本文介绍了一种从小鼠锁骨下静脉采集血液样本的实验方案。
本文内容
摘要
摘要
小鼠是研究人类疾病和人类健康最重要的哺乳动物模型。然而，在科研工作中从小鼠采集血样具有挑战性。当需要少量血样时，尾部采血是一种常用方法。若需要大量血液，则可考虑采用眼眶动脉采血，但该方法存在伦理问题。此前，我们已证实通过锁骨下静脉穿刺从小鼠采集血样的可行性和安全性，本文进一步探讨该方法是否适用于小鼠。我们报道，该方法在小鼠采血中是安全且实用的。通过锁骨下静脉穿刺从小鼠采血可成为日常科研工作中一种便捷的采血方法。
引言
从小鼠采集血液样本是大多数研究实验室中的基本操作。当所需样本量少于 100 µL 时，传统的小鼠采血方法为断尾法1。然而，若在非终末时间点需要采集超过 100 µL 的血液，则最常考虑采用眶后静脉丛采血、下颌下静脉采血或颏下静脉采血技术2。在某些情况下，也可通过外科手术切口进行颈静脉插管作为替代方法3。
然而，上述方法对小鼠具有伤害性。据我们所知，由于存在并发症的潜在风险，眶后采血法尚未被广泛接受4,5。手术相关创伤不仅发生在可见区域6,7，还可能深入眼眶内部6。此外，下颌下采血具有较强应激性8，且可能伴随过度出血2,9。基于我们先前的研究10,11，本文介绍一种从小鼠锁骨下静脉采血的新策略。本文将对该技术的安全性、可行性以及所获得的血量进行阐述和讨论。
方案
本研究经中南大学湘雅二医院（中国长沙）动物研究伦理委员会批准。论文撰写遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南12。
1. 材料与动物
- 准备所需材料：75% 乙醇、胶带、脱毛剂、2 mL 离心管、连接针头（26G）的 1.0 mL 注射器、电子天平、肝素和生理盐水（见材料表）。
- 实验动物：准备 10 只昆明小鼠，6–8 周龄，体重 21.6–28.3 g（见材料表）。动物饲养和使用应遵循《实验动物护理和使用指南》13 的规定。
2. 麻醉与动物体位固定
- 称重小鼠以计算所需麻醉剂的剂量。
- 通过腹腔注射戊巴比妥钠（60 mg/kg）诱导全身麻醉14（图1）。在操作开始时，于眼部涂抹无菌润滑眼膏，以防止暴露的眼睛受损。
注意：当小鼠对足底回缩反射、尾部夹捏或腹部皮肤夹捏测试无运动反应时，表明已达到充分麻醉状态。 - 将小鼠仰卧置于手术台上，距离台边缘2-4 cm，以便进行静脉穿刺（图2）。按照图2所示，将四肢固定于舒适位置。整个操作过程中无需气管插管或机械通气。
- 用棉签在锁骨下区域涂抹脱毛剂。
- 三分钟后，用湿润的棉签擦洗脱毛剂，以去除毛发及可见污物。
- 用75%乙醇对锁骨下区域进行消毒，随后用干净纱布擦干。
3. 锁骨下静脉穿刺与采血
- 用手指确定锁骨和胸骨上窝的位置。
- 在锁骨中点附近并紧靠其下方找到穿刺点。将左手食指置于穿刺点外侧，以固定皮肤和皮下组织（图3）。
- 将针头向上并向头侧方向朝胸骨上窝推进。一旦针头进入皮下组织，将右手无名指后移以形成负压（图3）。
注意：此步骤中，操作者右手的位置应略低于操作台面，使针头向上并高于水平面移动。因此，动物应放置在台面边缘附近。 - 将注射器向前推进3-4 mm，若无血液流入注射器则停止前进。然后缓慢回拉注射器，同时保持其内部负压。大多数情况下，回拉时血液会进入注射器。
- 一旦血液进入注射器，固定注射器并持续保持负压，直至收集到所需体积（200 µL）的血液。
- 采血完成后，拔出穿刺针，用棉签轻压穿刺部位1-2分钟以止血，随后将小鼠放回笼中。
注意：偶尔可能在首次尝试时未能成功采得血液。此时可调整针头方向至外侧，并重复步骤3.3–3.5。若连续3次尝试均失败，则换至对侧操作。 - 将血液样本转移至肝素抗凝管中。
4. 小鼠恢复
- 在戊巴比妥麻醉生效期间，通过提供热支持以加快恢复，直至小鼠恢复活动。
结果
我们在10只昆明小鼠（雄性 n = 5，雌性 n = 5，体重 25.4 ± 2.0 g）中重复了该操作。右侧操作成功9次。1例在右侧经过3次尝试后失败，随后在左侧成功采血。操作时间（从穿刺至获得所需血量）为35–126秒（平均68.4 ± 26.4 s）。采血量设定为约200 µL（平均203 ± 11.6 µL）。采血在1至4次尝试内均获得成功。其中2只小鼠首次尝试即成功，1只小鼠在4次尝试后成功，其余小鼠需2–3次尝试。所有数据见Table 1。所有动物在采血后均存活，并于30分钟内恢复。所有观察指标在性别间均无显著差异（Table 1）。
图 1：通过腹腔注射实施全身麻醉请点击此处查看本图的放大版本。
图 2：小鼠的仰卧位。 注意小鼠边缘与垫片之间的距离为 2–4 cm。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：穿刺部位及操作者手部姿势。注意右手无名指后移以形成负压。左手置于穿刺部位侧方，用于固定皮肤及皮下组织。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：锁骨下静脉、锁骨及胸骨上窝的位置。 锁骨下静脉走行于锁骨下方，并在胸骨上窝下方汇入上腔静脉。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：操作过程中血管壁与针头之间的关系。（A）当针头向前推进时，锁骨下静脉的管壁相互贴附，因此无法抽出血液。（B）当针头向后回撤时，管壁彼此分离，此时可抽出血液。请点击此处查看该图的放大版本。
