本方案描述了一种在成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中进行的体内吞噬作用检测方法，用于定量分析吞噬细胞对微生物感染的识别与清除能力。
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本文内容
摘要
摘要
在所有动物中，先天免疫为抵御多种病原体提供了迅速而强大的防御。体液免疫和细胞免疫反应是先天免疫的两个主要分支，调控这些反应的许多因子在无脊椎动物与哺乳动物之间具有进化上的保守性。吞噬作用是细胞先天免疫的核心组成部分，由免疫系统中的特化血细胞执行。果蝇， 黑腹果蝇，已成为研究吞噬作用在整体动物中分子机制和生理影响的有力遗传模型。本文展示了一种基于注射的活体吞噬功能检测方法，用于定量分析颗粒物的摄取与降解过程 黑腹果蝇 血细胞，血细胞。该实验方法使研究人员能够精确控制颗粒浓度和剂量，从而在短时间内获得高度可重复的结果。该实验具有定量性、操作简便，并可用于筛选影响病原体识别、摄取和清除的宿主因子。
引言
先天免疫防御构成了抵御病原微生物的第一道防线。这些免疫反应在功能上可分为体液先天免疫和细胞先天免疫，二者均由种系编码的模式识别受体（PRRs）介导，这些受体可识别病原体相关分子模式（PAMPs）。1许多先天免疫的信号通路和效应机制在哺乳动物和无脊椎动物（如线虫）中是保守的。 秀丽隐杆线虫 和果蝇， 黑腹果蝇2果蝇已成为研究宿主抵御传染性微生物的有力模型系统3. 果蝇 在遗传上易于操作，可在实验室中以较低成本轻松饲养，且世代周期短。此外，果蝇对多种微生物具有高效的防御能力，可用于研究宿主对病毒、细菌、真菌或寄生性病原体的免疫反应。
Drosophila 免疫学家历来采用 正向遗传筛选、昆虫细胞系的全基因组RNA干扰（RNAi）筛选以及已有的突变果蝇品系来研究先天免疫，从而鉴定并表征了多个在进化上保守的体液免疫通路4,5,6,7,8。体....
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方案
1. 准备用于注射的荧光素颗粒
- 通过加入 990 µL 无菌 1x PBS 和 10 µL 50 mM 叠氮化钠，将 10 mg 商品化的、用荧光素标记的灭活细菌颗粒（参见材料表）重悬至 10 mg/mL 的储存浓度。涡旋混匀。
- 分装为每份 8 µL 的单次使用量至 0.2 mL 离心管中，并置于避光盒中 4 °C 保存，以尽量减少光敏感性。
注意：叠氮化钠防腐剂为可选，若将 10 mg/mL 储存液用 1 mL 无菌 1x PBS 配制后分装并储存于 -20 °C，则可省略。
- 分装为每份 8 µL 的单次使用量至 0.2 mL 离心管中，并置于避光盒中 4 °C 保存，以尽量减少光敏感性。
- 通过混合 500 µL 注射器过滤的绿色食用色素与 9.5 mL 无菌 1x PBS，配制 10 mL 的 5% 食用色素溶液（溶于 1x PBS）。
- 注射前洗涤颗粒以去除叠氮化钠。在 1.7 mL 离心管中混合 42 µL 无菌 1x PBS 与 8 µL 10 mg/mL 颗粒溶液，室温下最大转速离心 2.5 分钟。
- 弃去上清液，加入 50 µL 1x PBS，室温下最大转速离心 2.5 分钟。
- 重复步骤 1.3 和 1.3.1 两次，共洗涤 3 次。
- 最后一次洗涤后，弃去上清液，并将颗粒重悬于 50 µL 含 5% 食用色素的 1x PBS 溶液中，终浓度为 1.6 mg/mL。
- 用铝箔纸包裹离心管以避....
