本文介绍一种针对皮肤活检切片的游离式间接免疫荧光检测方案，可用于鉴定与帕金森病相关的α-突触核蛋白的疾病特异性构象变异体，以及周围神经系统中的多种蛋白质。
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本文内容
摘要
摘要
迄今为止，大多数神经退行性疾病仅能通过死后组织病理学检查获得明确诊断。对于帕金森病（PD），诊断仍然仅依赖于疾病进展到后期才出现的运动功能障碍临床体征，而此时大部分多巴胺能神经元已经丧失。因此，迫切需要一种生物标志物，能够在疾病早期或发病风险阶段识别出患者。近年来，皮肤活检已被证明是研究和诊断周围神经疾病（如小纤维神经病变）的优秀工具。有趣的是，通过皮肤活检已在帕金森病患者中发现小纤维神经病变以及α-突触核蛋白（αSyn）的神经沉积物。事实上，皮肤活检具有显著优势：操作简便、易于获取、微创且无痛，能够实现对易受病理影响的周围神经组织进行分析。此外，在同一患者的随访过程中可重复进行皮肤活检，从而有助于研究其与疾病进展之间的纵向相关性。我们建立了一种标准化且可靠的实验方案，用于检测帕金森病患者皮肤神经纤维中αSyn聚集体的存在。该方案包括短暂的固定步骤、冷冻切片，随后使用两种特异性抗体进行游离漂浮式免疫荧光双标染色：抗蛋白基因产物9.5（PGP9.5）抗体用于标记皮肤神经纤维，抗5G4抗体用于检测αSyn聚集体。该方案具有良好的通用性、高灵敏度且操作简便，也可用于靶向检测皮肤神经中其他感兴趣的蛋白质。成功标记αSyn聚集体是推动皮肤活检作为帕金森病生前组织病理学诊断工具的重要一步。
引言
皮肤活检作为神经系统疾病领域的重要诊断和研究工具，已受到高度重视1。事实上，表皮和真皮中含有丰富的躯体感觉神经纤维（有髓和无髓神经纤维）、伤害性游离神经末梢、感觉受体，以及汗腺、血管、皮脂腺和立毛肌的自主神经支配2。
20世纪中期th 世纪以来，PGP9.5抗体免疫组织化学检测体系的建立，使得哺乳动物皮肤表皮广泛神经支配的证据得以呈现3PGP9.5 是一种羧基末端水解酶，均匀分布于中枢和周围神经系统（PNS）的轴突中。该抗体的可获得性不仅有助于阐明皮肤中 PNS 的形态与解剖结构，也推动了与 PNS 相关疾病的研究。3,4皮肤活检有助于定义一种新的临床实体：小纤维神经病。多个国际研究团队已证实表皮内神经纤维的丢失与小纤维神经病的症状/体征之间存在关联。5 通过皮肤活检分析，并为神经形态测量提供了标准化方案以及可用于临床实践的正常参考值6,7,8.
近年来，大量证据表明，以中枢神经系统中错误折叠蛋白积聚为特征的神经退行性疾病是多系统性疾病9。事实上，帕金森病（PD）的特征是α-突触核蛋白（αSyn）在黑质（substantia nigra）多巴胺能神经元中的积聚，但已有研究证实，αSyn及其病理形式——磷酸化αSyn（P-αSyn）——也可在外周组织中被检测到。胃肠道黏膜10、唾液腺11、围绕汗腺和立毛肌的皮肤自主神经纤维12,13,14均显示出对致病性αSyn的免疫反应性，这与Braak假说一致，该假说引人注目地提出，αSyn病理可能早在其在脑内积聚之前，就已在周围神经系统（PNS）中开始15。此外，在快速眼动睡眠行为障碍（REM Behavior Disorders）患者（被认为是帕金森病的前驱期）的皮肤神经中也已证实存在p-αSyn16,17，因此皮肤中病理性αSyn可被视为突触核蛋白病一种有前景的早期外周组织病理学标志物。
既往研究已证实帕金森病（PD）与小纤维神经病变相关，且表皮内神经纤维密度可反映疾病的进展程度18,19。因此，皮肤活检是研究帕金森病神经退行性变以及建立生前组织病理学诊断的有用工具。事实上，皮肤活检具有易于获取且创伤性极小的优势，能够对易受病理影响的神经组织进行分析。此外，在患者随访过程中可重复进行皮肤活检，从而有助于研究其与疾病进展之间的纵向相关性。
在我们的实验室中，通过使用 PGP9.5 与构象特异性的单克隆抗体 5G4 进行双重免疫染色，后者可识别包括小聚集体在内的疾病特异性形式的 αSyn20,21，我们成功证实了皮肤神经中存在 αSyn 聚集体，并展现出较高的诊断效能19。在构象疾病中，皮肤活检的免疫荧光分析因其能够同时检测蛋白质聚集体并评估体内神经变性程度，已成为一种极具前景的生物标志物来源。本文随后将介绍一种简便且通用的皮肤活检处理及游离漂浮免疫荧光染色操作流程，用于检测 αSyn 聚集体。此外，该方案亦可适用于针对皮肤周围神经系统中表达的其他任何目标蛋白的研究。
以下研究方案已用于评估通过皮肤活检检测帕金森病（PD）周围神经系统（PNS）中α-突触核蛋白（αSyn）聚集物分析的诊断价值19。PD的纳入标准包括：根据英国脑库诊断标准确诊的明确临床诊断，病程至少3年，无家族史，且病史中无显著认知障碍或主要自主神经功能障碍症状。排除标准包括已知的神经病变病因（如糖化血红蛋白异常、肌酐异常、维生素B12缺乏、促甲状腺激素（TSH）异常、血清免疫固定电泳异常、HIV、丙型肝炎病毒（HCV）、梅毒及伯氏疏螺旋体感染）。每位受试者在临床症状较重的一侧身体的三个解剖部位（C8皮节水平的颈部、膝上10 cm的大腿部位、外踝上方10 cm的小腿部位）接受直径为3 mm的皮肤活检。总体而言，本方案主要涉及皮肤活检样本的处理，以及游离漂浮免疫荧光染色与分析步骤。因此，该方案可经适当调整后用于检测皮肤组织中其他目标蛋白。
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方案
