Pierce | 68700 | 截留分子量 7,000 |
| 胰蛋白胨 | Becton, Dickison and Company | 211705 | |
| 0.5 mm 氧化锆珠 | Next Advance | ZROB05 | |
| Bullet Blender 匀浆仪 | Next Advance | BBX24B | |
| 甲醇（LC-MS 级） | Fisher | A4561 | |
| 氯仿（试剂级） | Fisher | MCX10559 | |
| 异丙醇（LC-MS 级） | Fisher | A4611 | |
| 二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱 | Avanti Polar Lipids | 850345C-25mg | |
| 碳酸氢铵 | Sigma | 9830 | ≥99.5% 纯度 |
| 甲酸铵 | Sigma | 70221-25G-F | |
| Xcalibur 软件 | Thermo Scientific | OPTON-30801 | |
| LTQ-Orbitrap Velos 质谱仪 | Thermo Scientific | 高分辨率/精确质量质谱 | |
| Agilent 1260 毛细管高效液相色谱仪 | Agilent | ||
| SpeedVac 真空浓缩仪 | Thermo Scientific |
参考文献
- Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
- Noskin, G. A., et al.
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