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方法文章

中性电荷、pH响应性聚合物纳米颗粒的制备及其用于细胞质siRNA递送

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DOI：

10.3791/59549

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2019年5月2日

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of Mississippi, 2Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi, 3Biomedical Engineering Program, University of Mississippi

本文内容

摘要

介绍了制备和表征中性电荷、pH响应性siRNA纳米颗粒的理化性质及生物活性的方法。讨论了siRNA纳米药物成功的关键指标，如粒径、形貌、表面电荷、siRNA载药量和基因沉默效果。

摘要

小干扰RNA（siRNA）作为靶向分子药物的成功，依赖于其向病变组织内细胞的高效胞质递送。在治疗以往“不可成药”的肝脏疾病靶点方面，siRNA已实现临床成功。然而，实现肿瘤部位的高效siRNA递送还需额外的药代动力学设计考量，包括延长血液循环时间、逃避免疫清除器官（如, 肝脏和肾脏）以及肿瘤组织中的穿透与滞留能力。本文描述了用于高效递送siRNA（尤其是递送至非肝组织如肿瘤）的聚合物纳米颗粒的制备方法及其体外理化性质与生物学特性的表征。该siRNA纳米颗粒通过siRNA与嵌段共聚物聚乙二醇-聚赖氨酸（poly(ethylene glycol-b-[2-(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯-co聚离子复合物（polyplexes）由siRNA被包封在polyplex核心内，而PEG形成亲水性、电中性冠层。此外，随着内体-溶酶体途径囊泡的酸化，DB嵌段会变得具有膜裂解性。< pH 6.8），从而触发内体逃逸并实现siRNA的胞质递送。文中描述了用于表征siRNA纳米颗粒理化特性的方法，包括粒径、表面电荷、颗粒形态及siRNA载量。采用荧光素酶作为模型基因，通过快速、高通量的基因沉默实验检测siRNA纳米颗粒的生物活性。通过上述初步测试的设计（如基于PEG-DB的聚合物复合物）可被视为适合推进至临床前动物研究，以评估siRNA向肿瘤或其他病理部位的递送效果。

引言

由于siRNA能够抑制mRNA序列翻译成蛋白质，理论上可用于治疗所有已知的病理状态1,2,3,4,5。然而，siRNA在医学中的应用受到其整体较差的药代动力学特性的限制6,7。静脉注射后，siRNA会迅速经肾脏清除和/或被核酸酶降解8,9。由于其分子量较大且带有负电荷，siRNA无法进入细胞，也无法从内体-溶酶体途径中逃逸，从而无法到达位于细胞质中的RNA诱导沉默复合物（RISC）10,11,12,13。因此，大量研究致力于siRNA递送策略的设计与实现14。这些研究主要集中在开发基于脂质和聚合物的纳米颗粒，这类纳米颗粒可将siRNA包裹其中，保护其在体内不被清除和降解，并通过可离子化的阳离子胺基团促进细胞摄取和内体逃逸。已有许多临床前研究取得成功，最近更是首次报道了基于纳米颗粒的肝脏siRNA递送在治疗遗传性转甲状腺素蛋白介导性（hATTR）淀粉样变性方面的临床成功案例15。

目前许多致癌基因无法通过传统药理学方法（即小分子药物）进行靶向治疗，这推动了用于癌症治疗的聚合物siRNA纳米颗粒（si-NPs）的设计16。然而，非肝脏部位的siRNA递送需要考虑另一组独立的设计参数。递送系统必须屏蔽聚集体所带的阳离子电荷，因为该电荷会导致全身循环中的聚集现象17,18,19。特别是对于肿瘤递送而言，si-NP的稳定性至关重要，它能够实现长循环时间，从而通过增强的渗透与滞留效应（EPR）提高在肿瘤组织中的富集20,21。此外，对si-NP尺寸的控制也至关重要，因为只有直径约为20–200 nm的纳米颗粒才能有效利用EPR效应22，而更小的si-NPs（约20–50 nm直径）相比更大尺寸的纳米颗粒和微粒，表现出更优的肿瘤穿透能力23。

为应对静脉注射后siRNA全身性肿瘤递送所面临的额外设计挑战，研究人员已开发出具有中性电荷且对pH响应的siRNA纳米颗粒（si-NPs）（图1）24。这些si-NPs经过聚乙二醇化（PEGylation），或最新采用两性离子化（Zwitterionation）25，以实现表面电荷中性，并在血液循环中抵抗蛋白质吸附和调理作用。由于它们不能仅依赖阳离子特性来驱动细胞内递送，因此必须实现极为高效的内涵体逃逸，才能获得显著的基因沉默效果。为此，这些si-NPs的核心由一种高效内涵体裂解性材料构成，该材料在细胞外pH值（7.4）下呈惰性，但在内涵体-溶酶体通路的酸性环境[pH 6.8（早期内涵体）至5.0（溶酶体）]中可发生类似开关的激活响应。最后，si-NPs核心内含有阳离子与疏水性成分的混合物，可同时提供静电作用力和范德华力，从而相较于单纯的阳离子体系显著提高si-NPs在血液中的稳定性。

