本文介绍了一种实验方案，旨在利用化学遗传学工具调控移植到新生期小鼠大脑皮层中的皮层中间神经元前体细胞的活性。
本文内容
摘要
摘要
神经元发育受到环境与遗传因素复杂组合的调控。评估各因素的相对贡献是一项复杂任务，尤其在γ-氨基丁酸能皮层中间神经元（GABAergic cortical interneurons, CIs）的发育过程中尤为困难。CIs是大脑皮层中的主要抑制性神经元，在神经网络中发挥关键作用，既可调节单个锥体神经元的活动，也能调控神经元集群的振荡行为。这些细胞起源于胚胎期短暂存在的结构（内侧和尾侧神经节隆起— MGE 和 CGE）使用子宫内电穿孔方法进行高效靶向非常困难。在正常胚胎发育过程中，中间神经元前体细胞会在整合到皮层环路之前进行长距离迁移。这种强大的扩散和整合到发育中神经网络的能力，可通过将胚胎期中间神经元前体移植到出生后早期宿主皮层中加以利用。本文介绍了一种通过局灶性离体电穿孔技术对胚胎期中间神经元前体进行遗传修饰的实验方案。经过遗传改造的中间神经元前体随后被移植至出生后早期宿主皮层，在其中发育成熟为易于识别的皮层中间神经元（CIs）。该方案可使用多种遗传编码工具，或实现对中间神经元前体中特定基因表达的调控，从而研究遗传或环境因素对CIs成熟与整合的影响。
引言
神经网络的功能依赖于兴奋性投射神经元与抑制性中间神经元之间平衡的互补关系。尽管皮层中间神经元（CIs）仅占哺乳动物大脑皮层所有神经元的20%，但其数量或功能的缺陷被认为在神经发育障碍的发病机制中起关键作用1,2。研究CIs的发育过程具有挑战性，因为CIs产生于短暂存在的胚胎结构中，难以获取，并且在到达大脑皮层并发育出成熟的解剖和生理特性之前，需经历漫长的切向迁移过程3。目前已知有遗传和环境机制共同调控CIs的发育4，但研究多种因素各自贡献的相对作用已被证明十分困难。
通过分离来自神经节隆起的前体细胞并利用体外培养系统，研究人员在中枢神经系统发育研究中获得了许多重要发现5,6。这些方法的一大优势在于能够对分离出的前体细胞进行标记和遗传学改造，并详细追踪其分化过程，从而检测细胞自主性变化。然而，这些方法无法提供发育中中间神经元与活跃神经网络之间相互作用的信息。我们对这些方案进行了改进，将经过改造的前体细胞移植到出生后早期的大脑皮层中。源自胚胎期神经节隆起的中间神经元前体细胞在移植至皮层后能够存活、迁移并整合入宿主神经网络7,8。该方法已被用于减轻遗传性癫痫小鼠模型中癫痫发作的严重程度，并被认为可能成为治疗多种神经发育障碍的新疗法9,10。先前已有方案描述了在移植前使用病毒载体转导这些前体细胞的步骤11。本文所述方案同样可实现对中间神经元的遗传修饰，但无需构建病毒载体，仅需使用质粒DNA，从而显著提高了实验的灵活性。尽管有研究报道可通过子宫内电穿孔技术对尾侧神经节隆起（CGE）中的中间神经元前体细胞进行遗传修饰12，但该方法被证实极难重复。
在代表性结果部分，我们展示了该方法在移植的中间神经元前体细胞（CIs）中表达仅由设计药物激活的设计受体（DREADDs13）的应用，此方法已在我们近期发表的研究中使用14。我们表达了hM3D(Gq)，这是一种基于人源胆碱能受体CHRM3构建的工程化受体，其在不结合特异性配体氯氮平-N-氧化物（CNO）时不会影响神经元功能。给予CNO可选择性地激活表达hM3D(Gq)的细胞。我们利用该方法证明，在发育过程中，细胞自主性的短暂去极化足以阻止CIs发生凋亡14。结合不同的基因编码工具，本方案有望在中间神经元分化的不同阶段实现基因表达的上调或下调，并对细胞活动进行可视化观察或操控。
方案
动物的繁育和饲养均依照英国《动物（科学程序）法案》（1986年）进行。
注意：为构建pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP质粒，从质粒50463（Addgene）中分离出包含hM3D(Gq)序列的SalI-StuI片段，并将其插入经XhoI-EcoRV酶切的表达载体pCAGGs-RFP（由F. Guillemot惠赠）中。
1. 小鼠胚胎皮层切片的制备
- 使用适当的洗涤溶剂和70%乙醇（EtOH）水溶液（H2O）对实验设备（例如，体视显微镜）和表面（例如，实验台）进行灭菌。
- 使用已高压灭菌的解剖工具，并始终将其保存在100% EtOH中。
