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方法文章

利用体内吞噬作用检测法评估果蝇Drosophila melanogaster的细胞免疫反应

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DOI：

10.3791/59543

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2019年4月10日

 , 
1Department of Biology, University of Maryland, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland, 3Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

本文内容

摘要

本方案描述了一种在成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中进行的体内吞噬作用检测方法，用于定量分析吞噬细胞对微生物感染的识别与清除能力。

摘要

在所有动物中，先天免疫为抵御多种病原体提供了迅速而强大的防御。体液免疫和细胞免疫反应是先天免疫的两个主要分支，调控这些反应的许多因子在无脊椎动物与哺乳动物之间具有进化上的保守性。吞噬作用是细胞先天免疫的核心组成部分，由免疫系统中的特化血细胞执行。果蝇， 黑腹果蝇，已成为研究吞噬作用在整体动物中分子机制和生理影响的有力遗传模型。本文展示了一种基于注射的活体吞噬功能检测方法，用于定量分析颗粒物的摄取与降解过程 黑腹果蝇 血细胞，血细胞。该实验方法使研究人员能够精确控制颗粒浓度和剂量，从而在短时间内获得高度可重复的结果。该实验具有定量性、操作简便，并可用于筛选影响病原体识别、摄取和清除的宿主因子。

引言

先天免疫防御构成了抵御病原微生物的第一道防线。这些免疫反应在功能上可分为体液先天免疫和细胞先天免疫，二者均由种系编码的模式识别受体（PRRs）介导，这些受体可识别病原体相关分子模式（PAMPs）。1许多先天免疫的信号通路和效应机制在哺乳动物和无脊椎动物（如线虫）中是保守的。 秀丽隐杆线虫 和果蝇， 黑腹果蝇2果蝇已成为研究宿主抵御传染性微生物的有力模型系统3. 果蝇 在遗传上易于操作，可在实验室中以较低成本轻松饲养，且世代周期短。此外，果蝇对多种微生物具有高效的防御能力，可用于研究宿主对病毒、细菌、真菌或寄生性病原体的免疫反应。

Drosophila 免疫学家历来采用 正向遗传筛选、昆虫细胞系的全基因组RNA干扰（RNAi）筛选以及已有的突变果蝇品系来研究先天免疫，从而鉴定并表征了多个在进化上保守的体液免疫通路4,5,6,7,8。体液性先天免疫反应可以说是果蝇中研究最为清楚的免疫防御机制。感染发生后，体液免疫反应会促使抗菌肽（AMP）分子的生成并系统性释放到血淋巴中，即昆虫的血液类似物。AMP由高度保守的Toll和Imd信号通路产生。Toll通路与哺乳动物的TLR/IL-1R受体信号通路同源，Imd通路则与哺乳动物的肿瘤坏死因子-α信号通路同源。在Drosophila中，Toll信号由革兰氏阳性菌、真菌以及Drosophila X virus6,9,10诱导，而Imd信号则由革兰氏阴性菌诱导11,12。

细胞免疫，包括对入侵病原体的包裹、黑化和吞噬作用， 由一种称为血细胞的特化血细胞完成13果蝇的血细胞分为三类：晶体细胞、片状细胞和浆细胞13. 晶细胞占幼虫循环血细胞的5%，可释放前酚氧化酶（proPO），导致病原体及伤口部位宿主组织的黑色素化。通常在健康胚胎或幼虫中不存在的类膜细胞是一类具有黏附性的细胞，能够包裹外来物体。当进入蛹化阶段或寄生性黄蜂将卵产入幼虫体内时，会诱导类膜细胞的产生。吞噬性浆细胞占幼虫循环血细胞的95%，并构成成虫中所有其余的血细胞，其在发育过程中的组织重塑中发挥作用，尤其作为主要效应细胞参与免疫应答。 果蝇 细胞免疫

吞噬作用是先天免疫防御中迅速且至关重要的防线；突破宿主上皮屏障的微生物会迅速被吞噬性血细胞吞噬并清除（关于吞噬作用细胞生物学的全面综述，请参见参考文献14）。该过程始于血细胞表面由种系编码的模式识别受体（PRRs）识别微生物的病原体相关分子模式（PAMPs）。一旦与靶标结合，PRRs即启动信号级联反应，通过肌动蛋白细胞骨架的重塑形成伪足。伪足包围微生物，并将其吞噬并内化为一种新生的细胞器——吞噬体。随着吞噬体向血细胞内部转运，并通过与溶酶体的一系列相互作用而酸化，吞噬体经历吞噬体成熟过程，从而导致微生物被破坏。在哺乳动物原代细胞中进行的体外和细胞生物学研究，对于鉴定和表征调控吞噬作用的因素（如哺乳动物Fc-γ受体和C3b受体）起到了关键作用15,16。然而，在哺乳动物系统中开展大规模筛选或体内研究的能力仍然有限。

