大型与小型动物狂犬病尸检技术

摘要

本方案的目的是演示在小型和大型动物中进行安全剖检的技术，以获得用于狂犬病检测的满意组织样本。

摘要

纽约州卫生部（NYSDOH）狂犬病实验室每年接收 6,000 至 9,000 份样本，为除纽约市以外的全州提供狂犬病检测服务。该狂犬病实验室对从蝙蝠到牛科动物等多种体型的动物进行尸体解剖。这些样本中大多数是表现出神经系统症状的动物，但实际检测出狂犬病阳性的比例不到 10%；这表明这些症状可能由创伤、病变或其他传染性病原体引起。由于存在气溶胶传播未确诊传染性病原体的风险，狂犬病实验室不使用电动工具或锯子。本文将介绍三种适用于剪刀无法穿透颅骨的动物的尸体解剖技术。实验室已采用这些技术以降低接触传染性病原体的潜在风险，避免对样本进行不必要的操作，并缩短处理时间。不同技术之间的优劣取决于实际操作样本的技术人员的训练背景与经验。

引言

在狂犬病实验室的尸检工作区作业具有固有的危险性。有时送检的样本会嵌有豪猪刺、箭矢/子弹/弹丸等异物，或暴露的骨碎片，这些可能刺穿保护性运输包装。包装不当可能导致泄漏，危及开箱人员。除了物理伤害外，尸检技术人员还可能因接触样本的中枢神经系统和体液而暴露于未知的人畜共患感染性病原体。此外，样本携带的体外寄生虫也可能传播其他人畜共患疾病，因为跳蚤和蜱虫在送检动物中十分常见。根据地理位置和涉及的物种不同，可能暴露的疾病种类也有所不同。例如虫媒病毒（如东部马脑炎病毒（EEEV）或西尼罗病毒（WNV））、蜱传疾病（如莱姆病或土拉菌病）、引起Q热或结核病的细菌，以及传染性朊病毒，仅是众多潜在危险中的少数例子^1,2,3。

这些方法的目的是展示使用能够最大限度减少气溶胶产生风险的器械进行安全且高效的尸体解剖技术，与使用电动工具或锯子不同^4,5。在狂犬病实验室中，通常对小型动物进行尸体解剖时，需要切除颅骨肌肉，并使用锤子和凿子打开颅骨的尾背部分⁶。去除该部分颅骨可暴露后脑，包括整个小脑和颅脑脑干。可对颅骨的腹侧部分采用改良的解剖技术，以避开较大的颅骨肌肉和较厚的颅骨区域。然而，这些改良的尸体解剖技术仅在样本不含颈椎时方可实施。

类似地，可通过分离颅骨肌肉并打开颅骨的尾侧背侧部分，从大型动物中取出脑组织⁷。由于大型动物的颅骨通常较厚，暴露小脑和脑干需要较大的操作力度。为避免穿透颅骨，应将大型动物的头部摆放至颅骨的腹侧尾部朝向技术人员。使用改良的器械，经枕骨大孔切除小脑和脑干。该方法类似于欧洲联盟传染性海绵状脑病（TSE）参考实验室推荐的样本采集方法⁸。应在操作前先移除颅椎，以暴露枕骨大孔。

这些技术的应用对于接受过适当培训的狂犬病实验室技术人员具有重要意义。由于狂犬病实验室接收的样本大小各异，从小型幼年蝙蝠到成年役用马⁹均有，技术人员可根据具体情况选择合适的方法。针对大型动物所展示的方法同样适用于在野外开展剖检的兽医，因为将整颗大型动物头部运送至实验室进行狂犬病检测既繁琐又昂贵。采用这些技术中的任何一种，均可通过减少气溶胶产生的风险、降低样本操作频率以及缩短处理时间来提高操作安全性。然而，野外工作环境不具备专设狂犬病检测实验室的同等条件，因此对这些操作流程所作的任何调整都必须以安全为核心，尤其应重视个人防护装备（PPE）的使用。

方案

所有所述方法均经瓦兹沃思中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。

1. 准备

1. 穿戴个人防护装备（PPE），至少包括眼部防护（护目镜或面罩）、外科口罩或N-95口罩，以及非乳胶手套。
2. 准备操作区域，理想情况下使用生物安全柜（BSC），并铺设一次性工作台面覆盖物（如牛皮纸或吸水垫），同时准备好清洁的解剖器械（图1）。
3. 将样本置于工作台面上，使用器械移动和检查样本，评估其状态，包括是否出现腐败迹象、颅骨是否受损、是否存在潜在危险物（如豪猪刺、手术刀片），以及断头操作的质量。