| 变量 | 总计 (n=10) | 雄性 (n=5) | 雌性 (n=5) | P 值 |
| 体重 (g) | 25.3 ± 2.2 | 25.3 ± 3.0 | 25.4 ± 1.3 | 0.926 |
| 血容量 (μL) | 203.0 ± 11.6 | 208 ± 13.0 | 198 ± 8.4 | 0.187 |
| 时间过程 (s) | 68.4 ± 26.4 | 70.6 ± 35.1 | 66.2 ± 18.0 | 0.809 |
| 回缩次数 | 2.3 ± 0.9 | 2.4 ± 1.1 | 2.2 ± 0.8 | 0.760 |
| 所有观察参数均无显著性别差异，P 值均 >0.05。 | ||||
表1：两性之间观察到的参数
讨论
本报告是对先前关于通过锁骨下静脉穿刺在大鼠中采血的研究的延伸11。由于小鼠是目前最常用的实验动物，因此验证该技术是否同样适用于小鼠具有重要意义。主要挑战来自于小鼠锁骨下静脉相对较小的直径。
在本研究中，我们发现小鼠锁骨下穿刺是一种可行且可靠的采血方法。与传统的尾静脉剪切或眼眶采血等方法相比，该方法不存在伦理问题。所有动物在采集约 200 µL 血液后均存活，无需补充液体，并可继续用于后续实验研究。理论上，每次采血总量不应超过循环血量的 10%，成年动物的总血容量为 55 至 70 mL/kg 体重5。本研究所用小鼠体重为 21.6–28.3 g，其最大采血量应约为 200 µL。因此，我们设定每只小鼠的采血量约为 200 µL。本报告的主要局限性在于未能测量血压、心率及其他应激参数。
充分的全身麻醉是确保穿刺成功的关键问题之一。在穿刺过程中，小鼠应保持安静，以避免针头损伤血管的风险。我们发现，以60 mg/kg剂量使用戊巴比妥钠进行全身麻醉可达到理想的麻醉深度。该药物的缺点是恢复时间相对较长（平均约30分钟）。在一些机构中，由于异氟烷吸入麻醉的恢复时间较短，可考虑将其作为替代麻醉方案15。
锁骨下静脉的位置如图4所示。由于该静脉管壁较薄且管内压力较低，在进针过程中，针尖的压力可导致锁骨下静脉的前、后壁相互贴附（图5A）。当缓慢回抽注射器活塞时，贴附的管壁会自发分离，针尖即可进入血管真实腔隙，血液在持续负压作用下流入注射器内（图5B）。使用真空采血系统16也可能有利于血液采集。由于小鼠锁骨下静脉直径相对较小，即使经验丰富的操作者也可能出现穿刺失败。对于初学者，我们建议先参考文献11报道的方法进行大鼠锁骨下静脉穿刺。在大鼠上成功完成数次穿刺操作后，小鼠锁骨下静脉穿刺的成功率可显著提高。务必确保穿刺的确切位置位于锁骨中点稍偏尾侧。针尖向上并向胸骨上窝头侧方向进针，是保证穿刺成功的关键要点。
总之，锁骨下静脉穿刺是小鼠采血的一种安全且有效的方法。除了尾静脉切断和眶后静脉丛采血外，该方法可行、安全，适用于小鼠在多个时间点进行的观察性研究。
致谢
本工作受到国家自然科学基金（编号：81670269、81500355 和 81500226）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.0 mL 注射器 | 山东威高集团医用高分子制品股份有限公司（中国山东威海） | 20163151593 | |
| 75% 乙醇 | 中南大学湘雅二医院药学部 | 中南大学湘雅二医院药学部制备 | |
| 胶带 | 3M Deutschland GmbH（德国卡门） | 1534-1 | |
| 帆布手套 | 用于麻醉 | ||
| 电子天平 | 中国广东省东莞市胜恒电子有限公司 | KP-3000 | |
| 脱毛剂 | 中国广东省广州市法国伊莎化妆品有限公司 | 8281744 | |
| 肝素（使用浓度 10 U/mL，2 mL，12500 IU） | 中国江苏省南京市南京新百药业有限公司 | H32025851 | |
| 小鼠 | 湖南斯莱克实验动物有限公司（中国湖南省长沙市） | 昆明种小鼠 | |
| 针头，26G，0.45 mm × 16 mm | 山东威高集团医用高分子制品股份有限公司（中国山东威海） | 20163151593 | |
| 戊巴比妥钠（使用溶液 1%） | 默克 | P-010-1ML | |
| 生理盐水，100 mL | 湖南科伦制药有限公司（中国湖南岳阳） | H43020454 | |
| 统计软件 | 国际商业机器公司 | SPSS Statistics 25 | |
| 2 mL 离心管 | 湖北金星科技 &中国湖北省武汉市安普与发展有限公司 | MCT-150-C |
参考文献
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