使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯定量增殖的人抗原特异性CD4+ T细胞

摘要

本文介绍了一种利用染料稀释法检测CD4⁺ T细胞在抗原蛋白或肽刺激下增殖反应的实验方案。该检测方法对抗原特异性的稀有T细胞具有高度敏感性，并可进行修改以促进抗原特异性细胞的克隆。

摘要

本文介绍了一种简单、体外的基于染料稀释法的人外周血单个核细胞（PBMCs）中抗原特异性CD4⁺ T细胞增殖的检测方法。稳定且无毒的荧光染料（如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，CFSE）的发展，使得可通过流式细胞术检测荧光染色强度的减弱，从而将稀有的抗原特异性T细胞与旁观者细胞区分开来。该方法相较于其他替代方法具有以下优势：（i）对低频T细胞非常敏感；（ii）无需知晓抗原或表位信息；（iii）可分析应答细胞的表型；（iv）可分选存活的应答细胞，并用于后续分析，例如T细胞克隆。

引言

检测和研究抗原特异性T细胞的能力在细胞介导免疫的研究中具有重要意义。然而，针对自身抗原特异性的CD4⁺ T细胞反应进行检测尤为困难，因为这类反应非常微弱且难以被发现。一种常用于检测抗原特异性淋巴细胞增殖的方法是[3H]-胸腺嘧啶掺入法，该方法利用放射性标记的核苷酸掺入增殖细胞的DNA中。尽管[3H]-胸腺嘧啶掺入法能够检测DNA合成，但该方法仅能间接反映细胞分裂情况，因为DNA合成可能独立于有丝分裂而启动（例如在基因复制或细胞凋亡过程中¹）。这一问题因抗原特异性细胞增殖常伴随显著的细胞凋亡而进一步加剧²，可能导致对抗原特异性增殖程度的高估。此外，[3H]-胸腺嘧啶掺入法无法提供增殖淋巴细胞的表型信息，例如在抗原肽刺激的外周血单个核细胞（PBMCs）中CD4⁺或CD8⁺细胞亚群的增殖情况。

2003年，我们发表了首个使用CFSE的染料稀释法，称为基于CFSE的增殖检测法^3,4。CFSE是一种荧光染料，可通过与细胞内赖氨酸残基形成共价键而稳定结合于胞内蛋白质。由于CFSE标记的蛋白质在子代细胞间均等分配³，因此可通过流式细胞术区分已分裂细胞与未分裂细胞，同时还能对淋巴细胞群体进行定量表型分析。事实上，细胞自CFSE标记以来所经历的分裂次数可在一定程度上被测定⁵。近年来，已开发出多种作用机制类似的染料，如CellTrace Violet增殖染料（VPD）和CytoTrack染料⁶。本实验方案以CFSE为重点，但其原理同样适用于其他相关染料。

肽-MHC 四聚体染色法是一种广泛用于检测和克隆抗原特异性CD8⁺ T细胞的方法。该方法已较为成熟^7,8,9,10；然而，基于四聚体的克隆技术需要预先了解表位/MHC限制性，且每个表位均需制备相应的四聚体¹¹，这限制了对新型表位特异性T细胞的发现与克隆。基于CFSE的增殖检测可用于肽段、蛋白质或细胞裂解物。本文所述方案操作简便且结果可靠，所获得的反应性CD4⁺ T细胞可进一步分选，用于下游功能分析及生物化学特性鉴定实验^12,13。

方案

所有受试者在采集外周血前均签署了知情同意书。使用外周血单个核细胞（PBMC）的实验已获得圣文森特医院伦理审查委员会批准（HREC-A 135/08 和 HREC-A 161/15）。

1. 试剂准备

1. 人T细胞培养基
   1. 制备用于培养PBMC的RP-5培养基，其成分为RPMI 1640、1×非必需氨基酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽（2 mM）、青霉素（100 U/mL）/链霉素（0.1 mg/mL）以及5%混合人血清（PHS）。
2. CFSE储备液
   1. 将25 mg CFSE溶解于约9 mL DMSO中，配制母液，最终浓度为5 mM。
   2. 将母液用PBS稀释，配制工作液，最终工作浓度为10 µM。