该方案已获得州伦理委员会批准，所有参与受试者均已签署书面知情同意书。
1. 皮肤活检样本采集
- 由合格医师在适当的临床环境中进行皮肤活检。
- 选择进行皮肤活检的部位，并用酒精棉签清洁该区域。
- 使用1 cc的2%利多卡因制备麻醉液。
- 将针头与皮肤表面平行，皮下注射局部麻醉剂。
- 确认麻醉效果后，取3 mm一次性活检钻头，施加旋转并轻柔向下的压力，旋转穿透表皮和真皮，直至达到皮下脂肪层。
- 退出钻头。
- 使用一次性镊子轻轻提起皮肤组织柱。
- 用剪刀在脂肪组织水平处剪断标本基部，将其取出。
- 将标本放入含有10 mL高碘酸-赖氨酸-对甲醛（PLP）固定液的试管中。
- 对活检部位进行消毒，并覆盖粘性创可贴。
2. 组织固定与保存
- 配制新鲜的PLP固定液（见表1）。
- 皮肤活检样本采集后，立即将其浸入含有10 mL PLP固定液的离心管中，于4 °C过夜（O/N）孵育。
- 次日，在通风橱内小心移除PLP固定液，于同一离心管中用5 mL 0.1 M Sorensen’s缓冲液洗涤活检组织3次，每次5分钟（表1）。
- 弃去Sorensen’s缓冲液，加入5 mL冷冻保护液，于4 °C过夜（O/N）孵育。
- 若在一星期内使用冷冻切片机进行切片，可将组织置于4 °C保存；若在3个月内切片，应将组织保存于-20 °C；若需长期保存，则应将组织包埋于冷冻模具中（见步骤3.2–3.4），并储存于-80 °C。
3. 使用冷冻切片机切割组织
- 将冷冻切片机设定在 -20 °C。
- 取一个冷冻模具，并用冷冻包埋介质充满模具，避免产生气泡。
- 使用镊子将活检组织浸入冷冻包埋介质中，使组织的长轴（表皮-真皮方向）与冷冻模具底部平行。
- 用液氮迅速冷冻样品，获得含有正确取向活检组织的固体冷冻包埋介质块。
- 将样品放入冷冻切片机中，静置 30 分钟，使活检组织适应环境温度。
- 将样品固定在冷冻切片机上，切出 50 µm 的切片。
- 借助小刷子，将冷冻切片转移至 96 孔板中，每孔预先加入 200 µL 防冻液，每孔放置一片切片。
- 在 -20 °C 下保存。
注意：若无需分析整个活检组织，可仅进行部分切取。在此情况下，切下的切片应保存于 -20 °C，剩余的活检组织则应保存于 -80 °C，以延长保存时间。
4. 免疫荧光染色
- 用 100 µL 洗涤液填充 96 孔板。
- 将待分析的组织切片从储存板转移至含有洗涤液的新板中，每孔放置 1 片（每位患者每个解剖部位 4 片：通常每位患者共 12 片）。
- 室温（RT）下在洗涤液中孵育切片 10 分钟。将切片转移至另一含有相同溶液的孔中，重复洗涤一次。
- 将切片转移至含有 100 µL 封闭液的新孔中，室温孵育至少 90 分钟，最长不超过 4 小时。
- 在工作液中稀释一抗：抗 PGP9.5 抗体（兔多克隆抗体，1:1000）和抗 5G4 抗体（小鼠单克隆抗体，1:400）。
- 将切片转移至含有 100 µL 一抗工作液的新孔中，室温避光孵育过夜（O/N）。
- 同第 4.3 步，用 100 µL 洗涤液在室温下洗涤切片 2 次，每次至少 10 分钟。
- 在工作液中稀释二抗（与不同荧光染料偶联）：用于检测 PGP9.5 的 Goat anti-Rabbit 抗体（1:700）和用于检测 5G4 的 Goat anti-Mouse 抗体（1:700）。
- 将切片转移至含有 100 µL 二抗工作液的新孔中，室温孵育 90 分钟。从此时起，用铝箔包裹 96 孔板，避免荧光染料标记的二抗发生荧光淬灭。
- 同第 4.3 步，用 100 µL 洗涤液在室温下洗涤切片 2 次，每次至少 10 分钟。
- 将切片转移至含有 100 µL DAPI（以 PBS 1x 稀释至 1:5,000）的新孔中，室温孵育 5 分钟。
- 同第 4.3 步，用 100 µL 洗涤液在室温下洗涤切片 2 次，每次至少 10 分钟。
- 将切片正确放置于载玻片上，避免折叠或错位。
- 在载玻片上滴加数滴封片剂，并加盖盖玻片。
- 在使用共聚焦/荧光显微镜前，将载玻片室温避光干燥过夜（O/N）。
- 将载玻片置于适当的盒子中，于 4 °C 避光保存。若妥善保存，信号可维持约 6 个月。
注意：将切片从含有新切组织切片的 96 孔板转移至含有洗涤液的 96 孔板（第 4.1 步）时，使用小刷子辅助拾取活检组织。在将切片转移至第一孔后，每次更换孵育溶液时，均需借助该刷子在孔之间转移切片。
5. 免疫荧光成像
- 在倒置荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察切片（使用20X、40X或更高倍数的物镜，为获得最佳结果，建议在Z轴堆栈平面上以2 µm的步长连续成像）。
- 通过显微镜连接的相机获取图像。
- 使用合适的成像软件（例如ImageJ）分析切片中阳性信号的空间分布和信号强度。请按照以下步骤操作。
- 使用ImageJ软件打开文件。
- 点击图像 > 颜色 > 拆分通道，以分别分析各个颜色通道。
- 点击图像 > 堆栈 > Z轴投影，以合并多个切片图像的采集结果。
- 点击图像 > 颜色 > 合并通道，以合并同一次采集中不同颜色通道的图像。
| 防冻液 （4 °C 保存，可存放长达 6 个月） | 30% 甘油 30% 乙二醇 30% dH2O 10% 2x 磷酸盐缓冲液 |