利用可逆加成-断裂链转移（RAFT）可控聚合技术，可将多种功能整合到相对简单的结构设计中，从而制备具有复杂拓扑结构和精确组成的聚合物。为了制备表面电荷呈中性、具有pH响应性且稳定的siRNA纳米颗粒（si-NPs），采用RAFT聚合合成聚乙二醇-b-[2-(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯-co-丁基甲基丙烯酸酯]（PEG-DB；图1A）。PEG-DB通过静电相互作用与siRNA复合，形成具有PEG冠层和DB/siRNA内核的si-NPs（图1B）。PEG在si-NP冠层形成一层惰性、电中性的亲水性外壳。DB嵌段由等摩尔比的2-(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯（DMAEMA）和丁基甲基丙烯酸酯（BMA）共聚而成。带正电荷的DMAEMA通过静电作用与带负电荷的siRNA结合。BMA则通过范德华力在纳米颗粒内核中发生自聚集，从而增强纳米颗粒的稳定性。DMAEMA和BMA共同赋予DB嵌段pH依赖性的脂质双分子层裂解特性。在细胞外pH条件下，DB嵌段被封闭在si-NP内核中，对脂质双分子层呈惰性。而在酸性环境中（如内体-溶酶体通路内），DB嵌段中的可电离DMAEMA可介导“质子海绵效应”，即内体缓冲能力导致渗透压升高，进而引起内体肿胀并破裂26。此外，DB嵌段中的疏水性BMA组分可主动插入并破坏脂质双分子层，实现高效的内体裂解。因此，siRNA与PEG-DB复合形成的si-NPs在细胞外pH下呈电中性且高度稳定，而在酸性pH条件下可破坏脂质双分子层，从而确保siRNA有效递送至细胞质中。

本文描述了利用PEG-DB制备si-NP的实验步骤，并介绍和讨论了表征si-NP理化参数及生物活性的方法。为了快速评估si-NP的生物活性，本研究采用荧光素酶作为基因沉默研究的模型基因。萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）是萤火虫发光现象中 responsible 的蛋白质27。因此，转染了萤火虫荧光素酶基因的哺乳动物细胞会产生可被发光仪检测的生物发光信号，从而定量荧光素酶的表达水平。本实验中，通过向表达荧光素酶的细胞递送靶向荧光素酶的siRNA，并与接受乱序siRNA的细胞进行比较，测定生物发光信号的相应降低程度，以此评估si-NP的生物活性。