2. 从全血中制备人外周血单个核细胞

1. 人外周血中单个核细胞（PBMC）的数量通常为每毫升 0.5–1.5 × 10⁶ 个。因此，所需血液量取决于目标获取的 PBMC 数量。用 PBS 至少以 1:2 的比例稀释人外周血。将 15 mL 密度梯度介质加入 50 mL 离心管中，然后在其上层叠加 35 mL 稀释后的全血，以分离 PBMC。
2. 在室温（RT）下以 850 × g 离心 15 分钟，不设减速。离心后将形成三层清晰的分层：底层为红细胞沉淀，中间层为密度梯度介质，其顶部界面附着白细胞，上层为血浆层¹⁴。
3. 移除约 20 mL 上层血浆层。收集白细胞层，注意避免混入红细胞沉淀。用 PBS 洗涤 3 次，并使用台盼蓝染色法在血细胞计数板上计数活细胞。将细胞重悬于 PBS 中，调整浓度至 1 × 10⁶ PBMCs/mL。
4. 未用 CFSE 染色的细胞
   1. 这些细胞用于流式细胞术的补偿对照，包括未染色细胞和仅 CD4⁺ 单染色细胞。将每种对照样本的 PBMC 悬液各取 300 µL 加入 10 mL 管中，补加 PBS 至满，然后在室温下以 550 × g 离心 5 分钟。
   2. 将细胞重悬于 RP-5 培养基中，浓度为 1 × 10⁶ 个/mL。将这些未标记细胞与 CFSE 标记的细胞（步骤 2.6.1）一同在 37 °C/5% CO₂ 培养箱中培养 7 天。
5. CFSE 染色细胞
   1. 将步骤 2.3 中的细胞转移至 50 mL 管中。沿管壁加入 CFSE 工作液（10 µM）每 1 mL 细胞悬液加 1.0 µL。通过反复倒置混匀数次。CFSE 的终浓度为 10 nM。
   2. 在 37 °C/5% CO₂ 培养箱中孵育 5 分钟。为终止染色，加入 5 mL RP-5 培养基，以 550 × g 离心 5 分钟使细胞沉淀。将 PBMC 重悬于 RP-5 培养基中，浓度为 1 × 10⁶/mL。
   3. 向 10 mL 管中加入 1.0 mL 细胞悬液。每种待测抗原使用一个独立的试管。
6. 人 PBMC 的抗原刺激与细胞培养
   1. 将人 CFSE 标记的 PBMC 在 RP-5 培养基中与抗原共同培养 7 天，置于 37 °C/5% CO₂ 培养箱中。在 96 孔板中每孔接种 1 × 10⁵ 个细胞（100 µL），每孔加入含稀释抗原的 RP-5 培养基 100 µL。
      注：所用抗原及其工作浓度汇总于 表 1。

3. 用于FACS分析的抗CD4染色

1. 将200 µL培养的细胞移入FACS管中，加入1.0 mL含0.1% FCS的PBS洗涤细胞一次，550 × g离心5分钟。
2. 在100 µL含0.1% FCS的PBS中加入抗人CD4 Alexa Fluor 647抗体（0.25 μg/mL）进行染色。另取一份CFSE标记的细胞样品，不使用任何其他荧光染料染色，用于设置FACS的CFSE补偿。4 °C避光孵育20分钟。
3. 加入1 mL含0.1% FCS的PBS洗涤细胞，室温下550 × g离心5分钟，重悬于100 µL含0.1% FCS的PBS中。在进行FACS分析前立即向所有管中加入1 µL碘化丙啶（PI，0.1 mg/mL），以便通过流式细胞术排除死细胞。