| 封闭液 （现配） | 4% 正常山羊血清 1% Triton X-100 在洗涤液中 |
| 冷冻保护剂 （4 °C 保存，可存放长达 6 个月） | 20% 甘油 80% 索伦森溶液 |
| 磷酸氢二钠溶液 （室温保存，最长6个月） | 0.45 M 磷酸氢二钠（Na2HPO4）水溶液 在无菌瓶中过滤 |
| 赖氨酸溶液 （4 °C 保存，最长可存放 3 周） | 0.3 M L-赖氨酸单盐酸盐溶液的50% 0.1 M Sorensen 溶液 pH 7.6 的 50% pH 7.4，于无菌瓶中过滤 |
| 8% 多聚甲醛（PFA） （在通风橱中配制，4 °C 保存，可保存长达1个月） | 2.6 M PFA 溶于 dH₂O（加热至 55°C，不得超过 60°C） 以避免甲酸生成） 在无菌瓶中过滤 |
| 2× 磷酸盐缓冲液 （4 °C 保存，可存放长达 6 个月） | 6% 磷酸二氢钠（NaH2PO4）溶液 45% 磷酸氢二钠（Na2HPO4）溶液，溶于 dH₂O2O |
| PLP固定剂溶液 （在通风橱中即时配制） | 25% 多聚甲醛 8% 0.01 M 高碘酸钠 75% 赖氨酸溶液< |
| 磷酸二氢钠一水合物 （室温保存，最长6个月） | 0.52 M 一水合二氢磷酸钠（NaH2PO4·H2O）溶于去离子水 在无菌瓶中过滤。 |
| Sorensen's 溶液 （4 °C 保存，可存放长达1个月） | 2.5% 磷酸二氢钠溶液 18.7% 磷酸氢二钠溶液 pH7.6，用dH2O配制 |
| 洗涤液 （现配） | 0.25 M Trizma 碱 0.26M NaCl pH 7.6，溶于 dH₂O 中 |
| 工作溶液 （现配） | 50% 封闭液 50% 洗涤液 |
表1： 所需溶液。 本实验方案所需的溶液列表，以及配制方法的简要说明。
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结果
按照所述步骤（图1），我们在帕金森病（PD）患者支配自主神经结构的皮肤神经束中检测到由5G4抗体标记的αSyn聚集体。α-突触核蛋白沉积物的形态表现为沿皮肤神经轴突分布的点状信号（图2）。事实上，在19例PD患者和17例对照者的皮肤活检中（取材于三个解剖部位：颈部、大腿和小腿远端），应用该方案发现：与健康对照组相比，5G4抗体的敏感性为81%，特异性为86%；而P-αSyn的敏感性为56%，特异性为100%19。
特别是，我们发现5G4和P-αSyn阳性沉积物主要存在于汗腺周围的神经中，也见于立毛肌、小血管以及表皮下和真皮神经丛，但从不出现于表皮内神经纤维中。
通常，在汗腺腺腔内可观察到一种非特异性信号，该信号可能被误判为5G4/ P-αSyn阳性。此类信号呈点状、球形，很可能源于腔内自体荧光物质，这一点已在未使用一抗和二抗的阴性技术对照中得到证实（
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讨论
我们描述了一种用于帕金森病（PD）诊断的游离式皮肤活检免疫荧光检测方法：该方法利用抗PGP9.5抗体（一种全轴突标志物）与抗5G4抗体（一种构象特异性抗体，可识别α突触核蛋白αSyn的聚集形式）进行双重免疫染色。
皮肤活检在帕金森病（PD）以及可能的其他蛋白质构象病诊断中的显著优势包括：1）通过一种轻度侵入性技术直接获取易受疾病影响的神经组织，从而对α-突触核蛋白（αSyn）聚集体的检测灵敏度预期优于血液或脑脊液等生物液体；2）能够检测并定量表皮及自主神经纤维密度，以此作为神经变性的评估指标；3）可在患者随访过程中重复进行皮肤活检，以纵向研究其与疾病进展的相关性。
本文提出的方案快速、通用，且关键步骤较少。首先，组织固定必须正确进行，否则高水平的自发荧光将掩盖特异性信号，从而妨碍数据的准确分析。固定液中的多聚甲醛应新鲜配制，并准确调节pH至7.4。必须严格避免甲酸的形成，因其可能损伤活检组织。在储存和切片前，如果活检组织的致密性提示固定不充分，应再次用Sorensen缓冲液冲洗，并在4 °C下用PLP溶液重新孵育过夜（O/N）...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Parkinson Schweiz和ABREOC（圣卡洛医院企业科学研究咨询委员会）为本研究提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5G4（抗人α突触核蛋白 5G4） | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | 小鼠单克隆抗体 |
| AlexaFluor 488 羊抗兔 IgG | Invitrogen | 1971418 | 2 mg/mL |
| AlexaFluor 594 羊抗小鼠 IgG | Invitrogen | 1922849 | 2 mg/mL |
| 磷酸氢二钠溶液 | Merk Millipore | 106586 | |
| 乙二醇 | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-赖氨酸盐酸盐 | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| 多聚甲醛 | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | 兔多克隆抗体 |
| 氯化钠 | Sigma | S3014 | |
| 磷酸二氢钠一水合物 | Merck Millipore | 106346 | |
| 高碘酸钠 | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | 封片剂 |
参考文献
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist's Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. Skin. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al. Nerve endings in mammalian skin. Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).
- Wang, L., et al. Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin. Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).
- Holland, N. R., et al. Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy. Neurology. 48, 708-711 (1997).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).
- Provitera, V., et al. A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg. European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).
- Wakabayashi, K., et al. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).
- Ruffmann, C., et al. Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease. Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).
- Lee, J. M., et al. The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).
- Donadio, V., et al. Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease. Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).
- Doppler, K., et al. Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology. Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).
- Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy. Brain. 138, 2310-2321 (2015).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
- Doppler, K., et al. Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease. Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).
- Antelmi, E., et al. Skin nerve phosphorylated α-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder. Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).
- Nolano, M., et al. Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Melli, G., et al. Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).
- Kovacs, G. G., et al. Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread. Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).
- Kovacs, G. G., et al. An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology. Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).
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