一种用于诱导小鼠抑郁样行为的慢性制动应激方案

摘要

本文提供了一种使用固定装置对慢性固定小鼠诱导类抑郁行为的简化且标准化的实验方案。此外，还介绍了用于验证抑郁状态诱导的行为学和生理学技术。

摘要

抑郁症的发病机制尚未完全阐明，但已有多种致病因素被报道。近年来，抑郁症的患病率呈上升趋势。然而，针对抑郁症的治疗手段或相关研究仍较为匮乏。因此，本文提出一种通过运动限制诱导的抑郁症小鼠模型。慢性轻度应激（CMS）是诱导类抑郁行为的常用方法，但该方法需要复杂的操作流程，涉及多种轻度应激的组合。相比之下，慢性制动应激（CIS）是一种易于实施的慢性应激模型，由限制性模型改良而来，通过使用固定装置在一定时间内限制动物活动以诱导抑郁样行为。为评估类抑郁行为，本实验结合了蔗糖偏好实验（SPT）、悬尾实验（TST）以及用于检测应激标志物皮质酮水平的ELISA检测方法。所述实验方案详细描述了CIS模型的建立过程，并展示了行为学及生理指标变化的评估方法，以验证抑郁症模型的有效性。

引言

重度抑郁症（MDD）是全球精神残疾的首要原因，其发病率增长速度超过预期。2001年，世界卫生组织曾预测，到2020年MDD将成为全球第二常见的疾病。然而，早在2013年它就已位居第二¹。此外，目前的抗抑郁药物存在诸多局限性，包括起效延迟、药物耐受、复发以及多种副作用^2,3。因此，研究人员必须开发出更有效的抗抑郁药物。然而，MDD复杂的病理生理机制为新型抗抑郁药物的研发带来了挑战。

长期压力是重度抑郁症（MDD）的主要危险因素。它可导致下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能紊乱，而HPA轴功能异常也与MDD的发病机制相关。^4,5正如先前所述，下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）通过升高皮质酮水平，在应激诱导的精神疾病病理生理过程中发挥关键作用，包括抑郁症和焦虑症。^6,7,8,9许多动物模型均基于HPA轴的持续激活，这种现象在重度抑郁症（MDD）患者中可见。⁴此外，慢性应激和皮下注射诱导的高糖皮质激素水平 注射糖皮质激素会导致啮齿类动物出现抑郁样行为，并伴随脑内神经细胞死亡、神经元突起萎缩以及成年神经发生减少^10,11另一个与抑郁症相关的重要脑区是内侧前额叶皮层（mPFC）。mPFC在调控控制情绪行为和应激反应的脑区亚区（如下丘脑和杏仁核）中起着关键作用。^8,9例如，背侧内侧前额叶皮层（mPFC）的损伤会导致下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能障碍，并在束缚应激条件下增强皮质酮的分泌^12,13最近一项研究表明，反复的束缚应激会升高皮质酮水平，而通过补充谷氨酰胺可经由前额叶皮层神经元与星形胶质细胞之间的谷氨酸-谷氨酰胺循环降低该水平⁹.

首个用于研究重度抑郁症（MDD）病因的慢性应激范式由Katz提出¹⁴。随后，Willner等人基于Katz的研究结果提出了慢性轻度应激（CMS）模型，并通过观察抗抑郁药物可逆转CMS诱导的类快感缺失行为，证实了该模型具有预测效度^15,16。通常，CMS模型包含多种轻度应激的组合，例如轻微噪音、笼体倾斜、潮湿垫料、光照-黑暗周期改变、笼体摇晃、强迫游泳以及社会挫败。尽管CMS模型被研究人员广泛使用，但该模型可重复性差，且耗时耗能。因此，目前迫切需要一种标准化且简化的方案，用于诱导类抑郁行为并进行生理学分析以评估抑郁状态。与CMS模型相比，慢性固定应激（CIS；也称为慢性束缚应激）模型更为简单高效，因此可在慢性应激研究中广泛应用^{17,18,19,20,21,22,23,24}。此外，CIS模型可用于雄性和雌性小鼠以诱导抑郁样行为^25,26。在CIS过程中，动物被置于与其身体大小相匹配的圆筒中，每天限制1至8小时，持续2周或4周^9,27,28。其中，每天束缚2小时、连续2周的应激条件足以在小鼠中引发抑郁样行为，同时疼痛最小化^9,28。在束缚条件下，小鼠血浆皮质酮水平迅速升高^9,28,29。多项研究表明，CIS模型具有预测效度，证实抗抑郁药物可逆转CIS诱导的类抑郁症状^19,20,30,31。本文中，我们报告了CIS的详细操作流程，以及小鼠在经历CIS后的一些行为学和生理学结果。

