本文介绍一种针对皮肤活检切片的游离式间接免疫荧光检测方案，可用于鉴定与帕金森病相关的α-突触核蛋白的疾病特异性构象变异体，以及周围神经系统中的多种蛋白质。
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本文内容
摘要
摘要
迄今为止，大多数神经退行性疾病仅能通过死后组织病理学检查获得明确诊断。对于帕金森病（PD），诊断仍然仅依赖于疾病进展到后期才出现的运动功能障碍临床体征，而此时大部分多巴胺能神经元已经丧失。因此，迫切需要一种生物标志物，能够在疾病早期或发病风险阶段识别出患者。近年来，皮肤活检已被证明是研究和诊断周围神经疾病（如小纤维神经病变）的优秀工具。有趣的是，通过皮肤活检已在帕金森病患者中发现小纤维神经病变以及α-突触核蛋白（αSyn）的神经沉积物。事实上，皮肤活检具有显著优势：操作简便、易于获取、微创且无痛，能够实现对易受病理影响的周围神经组织进行分析。此外，在同一患者的随访过程中可重复进行皮肤活检，从而有助于研究其与疾病进展之间的纵向相关性。我们建立了一种标准化且可靠的实验方案，用于检测帕金森病患者皮肤神经纤维中αSyn聚集体的存在。该方案包括短暂的固定步骤、冷冻切片，随后使用两种特异性抗体进行游离漂浮式免疫荧光双标染色：抗蛋白基因产物9.5（PGP9.5）抗体用于标记皮肤神经纤维，抗5G4抗体用于检测αSyn聚集体。该方案具有良好的通用性、高灵敏度且操作简便，也可用于靶向检测皮肤神经中其他感兴趣的蛋白质。成功标记αSyn聚集体是推动皮肤活检作为帕金森病生前组织病理学诊断工具的重要一步。
引言
皮肤活检作为神经系统疾病领域的重要诊断和研究工具，已受到高度重视1。事实上，表皮和真皮中含有丰富的躯体感觉神经纤维（有髓和无髓神经纤维）、伤害性游离神经末梢、感觉受体，以及汗腺、血管、皮脂腺和立毛肌的自主神经支配2。
20世纪中期th 世纪以来，PGP9.5抗体免疫组织化学检测体系的建立，使得哺乳动物皮肤表皮广泛神经支配的证据得以呈现3PGP9.5 是一种羧基末端水解酶，均匀分布于中枢和周围神经系统（PNS）的轴突中。该抗体的可获得性不仅有助于阐明皮肤中 PNS 的形态与解剖结构，也推动了与 PNS 相关疾病的研究。3,4皮肤活检有助于定义一种新的临床实体：小纤维神经病。多个国际研究团队已证实表皮内神经纤维的丢失与小纤维神经病的症状/体征之间存在关联。5 通过皮肤活检分析，并为神经形态测量提供了标准化方案以及可用于临床实践的正常参考值6,7,8.
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方案
该方案已获得州伦理委员会批准，所有参与受试者均已签署书面知情同意书。
1. 皮肤活检样本采集
- 由合格医师在适当的临床环境中进行皮肤活检。
- 选择进行皮肤活检的部位，并用酒精棉签清洁该区域。
- 使用1 cc的2%利多卡因制备麻醉液。
- 将针头与皮肤表面平行，皮下注射局部麻醉剂。
- 确认麻醉效果后，取3 mm一次性活检钻头，施加旋转并轻柔向下的压力，旋转穿透表皮和真皮，直至达到皮下脂肪层。
- 退出钻头。
- 使用一次性镊子轻轻提起皮肤组织柱。
- 用剪刀在脂肪组织水平处剪断标本基部，将其取出。
- 将标本放入含有10 mL高碘酸-赖氨酸-对甲醛（PLP）固定液的试管中。
- 对活检部位进行消毒，并覆盖粘性创可贴。
2. 组织固定与保存
- 配制新鲜的PLP固定液（见表1）。
- 皮肤活检样本采集后，立即将其浸入含有10 mL PLP固定液的离心管中，于4 °C过夜（O/N）孵育。
- 次日，在通风橱内小心移除PLP固定液，于同一离心管中用5 mL 0.1 M Sorensen’s缓冲液洗涤活检组织3次，每次5分钟（表1....
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结果
按照所述步骤（图1），我们在帕金森病（PD）患者支配自主神经结构的皮肤神经束中检测到由5G4抗体标记的αSyn聚集体。α-突触核蛋白沉积物的形态表现为沿皮肤神经轴突分布的点状信号（图2）。事实上，在19例PD患者和17例对照者的皮肤活检中（取材于三个解剖部位：颈部、大腿和小腿远端），应用该方案发现：与健康对照组相比，5G4抗体的敏感性为81%，特异性为86%；而P-αSyn的敏感性为56%，特异性为100%19。
特别是，我们发现5G4和P-αSyn阳性沉积物主要存在于汗腺周围的神经中，也见于立毛肌、小血管以及表皮下和真皮神经丛，但从不出现于表皮内神经纤维中。
通常，在汗腺腺腔内可观察到一种非特异性信号，该信号可能被误判为5G4/ P-αSyn阳性。此类信号呈点状、球形，很可能源于腔内自体荧光物质，这一点已在未使用一抗和二抗的阴性技术对照中得到证实（
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讨论
我们描述了一种用于帕金森病（PD）诊断的游离式皮肤活检免疫荧光检测方法：该方法利用抗PGP9.5抗体（一种全轴突标志物）与抗5G4抗体（一种构象特异性抗体，可识别α突触核蛋白αSyn的聚集形式）进行双重免疫染色。
皮肤活检在帕金森病（PD）以及可能的其他蛋白质构象病诊断中的显著优势包括：1）通过一种轻度侵入性技术直接获取易受疾病影响的神经组织，从而对α-突触核蛋白（αSyn）聚集体的检测灵敏度预期优于血液或脑脊液等生物液体；2）能够检测并定量表皮及自主神经纤维密度，以此作为神经变性的评估指标；3）可在患者随访过程中重复进行皮肤活检，以纵向研究其与疾病进展的相关性。
本文提出的方案快速、通用，且关键步骤较少。首先，组织固定必须正确进行，否则高水平的自发荧光将掩盖特异性信号，从而妨碍数据的准确分析。固定液中的多聚甲醛应新鲜配制，并准确调节pH至7.4。必须严格避免甲酸的形成，因其可能损伤活检组织。在储存和切片前，如果活检组织的致密性提示固定不充分，应再次用Sorensen缓冲液冲洗，并在4 °C下用PLP溶液重新孵育过夜（O/N）.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Parkinson Schweiz和ABREOC（圣卡洛医院企业科学研究咨询委员会）为本研究提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5G4（抗人α突触核蛋白 5G4） | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | 小鼠单克隆抗体 |
| AlexaFluor 488 羊抗兔 IgG | Invitrogen | 1971418 | 2 mg/mL |
| AlexaFluor 594 羊抗小鼠 IgG | Invitrogen | 1922849 | 2 mg/mL |
| 磷酸氢二钠溶液 | Merk Millipore | 106586 | |
| 乙二醇 | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-赖氨酸盐酸盐 | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| 多聚甲醛 | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | 兔多克隆抗体 |
| 氯化钠 | Sigma | S3014 | |
| 磷酸二氢钠一水合物 | Merck Millipore | 106346 | |
| 高碘酸钠 | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | 封片剂 |
参考文献
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist's Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. Skin. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al.
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重印与许可