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方案

1. si-NPs 的制备与表征

  1. si-NP 的制备
    1. 将聚合物溶解于 10 mM 柠檬酸缓冲液（pH 4.0）中，浓度为 3.33 mg/mL。可先将聚合物以乙醇配制成 10 倍浓度溶液，以确保充分溶解。
      注意：聚合物可溶解于较低浓度，但浓度高于 3.33 mg/mL 可能会阻碍均一纳米颗粒（NP）的形成。
    2. 加入 siRNA（50 μM，溶于 diH2O），使 N+:P- 比值达到 10。通过移液充分混合聚合物与 siRNA 溶液，并静置孵育 30 分钟。N+:P- 比值表示聚合物中带正电荷的胺基数量与 siRNA 中带负电荷的磷酸基团数量之比，其计算公式如下：
      siRNA 复合反应方程，静态平衡，摩尔比计算，教学示意图
      其中，mol Pol 为聚合物的摩尔量，RU amine 为每条聚合物链中带正电荷胺基的重复单元数，mol siRNA 为 siRNA 的摩尔量，bp siRNA 为每条 siRNA 分子的碱基对数。
    3. 加入 5 倍体积的 10 mM 磷酸盐缓冲液（pH 8.0），通过移液或倒置离心管的方式轻柔混匀。为确认最终 pH 值为中性（~7.2–7.5），取 10 μL si-NP 溶液滴加至 pH 试纸上进行检测。
      注意：柠檬酸缓冲液和磷酸盐缓冲液的配制方法依据 Millipore Sigma 缓冲液参考中心图表进行。
  2. si-NP 的理化表征
  3. 采用动态光散射（DLS）技术测定所制备 si-NP 的粒径和表面电荷。取 1 mL si-NP 溶液（浓度 0.1–1.0 mg/mL），经 0.45 μm 孔径的注射器滤器过滤后，转移至方形石英或聚苯乙烯比色皿中制备 DLS 样品。根据仪器制造商的操作说明，使用 DLS 仪器记录粒径和表面电荷数据。
    1. 通过透射电子显微镜（TEM）成像分析，确认 si-NP 的粒径与形貌。
      1. 取 5 μL 浓度为 1 mg/mL 的 si-NP 溶液滴加至 TEM 载网，孵育 60 秒，用滤纸吸除多余液体 3 秒。
      2. 加入 5 μL 3% 醋酸铀酰溶液，孵育 20 秒，再次用滤纸吸干 3 秒。将载网置于干燥环境中过夜干燥。
      3. 根据所用显微镜的既定操作流程对载网进行成像。
    2. 采用琼脂糖凝胶阻滞实验，在不同 N+:P- 比值下表征 siRNA 在 si-NP 中的包封情况。
      1. 配制 2% 琼脂糖凝胶：将 2 g 电泳级琼脂糖粉末加入 100 mL pH 8.0 的 1× TAE（Tris-乙酸-EDTA）缓冲液中，搅拌悬浮后，于微波炉中敞口加热至琼脂糖完全溶解（1–3 分钟）。
      2. 待溶液冷却后，加入 5 μL 溴化乙锭（10 mg/mL，溶于 H2O），充分混匀。将琼脂糖溶液倒入凝胶模具，插入梳子形成加样孔，静置干燥 30 分钟。小心拔出梳子，向凝胶槽中加入 1× TAE 缓冲液至最大填充线。
      3. 按照前述方法制备 N+:P- 比值分别为 0、1、2、5、7、10、20 和 40 的 si-NP。在石蜡膜上为每种 si-NP 配方分别取 2 μL 上样染料（不含 SDS 和还原剂）。用移液器将 10 μL si-NP 溶液与石蜡膜上的上样染料混合。
      4. 将 si-NP 与上样染料的混合液加入琼脂糖凝胶的加样孔中。以 100 V 电压电泳 35 分钟（或直至样品迁移至凝胶长度的 80%）。
      5. 根据制造商的操作说明，使用紫外透射仪观察 siRNA 条带。

2. 确定 si-NPs 的体外生物活性

  1. 荧光素酶模型基因的敲低
    1. 使用荧光素酶siRNA制备荧光素酶si-NPs（依据上述步骤），并使用随机序列siRNA制备乱序对照si-NPs。两种si-NPs均需配制为相同的最终N+:P- 摩尔比，并采用琼脂糖凝胶阻滞实验所确定的最佳比例。示例siRNA序列见于材料表中。
    2. 将表达荧光素酶的细胞[MDA-MB-231/Luciferase (Bsd) 稳定细胞系]以每孔2,000个细胞的密度接种于96孔黑色壁板中。在培养箱中（37 °C，5% CO2，95%湿度）使用完全培养基（DMEM，10% FBS）孵育过夜，使其充分贴壁。
    3. 将si-NPs用含血清的完全培养基稀释，使每孔终体积为100 μL，siRNA终浓度为100 nM。用si-NPs处理细胞24小时。
    4. 24小时后，移除处理液，更换为含150 μg/mL D-荧光素的完全培养基。按照仪器制造商的操作说明，在平板读数仪或活体光学成像系统上检测发光信号前，先孵育5分钟。
    5. 将含荧光素的培养基更换为新鲜的完全培养基，继续培养24小时。重复上述步骤：移除培养基，加入含150 μg/mL D-荧光素的完全培养基，孵育5分钟后，在48小时时间点再次检测发光强度。
    6. 对于长期实验，在检测发光信号期间需维持细胞的无菌培养条件。每次检测后，移除含荧光素的培养基，更换为新鲜完全培养基继续培养。
      注：合适的siRNA浓度会因不同的si-NPs和siRNA分子而异。当使用具有内体裂解核心的中性电荷聚集体（如PEG-DB）时，100 nM浓度通常对细胞具有良好的耐受性，并可实现>75%的荧光素酶基因敲低效果。在N+:P- 比为10、siRNA处理浓度为100 nM（假设siRNA长度为26 bp）时，PEG-DB与siRNA的质量比为23.3，即每1.0 ng siRNA需加入23.3 ng PEG-DB。例如，在96孔板中每孔以100 nM浓度处理（每孔培养液体积为100 μL），需向166.5 ng siRNA中加入1.16 μL浓度为3.33 mg/mL的聚合物溶液。