本文介绍了一种用于成年果蝇体内吞噬作用的活体检测方法，该方法基于 David Schneider 实验室于 2000 年首次建立的实验流程。17施耐德实验室发现，沿腹部背血管聚集的贴壁型血细胞能够高效吞噬聚苯乙烯微球和细菌。为了观察吞噬作用，需向果蝇体内注射荧光标记的颗粒（例如 E. coli 标记有异硫氰酸荧光素（大肠杆菌-FITC标记的颗粒），孵育30分钟以使血细胞有足够时间吞噬颗粒，随后注入台盼蓝，以淬灭在孵育期间未被吞噬的颗粒的荧光。然后使用倒置荧光显微镜对果蝇背血管进行成像。该开创性论文通过一个相对简单的实验表明：血细胞能够吞噬细菌和乳胶微珠；预先注射乳胶微珠可抑制细菌的吞噬作用；缺乏细胞和体液免疫应答的果蝇即使面对通常无害的微生物也表现出高度易感性 大肠杆菌本报告中所述的检测方法基于Schneider实验室的研究，通过测量背血管相关血细胞吞噬的颗粒的荧光强度，来定量体内吞噬作用。

与哺乳动物系统中采用的方法类似， 果蝇 遗传学家最初使用全基因组范围的 体外RNAi筛选以鉴定细胞免疫反应所需的基因18,19,20,21,22,23然而，成年体内吞噬作用检测技术的发展使得后续实验能够直接在完整动物体内快速开展，从而让研究人员得以验证体外研究中所鉴定出的因子在生物学上的作用。跨膜受体 Eater 即是如此，它最初是在利用 S2 细胞进行的 RNAi 筛选中被鉴定为一种细菌受体24 随后被证明可介导 大肠杆菌 (E. coli)，粪肠球菌， 和 Staphylococcus aureus (S. aureus成人在吞噬作用中的表现25.

我们的实验室在正向遗传筛选和全基因组关联研究中采用了体内吞噬作用检测方法（使用 果蝇 遗传参考面板（DGRP）以鉴定调控成体血细胞吞噬作用的新基因。这些研究促成了对受体PGRP-SC1A和PGRP-SA的表征26细胞内囊泡运输蛋白 Rab1427，谷氨酸转运蛋白 Polyphemus28，以及RNA结合蛋白Fox-129.

我们预计，未来结合体内吞噬作用的筛选将有助于鉴定出更多对细胞免疫反应重要的基因 果蝇使用全基因组测序的近交系（如 DGRP 或）进行筛选 果蝇 合成人种群资源（DSPR）可用于鉴定影响吞噬作用或血细胞发育的自然变异。此外，该技术也可应用于其他物种 果蝇 或用于筛选新的社区资源，例如包含 250 个样本的集合 果蝇 由国家维持的物种 果蝇 康奈尔大学国家果蝇物种中心（NDSSC）。这些实验可使用 commercially available 的荧光标记细菌或真菌细胞壁生物颗粒进行，也可使用多种表达荧光标记物的细菌或真菌物种开展。

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方案

1. 准备用于注射的荧光素颗粒

  1. 通过加入 990 µL 无菌 1x PBS 和 10 µL 50 mM 叠氮化钠，将 10 mg 商品化的、用荧光素标记的灭活细菌颗粒（参见材料表）重悬至 10 mg/mL 的储存浓度。涡旋混匀。
    1. 分装为每份 8 µL 的单次使用量至 0.2 mL 离心管中，并置于避光盒中 4 °C 保存，以尽量减少光敏感性。
      注意：叠氮化钠防腐剂为可选，若将 10 mg/mL 储存液用 1 mL 无菌 1x PBS 配制后分装并储存于 -20 °C，则可省略。
  2. 通过混合 500 µL 注射器过滤的绿色食用色素与 9.5 mL 无菌 1x PBS，配制 10 mL 的 5% 食用色素溶液（溶于 1x PBS）。
  3. 注射前洗涤颗粒以去除叠氮化钠。在 1.7 mL 离心管中混合 42 µL 无菌 1x PBS 与 8 µL 10 mg/mL 颗粒溶液，室温下最大转速离心 2.5 分钟。
    1. 弃去上清液，加入 50 µL 1x PBS，室温下最大转速离心 2.5 分钟。
    2. 重复步骤 1.3 和 1.3.1 两次，共洗涤 3 次。
    3. 最后一次洗涤后，弃去上清液，并将颗粒重悬于 50 µL 含 5% 食用色素的 1x PBS 溶液中，终浓度为 1.6 mg/mL。
    4. 用铝箔纸包裹离心管以避光。4 °C 保存，1 周后弃用。

