方法文章

用于细胞质 siRNA 传递的带电反应性聚合物纳米粒子的制备

DOI：

10.3791/59549

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2019年5月2日

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of Mississippi, 2Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi, 3Biomedical Engineering Program, University of Mississippi

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

介绍了制备和表征含中子、ph 响应的 siRNA 纳米粒子的物理化学特性和生物活性的方法。讨论了成功的 siRNA 纳米胺的标准, 如大小、形态、表面电荷、siRNA 负载和基因沉默。

摘要

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SiRNA 作为靶向分子医学的成功取决于它对病理组织内细胞的有效细胞质传递。用 siRNA 治疗以前 "不可吸毒" 的肝病目标的临床成功已经取得。然而, 有效的肿瘤 siRNA 传递需要额外的药代动力学设计考虑, 包括长循环时间, 逃避清除器官 (如肝脏和肾脏), 以及肿瘤的渗透和保留。在这里, 我们描述了聚合物纳米粒子的制备和体外物理化学生物学特性, 设计用于高效 siRNA 传递, 特别是非肝组织, 如肿瘤。SiRNA 纳米颗粒是通过 siRNA 和多聚二块共聚物 (乙二醇-b-[2-(二甲基氨基) 甲基丙烯酸乙酯) (peg-db) (聚乙二醇-db) (聚乙二醇-db) 制备的聚离子复合物 ((即 siRNA 被隔离在多聚核中, PEG 形成亲水性、含中子电晕。此外, DB 阻滞成为膜溶解作为囊泡的内皮溶酶体途径酸化 (< pH 6.8), 触发内染色体逃逸和细胞质传递 siRNA。介绍了分析 siRNA 纳米粒子的大小、表面电荷、粒子形态和 siRNA 负载等物理化学特性的方法。以荧光素酶为模型基因, 测定了 siRNA 纳米粒子的生物活性, 并进行了快速、高通量的基因沉默检测。通过这些初步测试的设计 (如基于 Peg-dbs 的多指) 被认为适合转换为评估 siRNA 输送到肿瘤或其他病理部位的临床前动物研究。

引言

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由于 sirna 抑制了蛋白质从 mrna 序列中的转化, 理论上可以用于药物治疗所有已知的疾病1,2,3,4,5。然而, sirna 在医学中的应用受到 sirna分子 6,7的综合不良药代动力学特性的限制。静脉注射时, sirna 通过肾脏迅速清除, 并被核酸酶8, 9 降解。由于其巨大的体积和负电荷, siRNA 不能进入细胞或逃避内皮溶酶体通路, 以访问存在于细胞溶胶 10,11,12中的 rna 诱导沉默复合体 (risc), 13岁因此, 广泛的努力集中在 siRNA 交付战略....

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方案

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1. 西门子的制备和表征

  1. si-NP 制剂
    1. 将聚合物溶解在 10 mM 柠檬酸缓冲液 (pH 4.0) 中 3.33 mg/mL。聚合物可以首先在乙醇中的10倍浓度下溶解, 以确保溶解。
      注: 聚合物可以在较低的浓度下溶解, 但在浓度高于 3.33 Mg\ ml 的情况下使用可以防止均匀的 NP 形成。
    2. 加入 siRNA (直径为50μm), 使 n +:P-比率为 10.通过移液将聚合物和 siRNA 溶液彻底混合, 孵育30分钟。N+:P-比率表示聚合物上的正电荷胺基团的数量与 sirna 上的负电荷磷酸盐基团的数量, 并通过以下公式计算:
      figure-protocol-1
      其中, mol pol 是聚合物的摩尔量, RU 胺是每种聚合物的正电荷胺的重复单位数, mol siRNA 是 siRNA 的摩尔量, 而 bp siRNA 是每个 siRNA 分子的碱基对数。
    3. 加入5倍的过剩 10 mm 磷酸盐缓冲液 (pH 值 8.0), 通过移液或倒置管轻轻混合。为了确认最终的 pH 值是中性的 (~ 7.2-7.5), 将 sice-np 溶液的液滴10Μl 放在....