- 在50 mL离心管中准备三份20 mL的4%低凝胶温度琼脂糖溶液（溶于1×磷酸盐缓冲液，PBS），并保持在55 °C。
- 通过颈椎脱臼法处死妊娠13.5或14.5天（胚胎期E13.5–E14.5）的小鼠。
- 使用解剖剪刀切开妊娠小鼠腹部，取出子宫角（含胚胎），并将其置于盛有冰浴Krebs溶液（表1）的90 mm培养皿中。
- 使用一对直头精细镊子打开羊膜囊，取出胚胎并转移至新的盛有冰浴Krebs溶液的90 mm培养皿中。将小鼠胚胎脑组织（前脑、中脑、后脑）从胚胎其余部分解剖分离。
- 用镊子夹住解剖所得脑组织的后脑部位，将其转移至新的盛有冰浴Krebs溶液的90 mm培养皿中，并置于冰上保存。
- 使用防水笔在六个35 mm培养皿底部外表面的中央位置画一条直线。
- 将一份4%低凝胶温度琼脂糖/PBS溶液20 mL置于37 °C环境中预热5分钟。随后立即向两个35 mm培养皿中各倒入10 mL，并将解剖所得脑组织嵌入其中。
注意：嗅球应朝下（即朝向培养皿底部）。每个培养皿中嵌入3–4个脑组织，沿先前画好的直线排列，每两个脑组织之间保留3–5 mm间距。 - 重复步骤1.8和1.9，直至所有解剖所得脑组织均被嵌入。
- 将嵌有脑组织的琼脂糖块置于4 °C环境中，使琼脂糖充分凝固，随后将三个脑组织切割成一个大小和方向合适的整体组织块。
注意：脑组织样本边缘应保留约3 mm的琼脂糖。调整脑组织方向，使嗅球朝上。 - 将组织块粘附于切片机底座表面，使用手术刀片沿每两个脑组织之间的底部完全切割，以形成三个独立的小组织块（每个小块包含一个脑组织）。
- 使用振动切片机在冰浴Krebs溶液中将组织块切成250 μm厚的切片。
- 使用弯曲的平头微型刮铲收集仅含有内侧或尾侧神经节隆起（MGE或CGE；图1）的脑片，并将其分别转移至漂浮于最小必需培养基（MEM，表1）上的滤膜（直径13 μm，孔径8.0 µm）中，置于聚苯乙烯中心井器官培养皿（60 mm × 15 mm）内。
- 将培养皿置于37 °C、CO2组织培养孵箱中孵育1小时，随后准备进行局灶性电穿孔操作。
2. 急性脑切片电穿孔
- 开始电穿孔操作前，准备50 mL含1%琼脂糖的凝胶，并倒入100 mm的培养皿中。将琼脂糖凝胶在室温（RT）下静置约30分钟，使其充分凝固。
- 使用玻璃移液管（长度225 mm，容量2 mL）制备微小的琼脂糖柱（直径1 mm，长度10 mm），并将其转移至冰冻的Krebs溶液中。
注意：将适用于2 mL移液管的橡胶吸头连接至移液管上，通过按压吸头可将琼脂糖柱从玻璃移液管释放至Krebs溶液中。 - 使用手术刀切割两种尺寸的琼脂糖小块：一种较小的琼脂糖块用于覆盖电极表面（见下文），另一种较大的琼脂糖块将作为向脑片进行局灶性DNA注射的基础。同样将这些琼脂糖块转移至冰冻的Krebs溶液中。
- 准备局灶性注射和急性电穿孔的实验装置（图2）。
注意：进行注射所需的设备包括：1）明场解剖体视显微镜，2）气动皮升级泵注射仪，3）微操纵器，4）磁力支架，以及5）钢制底板。进行急性脑片电穿孔所需的设备包括：1）一个10 mm方形铂金培养皿电极，2）一个10 mm方形铂金盖电极，3）微操纵器，以及4）电穿孔仪。 - 局灶性DNA注射
- 配制表达载体的DNA混合物：pCAGGs-IRES-GFP（对照载体）+ pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP，每种载体浓度均为1 µg/µL，并加入快绿溶液（储存液25 mg/mL），按1/10比例稀释。
- 将拉制的玻璃微移液管（内径0.5 mm，外径1 mm）吸入10 µL上述DNA混合液，向脑片选定区域（MGE/CGE）注射少量液体（每次25–50 nL）（图1和图2）。
- 急性电穿孔
注意：电穿孔应在局灶性DNA注射后立即进行。- 将小块琼脂糖放置在培养皿电极上，并借助平头微型刮铲将琼脂糖柱固定在可移动的盖电极上。
- 将带有支撑膜的脑片转移至琼脂糖块上，并将带有琼脂糖柱的上部电极置于脑片选定区域（MGE/CGE）上方。
注意：施加125 V电压（每次脉冲5 ms，共两个脉冲，间隔500 ms）可实现有效的电穿孔（图3）。