2. 准备注射站和果蝇

  1. 准备注射垫。若需同时注射最多4种基因型的果蝇，使用实验室胶带将一个矩形的 CO2 果蝇操作垫划分为4个区域。在显微镜附近的实验台上，标记出放置培养管的区域，每个区域对应操作垫的一个角，用于存放已排列在垫上的果蝇。
  2. 准备用于注射的年龄匹配的果蝇（4–7日龄）。对每种待测品系，将5只雄蝇和5只雌蝇转移至装有已配制果蝇培养基的新鲜、标记好的培养管中，并在25 °C条件下培养。
  3. 准备气动注射仪（见材料表），将仪器设置为定时模式，设定时间为100 ms（通过短时气体压力脉冲排出液体，实现亚纳升级别体积的注射）。
  4. 准备显微镜载玻片。裁剪1.5英寸长的电工胶带，将其粘性面向外折叠成环状，然后贴至已标记的显微镜载玻片上。

3. 准备玻璃毛细针

  1. 使用拉针仪拉制玻璃针（薄壁玻璃毛细管）。
    1. 用显微镜下的千分尺夹持针头，并使用#5精细不锈钢镊子折断针尖。100 µm的针尖足以刺穿果蝇的表皮，同时尽量减少损伤。
    2. 测量将注入每只果蝇体内的液体体积。用含5%食用色素的无菌1×PBS溶液填充针头，并将液体排出至置于0.01 mm载物台测微尺上的一滴矿物油中。
      注意：若液滴呈球形，则其皮升级体积可通过公式 (直径)3/1910 计算。30 直径为100 µm的针头在100 ms内可喷出约2 nL液体。

4. 注射果蝇

  1. 用移液器将 10 µL 的 1.6 mg/mL 颗粒滴加到一小块石蜡膜上。
    1. 将液体吸入注射针中，并安装至注射器喷嘴（参见 材料表）。
    2. 用 CO2 麻醉果蝇，并将其腹部朝上、头部朝向垫板前方，整齐排列在果蝇操作垫的指定区域。将培养瓶放置在实验台相应的区域。
    3. 在果蝇腹部上角位置注射液体，使用 5 次、每次 100 毫秒的脉冲（总量约 10 nL）。
    4. 将注射后的果蝇转移至相应的培养瓶中，并在瓶上标注时间。置于 25 °C 环境中培养。
  2. 更换新的注射针，吸入 0.4% 台盼蓝溶液。
  3. 将气动注射器设置为 门控模式（GATED），以维持恒定气流推动液体从针尖流出。
  4. 在果蝇休息 30 分钟后进行麻醉，并注射台盼蓝，直至果蝇腹部完全充盈并膨胀。
    注意：若使用 pH 敏感性染料标记的颗粒研究吞噬体成熟过程，应让果蝇休息 1 小时，且在固定果蝇前不得注射台盼蓝。
  5. 用胶带将果蝇固定在显微镜载玻片上，腹部朝下。将翅膀拨至果蝇身体两侧并粘在胶带上。同时，轻轻将头部压入胶带，确保果蝇不会移动。
  6. 立即进入步骤 5。

5. 成像果蝇

  1. 使用倒置荧光显微镜连接数码相机和计算机（参见材料表），以25倍或32倍放大倍数逐个拍摄果蝇图像。通过数码相机配套的计算机软件对焦至果蝇的背血管。
  2. 在不同实验之间记录曝光时间和放大倍数。
    注意：在一次实验中拍摄多个品系时，混淆基因型是潜在的误差来源。为避免果蝇标记错误，应记录每种基因型首尾两张果蝇照片的图像编号。