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结果

有效的si-NP用于体内siRNA递送的一些关键特性包括合适的粒径（约20–200 nm直径）、siRNA的包封能力以及基因沉默的生物活性。尽管这些特性并非详尽无遗（如讨论部分所述），但在进一步测试某一制剂之前，应首先确认这些基本特性。

图2展示了si-NP在制备后的粒径和表面电荷表征。动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）作为互补方法，用于检测si-NP的粒径（两者均可）、多分散性（DLS）以及形态（TEM）。DLS结果显示，si-NP 1的平均直径为35 nm，单峰分布表现为仅出现一个峰，且峰宽较窄，表明其多分散性低（图2A）。TEM结果证实了DLS测得的粒径，提示si-NP群体均一，并显示出si-NP呈球形形态（图2C）。对si-NP 2的DLS和TEM检测表明...

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讨论

本文所述的si-NP是通过阴离子siRNA与阳离子聚合物通过静电相互作用形成聚离子复合物（polyplexes）而制备的。在低pH（4.0）条件下混合，可促进siRNA与PEG-DB聚合物中阳离子DB嵌段之间的静电复合。在pH 4.0时，DMAEMA高度质子化，因此DB嵌段带有大量正电荷。这确保了聚合物在溶液中以单分子形式溶解，而非形成胶束，并且DB能高效地与siRNA形成复合物。随后，将溶液pH调节至中性（pH 7.4），导致DB嵌段发生“疏水化”，进而形成胶束，并将复合的siRNA包载于所形成的polyplexes的内核中。这些polyplexes的设计使得PEG在DB/siRNA核心周围形成一层亲水性、惰性的外壳，从而产生系统给药所必需的中性表面电荷。聚合物的化学结构及polyplexes的形成过程如图1所示。

对si-NPs进行严格的理化表征，对于确定其配方是否适合进入生物学测试至关重要。粒径、表面电荷以及颗粒形状/形貌均为可能影响生物学性能的重要参数。对于向肿瘤的全身递送，si-NPs的粒径应在20–200 nm...

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披露

作者声明不存在任何潜在的利益冲突。

致谢

作者感谢 Craig Duvall 博士和 Rebecca Cook 博士提供数据和实验室资源以开展本项研究。作者感谢范德堡纳米科学与工程研究所（VINSE）提供动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）仪器的使用权限（NSF EPS 1004083）。作者感谢美国国家科学基金会对研究生研究奖学金项目的支持（NSF#1445197）。作者感谢美国国立卫生研究院提供的经费支持（NIH R01 EB019409）。作者感谢美国国防部国会指定医学研究项目（DOD CDMRP OR130302）提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.45 μm 孔径注射器滤器Thermo Fisher ScientificF25133直径 17 mm，PTFE 膜
0-14 pH 试纸Millipore SigmaP4786
10x TAE 缓冲液Thermo Fisher Scientific/InvitrogenAM9869
6-7.7 pH 试纸Millipore SigmaP3536
96 孔黑色壁板Corning3603经组织培养处理
琼脂糖粉末Thermo Fisher Scientific/Invitrogen16500
一水柠檬酸Millipore SigmaC1909
二水磷酸氢二钠Millipore Sigma71643
D-荧光素Thermo Fisher Scientific88294单钾盐
DMEMGibco11995065高糖含丙酮酸钠
乙醇Millipore Sigma459836
溴化乙锭Thermo Fisher Scientific/Invitrogen15585011
FBSGibco26140079
上样染料Thermo Fisher Scientific/InvitrogenR0611
荧光素酶 siRNAIDTN/A反义链序列：GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC
AAUUGUU
正义链序列：CAAUUGCACU
GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA 碱基
MDA-MB-231 / 荧光素酶 (Bsd) 稳定细胞系GenTarget IncSC059-Bsd表达荧光素酶的细胞，用于评估 si-NP 生物活性
一水磷酸二氢钠Millipore SigmaS9638
乱序 siRNAIDTN/A反义链序列：AUACGCGUAUU
AUACGCGAUUAACGAC
正义链序列：CGUUAAUCGCGUAUAAUAC
GCGUA*T* *DNA 碱基
方形聚苯乙烯比色皿Fisher Scientific14-955-129容量 4.5 mL
透射电镜载网Ted Pella, Inc.1GC50PELCO 中心标记载网，50 目，直径 3.0 mm，铜网
二水柠檬酸三钠Millipore SigmaS1804
醋酸铀酰Polysciences, Inc.21447-25

参考文献

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动态光散射透射电子显微镜琼脂糖凝胶阻滞内体逃逸pH响应性聚合物胞质递送基因沉默实验
中性电荷、pH响应性聚合物纳米颗粒的制备及其用于细胞质siRNA递送
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