- 电穿孔完成后，将带有支撑膜的脑片放入培养皿中，并将培养皿置于37 °C的CO2组织培养孵育箱中。
- 1小时后，将MEM培养基更换为适用于原代神经元培养的基础培养基（神经元基础培养基；表1），并将脑片继续孵育过夜，约18–24小时。
3. 细胞移植物的制备
- 检查所有脑片中电穿孔的效率。仅选择其中观察到可接受数量荧光细胞的脑片（图3）。
注意：为获得足够数量用于移植的细胞，每次实验建议电穿孔约30片脑片（见下文）。 - 在荧光解剖体视显微镜下，将每一片中选定的区域（MGE/CGE）解剖下来，并在冰冷的Krebs溶液中将组织切成小块。
- 同时，将含有900 µL神经元基础培养基的1.5 mL离心管置于37 °C水浴中预热。
- 使用P1000移液器将组织块转移至含有500 µL L15/DNase培养基的1.5 mL离心管中（该培养基由在900 µL L15培养基中加入100 µL浓度为1 mg/mL的DNase储备液于DMEM/F12培养基中制备而成）。通过轻弹管壁清洗组织块。
- 向900 µL神经元基础培养基中加入100 µL DNase（储备液浓度为1 mg/mL，溶于DMEM/F12培养基）。
- 弃去L15/DNase培养基，并将组织块重悬于步骤3.5中制备的200 µL神经元基础/DNase培养基中。
- 将P200移液器调至180 µL，轻轻吹打20–30次，机械性地解离组织块，直至获得均匀且"乳状”的细胞悬液。
- 加入200 µL神经元基础/DNase培养基（最终总体积为400 µL），并充分重悬。
- 取4 µL细胞悬液，适当稀释后滴加至血细胞计数板上。
- 在明场显微镜下检查解离效果，并计数细胞数量。
注意：若解离成功，则应观察到明亮（存活）的单个细胞，而非细胞团块。 - 将步骤3.8所得细胞悬液在室温下以1,000 rpm离心5分钟，随后弃去上清液，并加入适量L15/DNase培养基（通常为5–7 µL），使细胞终浓度达到8 × 105–1.2 × 106 个细胞/µL。
注意：重悬过程中应特别注意避免产生气泡。 - 将细胞悬液置于冰上，并额外准备用于注射的L15/DNase培养基。
4. 颅内注射
注意：以下操作在动物房设施内的操作间进行。由于细胞将直接注射至新生幼鼠脑内而不暴露脑组织，因此通过70%乙醇溶液对工作区域进行消毒，并使用经高压灭菌的玻璃针头以维持无菌条件。颅内注射所需设备包括：1）明场解剖体视显微镜，2）微量注射仪，3）用于小鼠恢复的加热垫。
- 根据制造商的建议拉制玻璃针以制备玻璃针。本方案中使用的玻璃针外径为 80 µm，内径为 40 µm，斜面角度为 30°。
注意： 如上所述，针头在使用前应进行高压灭菌。 - 使用 30 G、2 英寸的针头和注射器，手动将生物惰性油反向填充至针头中。
- 根据制造商的说明，将针头组装并插入注射装置单元。
- 设定注射参数为最大体积（69 nL）和相对缓慢的速率（23 nL/s）。
- 排空针头，直至活塞完全伸出。
- 填充针头。
- 剪下一小片嫁接膜，置于明场解剖体视显微镜下。使用 P10 微量移液器，将 5 µL 样品（细胞分样）转移至膜上，使其形成球形液滴。
- 将针头尖端插入样品中，填充针头（活塞回缩并带动样品吸入）。
注意： 由于样品应具有较高黏度，需分小步缓慢填充，使样品充分平衡，并防止气泡产生。针头内的样品应平滑且均匀。若样品过于黏稠而无法填充，可加入适量 L15/DNase 培养基以达到合适黏度。但需注意，这将改变样品浓度，应尽量避免。
- 将新生幼崽（出生后第 0–2 天 [P0–P2]）置于冰上麻醉 2–5 分钟。
注意： 确保幼崽完全不动。 - 将麻醉后的幼崽置于明场解剖体视显微镜下。
- 在每个半球进行 3–4 次注射，每次 69 nL。
注意： 注射位点位于中线外侧约 1 mm 处，前后位置介于前囟后方 1 mm 至耳间线前方 1 mm 之间。针尖应置于软脑膜表面下约 1 mm 深处。每次注射后，针头应原位停留约 30 秒，然后分阶段撤出。 - 注射完成后，立即将幼崽置于加热垫上，加热设置为最低档（37 °C）。待幼崽恢复后，将其放回母鼠所在的笼中。
注意： 切勿让母鼠长时间无幼崽陪伴。整个操作过程（从将幼崽移出同窝幼崽至返回）应少于 10 分钟。
5. 氯氮平-N-氧化物注射