6. 荧光的定量与归一化

  1. 打开软件，一次打开一张图像。
    1. 测量背血管的荧光强度。在背血管周围绘制一个多边形。选择测量，并记录多边形内的荧光强度。
    2. 确定背景荧光强度。复制第一个多边形，并将其移动到果蝇背血管附近的区域。选择测量，并记录背景区域的荧光强度。
    3. 用背景荧光强度对背血管荧光强度进行归一化：
      背血管 ÷ 背景。
    4. 计算同一品系所有果蝇背血管归一化荧光强度的平均值。
    5. 重复实验另外两次。
    6. 使用非配对的 Student’s t-检验比较三次实验中对照组果蝇与实验组果蝇的平均相对荧光强度。使用以下公式计算效应量：Cohen’s d = (M1-M2) ÷ SDpooled，其中 M1 为基因型1的均值，M2 为基因型2的均值 &
      SDpooled = 标准差公式，方程，统计分析计算，sqrt((SD1^2 + SD2^2) / 2)。
      其中 SD1 为基因型1的标准差， SD2 为基因型2的标准差。

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结果

使用荧光素标记颗粒进行体内吞噬作用检测的示意图如图1A所示。将果蝇腹面朝下固定在一段电工胶带上，其腹部前两节（背血管所在位置）清晰可见（图1B）。实验误差的主要来源出现在注射和成像步骤（图1C）。若使用同一根针连续注射多只果蝇，针头可能因果蝇组织或颗粒残留而堵塞（图1C左上图）。由于Drosophila在GFP光下具有自发荧光，使用堵塞针头注射的果蝇会呈现微弱荧光，但缺乏血细胞内化颗粒所特有的清晰、点状荧光信号。另一个潜在的实验误差来源出现在台盼蓝注射过程中。在注射荧光标记颗粒30分钟后，果蝇接受第二次台盼蓝注射，以淬灭未被吞噬的细胞外颗粒的荧光。每只果蝇的相对荧光强度通过将背血管区域的荧光强度除以腹部相邻同等大小区域的荧光强度来计算。若果蝇未接受足量的台盼蓝注射，其整个腹部将强烈荧光（

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讨论

可购买的荧光标记颗粒可用于评估一般情况下的吞噬作用（0.2 µm 羧基修饰微球）或微生物的吞噬作用（经荧光标记的热灭活或化学灭活的细菌或酵母）。为评估吞噬体成熟过程，研究人员可选择带有 pH 敏感性染料的颗粒，该染料在 pH 由中性降至酸性时发出荧光，类似于在吞噬溶酶体中的情况。或者，为研究吞噬作用的初始步骤——病原体识别与摄取，研究人员应选择带有可在细胞内外均发出荧光的荧光标签的颗粒。