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结果
使用荧光素标记颗粒进行体内吞噬作用检测的示意图如图1A所示。将果蝇腹面朝下固定在一段电工胶带上，其腹部前两节（背血管所在位置）清晰可见（图1B）。实验误差的主要来源出现在注射和成像步骤（图1C）。若使用同一根针连续注射多只果蝇，针头可能因果蝇组织或颗粒残留而堵塞（图1C左上图）。由于Drosophila在GFP光下具有自发荧光，使用堵塞针头注射的果蝇会呈现微弱荧光，但缺乏血细胞内化颗粒所特有的清晰、点状荧光信号。另一个潜在的实验误差来源出现在台盼蓝注射过程中。在注射荧光标记颗粒30分钟后，果蝇接受第二次台盼蓝注射，以淬灭未被吞噬的细胞外颗粒的荧光。每只果蝇的相对荧光强度通过将背血管区域的荧光强度除以腹部相邻同等大小区域的荧光强度来计算。若果蝇未接受足量的台盼蓝注射，其整个腹部将强烈荧光（
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讨论
可购买的荧光标记颗粒可用于评估一般情况下的吞噬作用（0.2 µm 羧基修饰微球）或微生物的吞噬作用（经荧光标记的热灭活或化学灭活的细菌或酵母）。为评估吞噬体成熟过程，研究人员可选择带有 pH 敏感性染料的颗粒，该染料在 pH 由中性降至酸性时发出荧光，类似于在吞噬溶酶体中的情况。或者，为研究吞噬作用的初始步骤——病原体识别与摄取，研究人员应选择带有可在细胞内外均发出荧光的荧光标签的颗粒。
严格控制实验条件是确保体内吞噬作用检测能够以可重复方式进行的关键。首先，Drosophila 会发生细胞免疫衰老32，因此实验中所用果蝇应年龄匹配，最佳年龄范围为 4–7 天。其次，注射之间的时间间隔应保持一致。吞噬作用发生迅速，在宿主细胞感知到微生物后的数分钟内即开始14。在接下来的一个小时内，吞噬体逐渐成熟，导致吞噬体酸化并最终摧毁被内化的微生物。设定固定的注射间隔时间可减少实验变异，便于不同品系之间以及不同日期进行的实验之间的比较。我们建议使用荧光素标记.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Beth Gonzalez 博士和 Aprajita Garg 博士在开展体内吞噬实验过程中提供的支持。本研究由美国国家科学基金会马里兰大学 ADVANCE 种子基金以及马里兰大学 NIH T32 培训基金——细胞与分子生物学（CMB）和宿主-病原体相互作用（HPI）项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2μm 红色荧光羧酸盐修饰 FluoSpheres | Invitrogen | F8810 | 荧光标记的乳胶微球用于检测吞噬细胞的总体吞噬能力。（~580/~605 nm）用含5%染料的PBS溶液将微球稀释20倍后注射。 |
| 5430-10 PicoNozzle 试剂盒 | World Precision Instruments | 5430-10 | 1.0毫米移液器支架 |
| 大肠杆菌（E. coli）K-12 菌株）BioParticles，Alexa Fluor 488 偶联物 | Invitrogen | E13231 | 已杀死 E. coli 用 Alexa Fluor 488 标记，用于检测吞噬细胞对革兰氏阴性菌的识别与摄取。（~495/~519 nm） |
| 大肠杆菌（E. coli）K-12 菌株 BioParticles，Alexa Fluor 594 标记物 | Invitrogen | E23370 | 已杀死 E. coli 用 Alexa Fluor 594 标记，用于检测吞噬细胞对革兰氏阴性菌的识别与摄取。（~590/~617 nm） |
| 大肠杆菌（E. coli）K-12 菌株 生物颗粒，荧光素偶联物 | Invitrogen | E2861 | 已杀死 E. coli 用FITC（荧光素）标记，用于检测吞噬细胞对革兰氏阴性菌的识别与摄取。（~494/~518 nm） |
| 大肠杆菌（E. coli）K-12 菌株）生物颗粒，德克萨斯红偶联物 | Invitrogen | E2863 | 已杀死 E. coli 用Texas Red标记，用于检测吞噬细胞对革兰氏阴性菌的识别与摄取。（~595/~615 nm） |
| 大肠杆菌（E. coli）K-12 菌株）生物颗粒，德克萨斯红标记物 | Invitrogen | E2863 | 已杀死 E. coli 用Texas Red标记，用于检测吞噬细胞对革兰氏阴性菌的识别与摄取。（~595/~615 nm） |
| 针状移液器拉制仪 | David Kopf Instruments | Model 725 | |