- 通过将1 mg CNO溶解于50 µL二甲基亚砜（DMSO）中，直至溶液呈半透明状，配制DREADD配体CNO储备液。再用生理盐水定容至10 mL，使CNO终浓度为0.1 mg/mL。
注意：DMSO具有毒性，避免使用浓度高于0.1%的DMSO。对照组使用含有与CNO溶液相同DMSO浓度的生理盐水溶液。 - 从出生后第14天开始，连续3天（P14–P16），对每只小鼠每天进行两次腹腔内（I.P.）注射CNO（CNO浓度：1 mg/kg）或含0.05% DMSO的生理盐水，两次注射间隔12小时。
- 在最后一天（P17），进行一次注射，并在30分钟至1小时的时间窗口内通过颈椎脱位法处死小鼠。
结果
通过本文所述方法，我们检测了皮层中间神经元在出生后早期阶段的存活是否由细胞自主性活动所调控。我们进行了3次脑片电穿孔实验（每次实验使用12-16个E14.5胚胎），分别转染浓度为1 µg/µL的pCAGGs-IRES-GFP（对照）和pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP表达载体。在电穿孔实验中，仅有部分GFP+神经元共表达hM3D(Gq)（RFP+，约占50%；图3），因此GFP+RFP-细胞群体可作为DREADD配体效应的内部对照。将转染的皮层胚胎中间神经元进行机械性分离，获得细胞悬液（8 × 105 个细胞/µL），并移植至P0-P1野生型小鼠的皮层中。每只小鼠大脑进行6次注射，每次实验至少注射6只新生幼鼠。给予CNO可选择性地增强转染RFP+细胞的活性，这一点通过活动依赖性蛋白cFos的表达得以证实（图4）。按照所述方案给予CNO（P14-P17期间每日两次）后，与给予溶剂对照（生理盐水中含0.5% DMSO）的同窝幼鼠相比，GFP+RFP+细胞相对于GFP+RFP-细胞的比例显著升高（图5）。
图1：用于急性电穿孔实验的代表性端脑切片。（A-C）在三个不同连续的头-尾水平获取的端脑切片，用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。LGE：外侧神经节隆起；MGE：内侧神经节隆起；CGE：尾侧神经节隆起。比例尺 = 200 µm。黄色星号表示每张切片中的电穿孔位点。白色线条标记神经节隆起的边缘。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：实验流程示意图。（A）对小鼠脑切片进行适当载体的电穿孔转染，（B）12 小时后分离经修饰的皮层中间神经元（CI）前体细胞，并（C）将其移植至新生小鼠幼崽（P0−P2）的脑皮层中。为调控未成熟 CI 的活性，对接受细胞移植的 P14 小鼠幼崽按照本方案连续四天注射 CNO 或对照溶剂。（A'）急性小鼠脑切片电穿孔装置的实物照片。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：典型的成功急性脑片电穿孔实验结果。（A）来自E14.5胚胎脑的冠状切片，于尾侧神经节隆起（CGE）区域转染了pCAGGs-IRES-GFP（GFP）和pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP（RFP）质粒，并培养12小时。该切片经GFP（A、B、C）和RFP（A、B、D）免疫染色。图A中框选区域被放大以显示两种荧光报告蛋白的表达情况：（B）GFP与RFP共表达，（C）仅GFP，（D）仅RFP。白色线条标记了神经节隆起的边界。B-D：同一图像，不同荧光通道或双通道合并图像。比例尺 = 200 µm（A），100 µm（B-D）。本图经Denaxa等14修改。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：给予CNO后，表达M3D(Gq)的移植CIs细胞自主性地增加活动。（A-D）P1期小鼠经CI前体细胞移植并在P17期取材的冠状切面代表性共聚焦图像，CI前体细胞共转染pCAGGs-IRES-GFP（GFP）和pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP（RFP）质粒，并接受CNO处理。该切片经GFP（A）、RFP（B）和cFos（C）免疫染色。