严格控制实验条件是确保体内吞噬作用检测能够以可重复方式进行的关键。首先，Drosophila 会发生细胞免疫衰老32，因此实验中所用果蝇应年龄匹配，最佳年龄范围为 4–7 天。其次，注射之间的时间间隔应保持一致。吞噬作用发生迅速，在宿主细胞感知到微生物后的数分钟内即开始14。在接下来的一个小时内，吞噬体逐渐成熟，导致吞噬体酸化并最终摧毁被内化的微生物。设定固定的注射间隔时间可减少实验变异，便于不同品系之间以及不同日期进行的实验之间的比较。我们建议使用荧光素标记...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Beth Gonzalez 博士和 Aprajita Garg 博士在开展体内吞噬实验过程中提供的支持。本研究由美国国家科学基金会马里兰大学 ADVANCE 种子基金以及马里兰大学 NIH T32 培训基金——细胞与分子生物学（CMB）和宿主-病原体相互作用（HPI）项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2μm 红色荧光羧酸盐修饰 FluoSpheresInvitrogenF8810荧光标记的乳胶微球用于检测吞噬细胞的总体吞噬能力。（~580/~605 nm）用含5%染料的PBS溶液将微球稀释20倍后注射。
5430-10 PicoNozzle 试剂盒World Precision Instruments5430-101.0毫米移液器支架
大肠杆菌（E. coli）K-12 菌株）BioParticles，Alexa Fluor 488 偶联物InvitrogenE13231已杀死 E. coli 用 Alexa Fluor 488 标记，用于检测吞噬细胞对革兰氏阴性菌的识别与摄取。（~495/~519 nm）
大肠杆菌（E. coli）K-12 菌株 BioParticles，Alexa Fluor 594 标记物InvitrogenE23370已杀死 E. coli 用 Alexa Fluor 594 标记，用于检测吞噬细胞对革兰氏阴性菌的识别与摄取。（~590/~617 nm）
大肠杆菌（E. coli）K-12 菌株 生物颗粒，荧光素偶联物InvitrogenE2861已杀死 E. coli 用FITC（荧光素）标记，用于检测吞噬细胞对革兰氏阴性菌的识别与摄取。（~494/~518 nm）
大肠杆菌（E. coli）K-12 菌株）生物颗粒，德克萨斯红偶联物InvitrogenE2863已杀死 E. coli 用Texas Red标记，用于检测吞噬细胞对革兰氏阴性菌的识别与摄取。（~595/~615 nm）
大肠杆菌（E. coli）K-12 菌株）生物颗粒，德克萨斯红标记物InvitrogenE2863已杀死 E. coli 用Texas Red标记，用于检测吞噬细胞对革兰氏阴性菌的识别与摄取。（~595/~615 nm）
针状移液器拉制仪David Kopf InstrumentsModel 725
pHrodo Red E. coli 用于吞噬作用的生物颗粒偶联物InvitrogenP35361已杀死 E. coli 用 pHrodo Red 标记。用于检测吞噬细胞对革兰氏阴性菌的识别、摄取及吞噬体成熟。（~560/~585 nm）。无需用台盼蓝淬灭。
pHrodo Red S. aureus 用于吞噬作用的生物颗粒偶联物InvitrogenA10010已杀死 S. aureus 用 pHrodo Red 标记。用于检测吞噬细胞对革兰氏阳性菌的识别、摄取及吞噬体成熟。（~560/~585 nm）。无需用台盼蓝淬灭。
Pneumatic PicoPump PV820世界精密仪器公司SYS-PV820世界精密仪器公司生产的气动PicoPump PV820利用差压在注射间期将液体保持在玻璃针头内。用户通过手动控制短暂的气体压力脉冲来排出液体 – 可实现亚纳升级别液体的输送。输送液体的量主要取决于两个变量 – 玻璃针开口的大小以及注射压力作用的时间。将仪器设置为100毫秒 “定时” 模式。
S. aureus （不含蛋白A的木材应变）BioParticles，Alexa Fluor 488标记InvitrogenS23371已杀死 S. aureus 用 Alexa Fluor 488 标记，用于检测吞噬细胞对革兰氏阳性菌的识别与摄取。（~495/~519 nm）
S. aureus （不含蛋白A的木材应变）生物颗粒，Alexa Fluor 594标记物InvitrogenS23372已杀死 S. aureus 用 Alexa Fluor 594 标记，用于检测吞噬细胞对革兰氏阳性菌的识别与摄取。（~590/~617 nm）
S. aureus （不含蛋白A的木霉菌）生物颗粒，荧光素偶联物InvitrogenE2851已杀死 S. aureus 用FITC（荧光素）标记，用于检测吞噬细胞对革兰氏阳性菌的识别与摄取。（~494/~518 nm）
薄壁玻璃毛细管World Precision InstrumentsTW100F-3用于注射的针头。OD = 1.0 mm
台盼蓝溶液（0.4%）SigmaT8154用于淬灭荧光素、Alexa Fluor 或 Texas Red 标记颗粒的细胞外荧光。
蔡司立体显微镜（Discovery.V8）ZeissSteREO Discovery.V8用于成像果蝇的倒置荧光显微镜。使用数字相机（示例：AxioCam HC 相机）及配套软件（示例：AxioVision 4.7 软件）拍摄图像。
Zymosan A（酿酒酵母BioParticles，Alexa Fluor 488 标记物InvitrogenZ23373用 Alexa Fluor 488 标记的灭活酵母。用于检测吞噬细胞对酵母的识别与摄取。（~495/~519 nm）
Zymosan A（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）生物颗粒，Alexa Fluor 594 标记物InvitrogenZ23374用 Alexa Fluor 594 标记的灭活酵母。用于检测吞噬细胞对酵母的识别与摄取。（~590/~617 nm）
Zymosan A（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）) 生物颗粒，荧光素偶联物InvitrogenZ2841用FITC（荧光素）标记的灭活酵母。用于检测吞噬细胞对酵母的识别与摄取。（~494/~518 nm）
Zymosan A（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）) BioParticles，德克萨斯红InvitrogenZ2843用Texas Red标记的灭活酵母。用于检测吞噬细胞对酵母的识别与摄取。（~595/~615 nm）

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利用体内吞噬作用检测法评估果蝇Drosophila melanogaster的细胞免疫反应
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