方案

所有实验方案和动物护理均按照庆尚国立大学动物研究大学动物护理委员会（GLA-100917-M0093）的指南进行。

1. 材料

1. 小鼠
   1. 使用7周龄、C57BL/6品系背景的雄性小鼠，体重为22–24 g。实验前在繁育室中适应环境1周。
      注：所有小鼠均购自实验动物公司。
   2. 将小鼠单独饲养于温度可控的动物房（22–24 °C），维持12小时光照/12小时黑暗循环（光照开启时间为上午6:00），自由摄取标准实验室饲料和饮水。
2. 固定装置
   1. 使用一个圆柱形、透明的丙烯酸容器（高度 = 8.5 cm，直径 = 2.5 cm），固定在一个方形底座上，用于限制小鼠活动并诱导抑郁样行为（图1A）。该圆柱体的直径设计为贴合小鼠身体，使其无法转身或前后移动。该固定装置可商业购买，也可在实验室自制。
3. 尾悬吊装置
   1. 使用一个由半透明丙烯酸材料制成的适当尺寸的尾悬吊箱（高度 = 30 cm，宽度 = 20 cm，长度 = 20 cm，图1B）。为防止动物间相互干扰，箱内设置矩形隔板，使底部及四个侧壁中的三个被丙烯酸板遮挡。保留箱体另外两个侧面开放，以便进行视频录制并安装水平横杆。该装置可商业购买，也可在实验室自制。
4. 视频记录设备与视频追踪软件
   1. 使用一台黑白显示的闭路电视摄像机（见材料表），连接至计算机和三脚架（或其他支撑设备），以记录行为学实验过程。由于本实验中至少同时测试两只小鼠，因此视频记录对于后续行为评分至关重要。
   2. 确保摄像机分辨率足够高，以便利用安装在连接计算机中的视频追踪软件（见材料表）对视频数据进行分析。

2. 通过CIS束缚诱导抑郁

注意：抓取小鼠时应轻柔但坚定，充满信心。操作粗暴或犹豫不决都会成为实验中的额外应激因素，也是导致小鼠挣扎、咬人和抓挠的重要原因。

1. 使用数字照度计将房间光照条件设置为光照（200 勒克斯）。
2. 在测试前至少一周将小鼠单独饲养，并在实验前至少30分钟将其放入测试房间。
   注意：在实验前至少连续3天每天抓取小鼠一次，使其适应实验操作者。实验前的适应期是必要的，以确保小鼠适应环境，例如测试房间。
3. 轻轻握住小鼠尾巴以避免其紧张，然后小心地将其放置在粗糙表面（如笼子的金属栏杆顶部或笼盖上）。
4. 用一块白色小毛巾覆盖固定装置，然后轻轻地将小鼠置于固定装置开口处，使其自愿进入固定装置。
   注意：此时小鼠进入固定装置后身体方向与其进入方向相反。为促使小鼠自愿进入固定装置，可用小毛巾覆盖装置以使其内部更暗。
5. 安装封闭端以尽可能牢固地固定小鼠，同时注意避免对身体部位（如尾巴、脚和睾丸）造成损伤。
6. 每天固定小鼠2小时（上午9:00至11:00），连续进行15天。
7. 每48小时测量一次体重和食物摄入量 （即在开始运动限制前48小时内的食物摄入量） 。
   注意：在测量体重和食物摄入量时，将对照组小鼠置于测试房间内的原饲养笼中，与慢性束缚应激（CIS）小鼠保持相同的环境条件。
8. 通过进行行为学测试（如蔗糖偏好实验（SPT）和悬尾实验（TST））来确认抑郁状态的诱导（参见步骤4和5）。
9. 通过ELISA法检测应激标志物皮质酮水平来确认抑郁状态的诱导（参见第6节）。