（D）A、B和C免疫荧光图像的合并图（combo）。注意，仅共表达两种质粒的CI细胞（A-D中白色箭头所示）呈cFos+，而仅表达对照GFP质粒的CI细胞（A-D中黄色箭头所示）则不表达cFos。（E）在P1期移植并在P17期检测的小鼠大脑皮层中cFos+RFP+细胞的定量分析（以总RFP+细胞数为归一化基准），比较溶剂对照组与CNO处理组的结果（N = 2）。A-D：同一图像的不同荧光通道或三个通道的组合图像。比例尺 = 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：CI细胞自主性地增强活性可提高其存活率。（A-D）在P0-P2期移植CI前体细胞、并在P17期获取的幼鼠体感皮层冠状切片的代表性共聚焦图像。这些前体细胞共转染了pCAGGs-IRES-GFP（GFP）和pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP（RFP）质粒，并分别用对照溶剂（A-B）或CNO（C-D）处理。（E）在P0-P2期移植后于P17期小鼠前脑中检测到的RFP+细胞定量结果（以总GFP+细胞群为归一化基准）。RFP+（对照溶剂组）= 47% ± 3%，CNO组 = 61% ± 3%，p = 0.01，配对样本t检验，n = 3个对照组和3个CNO组，每只脑组织计数不少于150个细胞。A和B：同一图像，不同荧光通道。C和D：同一图像，不同荧光通道。比例尺 = 50 µm。本图改编自Denaxa等14。请点击此处查看该图的放大版本。
表 1：本实验方案中所用培养基的附加信息。
讨论
本文介绍一种易于实现的方法，通过基因改造调控CI前体细胞的内在活性，以研究内在活性对CI成熟的影响，以及经活性调控的CI对整合皮层环路组装/功能的作用。
过去，包括我们实验室在内的多个研究团队已开展过子宫内电穿孔实验，以对投射神经元进行遗传学改造6。然而，由于电传导路径问题，对包含CI前体细胞的神经节隆起区域进行子宫内电穿孔极为困难。为解决这一问题，仅有少数实验室采用超声引导注射结合电穿孔的技术，但该方法操作难度高且需要昂贵的设备。本实验方案为科学界大多数研究人员提供了一种替代上述方法的可行方案。
该实验方案中最具挑战性的方面之一，是最大限度地提高移植到宿主大脑皮层的细胞存活率，使其能够发育至成熟阶段（表型分析通常在此阶段进行，具体时间取决于实验设计，但一般晚于出生后第17天）。研究者应重点关注以下三个关键步骤：（1）电转染效率。可通过确保DNA质粒的纯度来提高效率。本实验应仅使用高质量的DNA质粒（A260/A280比值为1.9–2.0）。我们采用氯化铯法进行DNA纯化，以获得此类高质量的DNA制备物。另一个关键因素是驱动目的基因表达的启动子。我们发现，含有鸡β-肌动蛋白启动子的pCAGGs载体具有极强的表达能力，可显著提高电转染效率。（2）起始供体胚胎的数量。必须确保对大量（12–16个）处于相同发育阶段的胚胎进行电转染。如果有多位实验人员同时进行胚胎解剖和切片操作，则可进一步增加该数量，因为胚胎皮层切片的获取、电转染及转移至培养箱的过程必须尽快完成。（3）必须确保向每只幼鼠注射足够数量的细胞，以提高移植细胞在成熟阶段仍能存活的概率。此外，这将显著提高移植成功率，因为细胞悬液密度过低会导致细胞与培养基混合不均，从而在移植后的大脑中产生较大的变异15。
本文所述方案专为研究活动在细胞自主性层面上调控CI存活的作用而设计。选择P14-P17阶段进行CNO注射是依据已发表的数据，这些数据显示移植的CI前体细胞的死亡高峰发生在此期间16。因此，该时间窗口或CNO注射频率可能不适用于其他细胞类型或脑区，研究者应根据具体的实验目的调整这些参数。最后，本文所述的CI颅内注射方法仅适用于P0-P5幼鼠（也取决于小鼠品系背景）。原则上，P5以后的任何注射均需磨薄或去除颅骨15。
