增殖人类抗原特异性CD4+ T细胞使用卡博曲莱辛苏奇尼米酯的定量

Summary

这里介绍的是一个协议,用于测量增殖CD4⁺ T细胞,以响应抗原蛋白或肽使用染料稀释。这种测定对稀有抗原特异性T细胞特别敏感,可以进行改性,以利于抗原特异性细胞的克隆。

Abstract

所述是一种简单的体外染料稀释方法,用于测量人类外周血单核细胞(PBMC)中抗原特异性CD4+T细胞增殖。稳定、无毒的荧光染料(如卡博基氟辛苏奇尼酰基酯(CFSE)的开发,通过减少荧光染色(通过流式细胞测定)来区分稀有的抗原特异性T细胞。与替代方法不同,此方法具有以下优点:(i) 对低频 T 细胞非常敏感,(ii) 不需要抗原或表位的知识,(iii) 可以分析响应细胞的表型,以及 (iv) 可行、有反应的细胞可以排序,并用于进一步分析,如T细胞克隆。

Introduction

检测和研究抗原特异性T细胞的能力在细胞介导免疫研究中非常重要。然而,这样做对于自身抗原特异性CD4和T细胞反应尤其具有挑战性,后者非常弱,难以检测。用于检测抗原特异性淋巴细胞增殖的常用方法是[3H]-胸腺素,这是一种放射性标记的核苷酸,并结合在增殖细胞的DNA中。虽然[3H]-胸腺酰胺测定可以检测DNA合成,但这种方法是细胞分裂的间接测量,因为DNA合成可以独立于线粒体分裂(即,在基因复制和凋^亡1期间)启动。由于细胞抗原特异性增殖可导致大量细胞凋亡,导致抗原特异性增殖的潜在高估,使这一问题更加复杂。此外,[3H]-胸腺素法不为扩散淋巴细胞提供花样信息,如CD4+或CD8+在受抗原肽刺激的PBMC中系生增殖。

2003年,我们发布了第一个使用CFSE的染料稀释测定,称为CFSE增殖测定3,4。CFSE 是一种荧光染料,通过与细胞内溶酶残留物形成共价键,与细胞内蛋白质形成稳稳结合。由于CFSE标记的蛋白质在子细胞3之间平均分配,分裂细胞可以通过流动细胞测定来区分未分割的细胞,这也允许淋巴细胞群的定量型型。事实上,细胞从CFSE染色时开始经历的分裂数量可以测量....

Protocol

所有受试者在采集外周血之前都给予知情同意。圣文森特霍斯普蒂亚尔(HREC-A 135/08和HREC-A 161/15)对使用PBMC的实验给予伦理批准。

1. 试剂制备

1. 人类T细胞培养基
   1. 准备RP-5培养PBMC,包括RPMI 1640、1x非必需氨基酸、L-丙烯-谷肽(2 mM)、青霉素(100 U/mL)/链霉素(0.1毫克/mL)和5%的人类血清(PHS)。
2. CFSE 库存解决方案
   1. 通过在+9 mL DMSO中溶解25毫克CFSE,制备主库存,以达到浓度为5 mM的最终库存溶液。
   2. 通过稀释 PBS 中的主库存来准备工作库存,以实现 10 μM 的工作浓度。

2. 全血制备人体多溴联苯细胞

1. 人外周血一般在0.5~1.5×10⁶ PBMC/mL之间。因此,所需血液量取决于所需数量的PBMC。用PBS至少稀释人外周血1:2。通过在 50 mL 管中加入 15 mL 的密度梯度介质,然后覆盖 35 mL 稀释的全血,分离 PBMC。
2. 在室温 (RT) 下,在 850 x g下离心 15 分钟,不减速。这将导致....

Results

用破伤风类毒素蛋白对人PBMC进行体外刺激:在破伤风类毒素存在的情况下,PBMC被染色,并在破伤风类毒素下被刺激7天。几乎所有的捐赠者都表现出强烈的T细胞对破伤风类毒素的反应,因为他们已经接种了疫苗,这使得破伤风类毒素是一种有用的阳性控制抗原。图2在三联中显示,CD4⁺ T细胞从未刺激的PBMC中增殖最小(±12 CFSE^暗细胞;图 2A,B,C ,同时CD4+T细胞在响应破伤风类毒素(>3,000 CFSE^暗细胞)时有明显增殖;图 2D,E,F)。

用抗原肽对人PBMC进行体外刺激:PBMC在人胰岛素C-肽存在的情.......

Discussion

基于CFSE的增殖是检测和枚举抗原特异性人类CD4+T细胞的简单而可靠的方法。此前已经证明,使用CFSE的最佳浓度对于最佳^结果4至关重要。过多的CFSE会废除增殖,而太少不允许分离和未分割的细胞被区分。相比之下,相对较高的CFSE浓度(5.0μM)用于标记纯化的鼠T细胞3。由于批次之间的变异性,建议对每批进行定位,以确定最佳浓度。我们使用当前批次的浓度(10 nM)远低于原始出版物(200 nM)4。

该方法的另一个重要方面是优化抗原剂量。已经证实,培养抗原较少的T细胞可以更敏感,并表现出增强的功能。这最初是在HIV^肽15的背景下证明的。该协议中使用的破伤风类毒素的量以前也经过^优化,以引起高度敏感和增殖的CD4+ T细胞。有趣的是,它之前已经表明,过量的抗原减少抗原特异性增殖15。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
抗人 CD4-AlexaFluor647	Biolegend	317422	RRID：AB_2716180
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 （CFSE）	ThermoFisher	C1157
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	71-7167-00
谷氨酰胺型 （1x）	Gibco	35050
甲型流感 H1N1 （PR8） 基质蛋白 1	义翘神州	40010-V07E
非必需氨基酸 （1x）	Gibco	11140
青霉素/链霉素 （1x）	Gibco	15070063
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Sigma-Aldrich	D8537
混合人血清	澳大利亚红十字会	N/A
C 肽原 PI33-63	Purar 化学品	N/A	定制合成肽
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
破伤风类毒素蛋白	Statens 血清 Intitut	N/A