3. 蔗糖偏好实验

1. 测试前，将小鼠适应两个饮水瓶（一个装有0.1 M蔗糖溶液，另一个装有纯水）的存在48小时。24小时后调换两个瓶子的位置。 以减少由侧向偏差引起的任何混杂因素。
2. 第3天^rd 第1天，让小鼠禁水24小时。
3. 在SPT实验当天，让小鼠接触两个饮水瓶，持续6小时。3小时后，交换两个饮水瓶的位置。
4. 记录动物消耗的蔗糖溶液和水的体积（mL），然后计算动物对蔗糖的偏好程度。
5. 通常，将蔗糖偏好计算为测试期间蔗糖消耗体积占总液体消耗体积的百分比。

4. 尾悬试验

1. 在开始悬尾实验（TST）前至少30分钟 ，将慢性不可预知应激（CIS）诱导的小鼠带入测试室。
2. 将房间光照调节至昏暗（50 Lux）条件。
3. 为获得最高分辨率的视频文件，应将摄像机尽可能靠近小鼠放置（距离小鼠约40 cm）。
4. 使用透明胶带将小鼠牢固地悬挂在水平横杆上（距底部标线30 cm，胶带粘贴位置距离尾尖1 cm）。应尽快完成胶带粘贴操作，以尽量减少其他应激源的影响。
5. 当小鼠被置于悬挂箱中央后，开始录像，并持续观察其行为变化6分钟。
   注意： 若小鼠试图攀爬其尾巴，应使用小棒或防攀爬装置阻止该行为。
6. 实验结束后，将小鼠移回其饲养笼，并小心地从尾部去除胶带。
7. 使用视频追踪软件分析静止时间段的累计时间。
   注意：静止持续时间是最关键的CIS参数，可通过软件中滤波器设定的运动阈值所定义的静止时间段累计值进行计算。

5. 采用ELISA法测定血液中皮质酮水平

注意：行为学测试后的第二天，处死小鼠以采集血液。

1. 将小鼠置于含有5%异氟烷的诱导室中进行麻醉，直至进入麻醉状态。确保小鼠在诱导室中有足够时间（至少2分钟），以防止手术过程中苏醒。
2. 使用1 mL注射器从心脏采血，并将血液收集至含有K₃EDTA的真空采血管中，置于冰上保存（上午9点）。
3. 在4 °C条件下，以1,000 × g离心15 min ，分离血浆。
4. 按照试剂盒说明书，使用皮质酮ELISA试剂盒（见材料表）定量检测血浆中皮质酮水平。

结果

在代表性实验中，所有数据均来自每组6至8只小鼠。插入小鼠至固定装置的代表性材料及小鼠自愿插入方法如图1所示。

为进行CIS诱导后的行为学测试和采血，小鼠接受了如图2A所示的实验流程。如图2和图3所示，CIS可有效诱导类似抑郁的行为，并释放应激标志物皮质酮。此外，补充谷氨酰胺可使这些指标得到恢复（小鼠在整个实验期间饲喂含谷氨酰胺的饮食，剂量为150 mg/kg），如图3所示。

讨论

大脑的复杂性和重度抑郁症（MDD）的异质性使得构建能够完全再现该疾病的动物模型具有挑战性。许多研究人员采用基于内表型的方法来克服这一困难³²，其中快感缺失（对奖赏性刺激缺乏兴趣）和绝望被视为在进化上保守且可在动物模型中量化的行为，这些行为同样存在于抑郁症患者中³³。在本文中，我们介绍了一种方法，证明慢性不可预知应激（CIS）足以诱导快感缺失和绝望，表明CIS与MDD之间具有转化相关性。此外，许多研究已利用CIS来揭示引发类抑郁行为的机制，并评估能够恢复正常行为的抗抑郁药物^{9,19,20,30,31,34}。因此，CIS可能适用于研究MDD的病因，进而有助...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 ml 一次性注射器	Sungshim Medical	P000CFDO
天平	A&D Company	FX-2000i
球形喷嘴	Jeung Do B&P	JD-C-88
闭路电视摄像机	KOCOM	KCB-381
皮质酮 ELISA 试剂盒	Cayman Chemical
数字照度计	TES	TES-1330A
Ethovision XT 7.1	Noldus Information Technology
异氟烷	HANA PHARM CO., LTD.		Ifran 溶液
小鼠	Koatech		C57BL/6 品系
固定器	Dae-jong Instrument Industry	DJ-428
蔗糖	DAEJUNG	7501-4400
小动物异氟烷麻醉系统	Summit
丙烯酸棒			该装置由实验室自制，用于 TST 实验
尾悬吊箱			该装置由实验室自制
计时器	Electronics Tomorrow	TL-2530
饮水瓶	Jeung Do B&P	JD-C-79