该方案的一个关键优势在于能够使用新型的基因编码工具，在中间神经元分化并整合到发育中的神经网络的不同阶段，对其活动进行可视化或操控。随着基因编码的电压和钙离子传感器，以及新型化学遗传学和光遗传学工具的不断发现，该方案使研究人员能够在这些工具发布到质粒库（如Addgene）后的数周内即投入使用。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了欧洲研究委员会启动资助（ERC Starter Grant，编号282047）、惠康信托调查员奖（Wellcome Trust Investigator Award，编号095589/Z/11/Z）、欧盟第七框架计划（FP7 EC）DESIRE项目资助以及JB获得的利斯特研究所奖的支持。V.P.实验室的工作得到了英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC，编号BB/L022974/1）、英国医学研究理事会（MRC）以及弗朗西斯·克里克研究所（该研究所的资金来自MRC、英国癌症研究署和惠康信托基金）的支持。M.D.实验室的研究由斯塔夫罗斯·尼亚尔科斯基金会向希腊基础研究与技术研究中心（B.S.R.C. "Alexander Fleming"）提供的资助支持，该资助是基金会支持希腊科研计划的一部分。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养基/添加剂 | |||
| B-27 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 175040-044 | |
| DMEM/F12 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21331-020 | |
| DNA酶 | SIGMA | DN15-100MG | |
| 胎牛血清（FBS） | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 10270-098 | |
| 100倍谷氨酰胺 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 35050-061 | |
| L15 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 11415-049 | |
| MEM α，含GlutaMAX | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 32561-029 | |
| Neurobasal培养基 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21103-049 | 神经元基础培养基 |
| 100倍青霉素-链霉素（P/S） | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | |
| 仪器设备 | |||
| 电穿孔仪 | BTX | ECM 830 发生器 | |
| 急性脑片电穿孔用注射器 | Eppendorf | FemtoJet 微注射系统 | |
| 细胞移植用注射器（I） | Visual Sonics | Vevo 注射系统 | |
| 细胞移植用注射器（II） | WPI | NANOLITER2010 | |
| 磁力支架 | WPI | M10L 磁力支架 | |
| Kite 手动显微操作器 | WPI | KITE-M3-R | |
| 铂电极（I） | Protech International Inc. | CUY-700-1 | |
| 铂电极（II） | Protech International Inc. | CUY-700-2 | |
| 不锈钢底板 | WPI | 5479 | |
| 振动切片机 | Leica | VT1200S | |
| 其他材料 | |||
| 电穿孔用玻璃毛细管 | VWR | 1B100-4 | |
| 细胞移植用玻璃毛细管 | Visual Sonics | 由Visual Sonics提供 | |
| Nuclepore 8 µm 何曼滤膜 | SLS | 110414 | |
| 组织器官培养皿 | BD Biosciences (Falcon) | 353037 |
参考文献
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