| pHrodo Red E. coli 用于吞噬作用的生物颗粒偶联物 | Invitrogen | P35361 | 已杀死 E. coli 用 pHrodo Red 标记。用于检测吞噬细胞对革兰氏阴性菌的识别、摄取及吞噬体成熟。（~560/~585 nm）。无需用台盼蓝淬灭。 |
| pHrodo Red S. aureus 用于吞噬作用的生物颗粒偶联物 | Invitrogen | A10010 | 已杀死 S. aureus 用 pHrodo Red 标记。用于检测吞噬细胞对革兰氏阳性菌的识别、摄取及吞噬体成熟。（~560/~585 nm）。无需用台盼蓝淬灭。 |
| Pneumatic PicoPump PV820 | 世界精密仪器公司 | SYS-PV820 | 世界精密仪器公司生产的气动PicoPump PV820利用差压在注射间期将液体保持在玻璃针头内。用户通过手动控制短暂的气体压力脉冲来排出液体 – 可实现亚纳升级别液体的输送。输送液体的量主要取决于两个变量 – 玻璃针开口的大小以及注射压力作用的时间。将仪器设置为100毫秒 “定时” 模式。 |
| S. aureus （不含蛋白A的木材应变）BioParticles，Alexa Fluor 488标记 | Invitrogen | S23371 | 已杀死 S. aureus 用 Alexa Fluor 488 标记，用于检测吞噬细胞对革兰氏阳性菌的识别与摄取。（~495/~519 nm） |
| S. aureus （不含蛋白A的木材应变）生物颗粒，Alexa Fluor 594标记物 | Invitrogen | S23372 | 已杀死 S. aureus 用 Alexa Fluor 594 标记，用于检测吞噬细胞对革兰氏阳性菌的识别与摄取。（~590/~617 nm） |
| S. aureus （不含蛋白A的木霉菌）生物颗粒，荧光素偶联物 | Invitrogen | E2851 | 已杀死 S. aureus 用FITC（荧光素）标记，用于检测吞噬细胞对革兰氏阳性菌的识别与摄取。（~494/~518 nm） |
| 薄壁玻璃毛细管 | World Precision Instruments | TW100F-3 | 用于注射的针头。OD = 1.0 mm |
| 台盼蓝溶液（0.4%） | Sigma | T8154 | 用于淬灭荧光素、Alexa Fluor 或 Texas Red 标记颗粒的细胞外荧光。 |
| 蔡司立体显微镜（Discovery.V8） | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | 用于成像果蝇的倒置荧光显微镜。使用数字相机（示例：AxioCam HC 相机）及配套软件（示例：AxioVision 4.7 软件）拍摄图像。 |
| Zymosan A（酿酒酵母BioParticles，Alexa Fluor 488 标记物 | Invitrogen | Z23373 | 用 Alexa Fluor 488 标记的灭活酵母。用于检测吞噬细胞对酵母的识别与摄取。（~495/~519 nm） |
| Zymosan A（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）生物颗粒，Alexa Fluor 594 标记物 | Invitrogen | Z23374 | 用 Alexa Fluor 594 标记的灭活酵母。用于检测吞噬细胞对酵母的识别与摄取。（~590/~617 nm） |
| Zymosan A（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）) 生物颗粒，荧光素偶联物 | Invitrogen | Z2841 | 用FITC（荧光素）标记的灭活酵母。用于检测吞噬细胞对酵母的识别与摄取。（~494/~518 nm） |
| Zymosan A（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）) BioParticles，德克萨斯红 | Invitrogen | Z2843 | 用Texas Red标记的灭活酵母。用于检测吞噬细胞对酵母的识别与摄取。（~595/~615 nm） |
参考文献
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Kim, D. Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).
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