4. 流式细胞术配置与设门策略

注意：图1展示了包括补偿对照和设门策略在内的流式细胞术配置。

1. 在前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）图中设门（图1A），以包含所有淋巴细胞。
2. 在FSC与碘化丙啶（PI）图中对PI阴性细胞设门（图1B），以排除凋亡细胞。
3. 使用未染色细胞设定非荧光细胞的电压基线。调整CD4-A647和CFSE的电压，使每种荧光信号均低于1,000（图1C）。使用单色对照CFSE（图1D）和CD4-A647（图1E），在上述设定的电压条件下确认每种荧光的阳性信号（约10,000）。
4. CFSE与PI存在一定的光谱重叠；调整补偿，从CFSE荧光信号中扣除PI的荧光溢出，直至仅含CFSE的样本在PI通道中无信号显示。
   注意：上述设门策略适用于本文分析的所有样本。

5. 计算细胞分裂指数以定量抗原特异性CD4⁺ T细胞增殖

注意：细胞分裂指数（CDI）是指每5,000个未分裂细胞（CD4⁺/CFSE^明亮）中分裂细胞（CD4⁺/CFSE^暗淡）的数量。当未分裂的CD4⁺细胞数量不恰好为5,000时，需对分裂细胞数量进行校正，以表示每5,000个未分裂细胞中的分裂细胞数。例如，在破伤风类毒素特异性增殖实验中（图2D），未分裂细胞（CFSE^明亮）为4,930个，分裂细胞（CFSE^暗淡）为3,268个；因此，校正后的分裂细胞数量为 (5,000/4,930) × 3,268 = 3,304.3。

1. 通过将抗原刺激组中每5,000个未分裂细胞对应的分裂细胞数除以无抗原培养组中每5,000个未分裂细胞对应的平均分裂细胞数，计算CDI（表1）（表2）。

结果

使用破伤风类毒素蛋白体外刺激人外周血单个核细胞（PBMC）：用CFSE标记PBMC，并在破伤风类毒素存在下刺激培养7天。由于几乎所有供体均接种过疫苗，因此对破伤风类毒素表现出强烈的T细胞反应，这使得破伤风类毒素成为一种有用的阳性对照抗原。图2显示了三组重复实验结果：未刺激的PBMC中CD4⁺ T细胞的CFSE增殖极低（约12个CFSE^dim细胞；图2A、B、C），而对破伤风类毒素刺激则出现明显的CD4⁺ T细胞增殖（>3,000个CFSE^dim细胞；图2D、E、F）。

使用抗原肽体外刺激人外周血单个核细胞（PBMC）...

讨论

基于CFSE的增殖检测是一种简单且可靠的方法，用于检测和计数抗原特异性的人CD4⁺ T细胞。已有研究证明，使用最佳浓度的CFSE对于获得理想结果至关重要⁴。CFSE浓度过高会抑制细胞增殖，而浓度过低则无法区分已分裂与未分裂的细胞。相比之下，标记纯化的鼠源T细胞时通常使用相对较高的CFSE浓度（5.0 µM）³。由于不同批次之间存在差异，建议对每一批次进行滴定，以确定其最佳工作浓度。我们当前使用的批次浓度（10 nM）远低于原始文献中报道的浓度（200 nM）⁴。

该方法的另一个重要方面是抗原剂量的优化。已有充分证据表明，使用较低抗原浓度培养的T细胞具有更高的敏感性，并表现出更强的功能。这一现象最初在HIV多肽的研究中得到证实¹⁵。本方案中所使用的破伤风类毒素剂量也已在此前经过优化⁴，以诱导出高敏感性和强增殖能力的CD4

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗人 CD4-AlexaFluor647	Biolegend	317422	RRID:AB_2716180
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）	ThermoFisher	C1157
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	71-7167-00
Glutamax (1x)	Gibco	35050
甲型流感病毒 H1N1（PR8）基质蛋白1	Sino Biological	40010-V07E
非必需氨基酸（1x）	Gibco	11140
青霉素/链霉素（1x）	Gibco	15070063
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	D8537
混合人血清	澳大利亚红十字会	N/A
胰岛素原C肽 PI33-63	Purar Chemicals	N/A	定制合成肽
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
破伤风类毒素蛋白	Statens Serum Intitut	N/A