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结果

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有效的 sinp 在体内 Srna 传递的一些基本特征是适当的大小 (约 20-200 nm 直径)、siRNA 包装和基因沉默的生物活性。虽然这不是一个详尽无遗的清单 (如讨论中所述), 但在考虑进一步测试某一提法之前, 应确认这些基本特征。

图 2说明了在配方时 si-NP 尺寸和表面电荷的特性。DLS 和 TEM 被用作观察 si-NP 尺寸 (两者)、多分散性 (DLS) 和形态学 (TEM) 的补充方法。DLS 测量表明, si-NP 1 的平均直径为 35 nm, 单峰分布由单个峰值的存在表示, 而较低的分散性表现为相对较窄的峰值宽度 (图 2a)。透射电镜测量证实了 DLS 的尺寸测量, 表明存在一个均匀的 sinps 种群, 并揭示了西门子的球状形态 (图 2C

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讨论

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这里描述的硅-nps 是由阴离子 siRNA 和阳离子聚合物与聚离子复合物 (聚多层) 的静电结合而成的。PEG-DB 聚合物的静态络合促进了 Peg-db 聚合物的阳离子复合 (4.0)。在 pH 值4.0 时, DMAEMA 具有很高的质子化作用, 因此 DB 块的电脉冲很高。这确保了聚合物作为 unimers 溶解在溶液中, 而不是形成胶束, 并且数据库复合体高效率地与 siRNA。随后, 溶液的 pH 值调整为中性 (pH 7.4), 导致 DB 块的 "疏水化"、胶束的形成, 以及复合 sirna 在所产生的多面体核心中的夹入。这些多孔被设计成 peg 在 DB/siRNA 核周围形成亲水的惰性外壳, 从而产生中性表面电荷, 这是系统给药所必需的。聚合物化学和多普勒斯形成过程如图 1所示。

对 si-NPs 的严格物理化学表征对于确定配方是否适合于生物测试至关重要。尺寸、表面电荷和颗粒形状的形态都是影响生物性能的重要参数。对于肿瘤的系统分娩, si-NP 大小应在直径为

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披露

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作者没有透露潜在的利益冲突。

致谢

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作者感谢 Craig Duvall 博士和 Rebecca Cook 博士为开展这项研究提供了数据和实验室资源。作者感谢 Vanderbilt 纳米科学与工程研究所 (VINSE) 获得 DLS 和 TEM (NSF EPS 1004083) 仪器。作者感谢国家科学基金会支持研究生研究奖学金计划 (NSF#1445197)。提交人感谢国家卫生研究院的财政支持 (NIH R01 EB019409)。提交人感谢国防部国会指导医学研究计划提供的财政支持 (DOD CDMRP OR130302)。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.45 μm 孔径针式过滤器Thermo Fisher ScientificF25133直径 17 mm，PTFE 膜
0-14 pH 试纸Millipore SigmaP4786
10x TAE 缓冲液Thermo Fisher Scientific/InvitrogenAM9869
6-7.7 pH 试纸Millipore SigmaP3536
96 孔黑色壁板Corning3603经组织培养处理的
琼脂糖粉Thermo Fisher Scientific/Invitrogen16500
柠檬酸一水合Millipore SigmaC1909
磷酸氢钠二水合Millipore Sigma71643
D-荧光素 ThermoFisher Scientific88294单钾盐
DMEMGibco11995065高葡萄糖和丙酮酸
乙醇Millipore Sigma459836
溴化乙锭Thermo Fisher Scientific/Invitrogen15585011
FBSGibco26140079
上样染料Thermo Fisher Scientific/InvitrogenR0611
荧光素酶 siRNAIDTN/A反义链序列：GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC
AAUUGUU
Sense 链序列：CAAUUGCACU
GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA 碱基
MDA-MB-231 / 荧光素酶 （Bsd） 稳定细胞GenTarget IncSC059-BSD素酶表达细胞被起诉以评估 si-NP 生物活性
磷酸二氢钠一水合Millipore SigmaS9638
斑块状 siRNAIDTN/反义链序列：AUACGCGUAUU
AUACGCGAUUAACGAC
Sense 链序列：CGUUAAUCGCGUAUAAUAC
GCGUA*T* *DNA 碱基
方形聚苯乙烯比色皿Fisher Scientific14-955-1294.5 mL 容量
TEM 网格Ted Pella， Inc.1GC50PELCO 中心标记网格，50 目，外径 3.0 mm，
酸三钠铜二水合Millipore SigmaS1804
乙酸铀酰Polysciences， Inc.编号：21447-25
物 物 表达荧光素酶的细胞 荧光物 柠檬物

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  2. Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mam....

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标签

pH

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