2. 腹侧法

注意：当标本在下颌线处被正确断头时，枕骨大孔和枕骨髁将暴露出来。腹侧法在获取小脑和脑干时操作较为简单。

1. 将标本腹侧朝上放置，鼻部朝向生物安全柜后方。
2. 右手（若为右利手）持骨科锤或木槌，同时左手持颅骨凿。
3. 将颅骨凿以45°角放置，凿角对准颞骨右侧与枕骨之间的交界处，形成一个“V”形切口。
4. 用锤子敲击颅骨凿顶部，直至两块颅骨分离。切口应延伸至基蝶骨附近。
5. 在左侧颞骨/枕骨交界处重复上述操作（图2A）。
6. 用颅骨凿将颅骨的“V”形区域向下弯曲，充分暴露脑部的后脑菱形区（小脑和脑干）（图2B）。
7. 使用剪刀和镊子取出脑干和小脑。若脑干和小脑未完整取出，需将残余组织从颅腔中彻底清除。

3. 背侧法

注意：如果标本的断头位置不佳（枕骨大孔不可见），且在剖检过程中颈部无法轻松移除，或怀疑小脑受损，则应采用背侧法。

1. 将标本背侧朝上放置，鼻部朝向生物安全柜后方。
2. 使用肿瘤牵开钳，用钳齿夹住左侧颞肌，并通过挤压手柄将其锁定。
3. 用锋利的雕刻刀将颞肌切至骨面。
4. 用牵开钳和刀具（勿用手）将标本旋转180°，在对侧颞肌重复上述操作，暴露颅骨。
5. 将凿子以45°角放置，凿角尖端对准颅骨顶部顶骨与顶间骨交界处的中心位置。
6. 用锤子敲击凿子顶部，直至在顶骨区域的颅骨上半部分形成一水平切口。
7. 将标本旋转180°，在对侧重复此操作。
8. 将凿子尖端插入切口1的末端（图3A），并与水平切口呈90°角。用锤子敲击，直至切口延伸至枕骨（长度约10 cm，视标本大小而定）。
9. 滚动标本，在切口2末端的对侧重复此操作。
   注意：当标本背侧朝上、鼻部朝向生物安全柜后方时，颅骨上的切口呈倒置的“U”形。
10. 将牵开钳的钳齿插入“U”形切口底部，向操作者方向撬开。暴露大脑尾端及小脑（图3B）。
11. 使用剪刀作为刮勺，将整个小脑从颅腔中撬出。
12. 使用组织镊子从枕骨大孔中轻轻分离出脑干。

4. 大动物实验方法

1. 将标本放置，使颅骨背侧接触剖检台面，颅骨后部及枕骨大孔朝向操作人员。
2. 将改良的刺刀插入枕骨大孔内，尽可能深入地置于脊髓与脊髓脑膜之间。
3. 沿脊髓周围划切，以分离小脑和脑干与脊髓脑膜。刺刀插入枕骨大孔后，应轻柔调整角度，尽可能沿颅骨内壁推进。
4. 将化学刮勺或细长柄勺插入神经组织与脊髓脑膜之间的空隙中。
5. 探查脊髓和小脑周围，确认与脊髓脑膜的连接已被完全切断。
6. 用镊子夹住脑干，另一只手将勺子向前（头侧）推进，再向背侧抬起，以舀出小脑。同时用镊子向后牵拉脑干，并用勺子将小脑挖出。
   注意：可能需要多次尝试才能获取足够的小脑组织用于狂犬病检测。

5. 尸检后处理

1. 将所有一次性材料（手套、垫子、工作区覆盖物）和未使用的组织样本丢弃至生物危害废物容器中。
2. 使用可用方法对所有器械进行清洁和消毒（例如工业洗碗机、高压灭菌器、化学消毒剂、煮沸）。
3. 使用20%次氯酸钠溶液和/或70%乙醇对所有工作表面进行清洁和消毒。

结果

所有在2019年1月31日至2019年2月28日期间随头骨提交的陆地样本均记录了颈部是否存在以及剖检方法的信息。在此期间，共对170个头颅进行了剖检，涉及18个物种。其中52%（89/170）为正确断头处理。其余样本至少保留有一个椎骨，包括三具完整躯体标本。75%（128/170）的情况下采用了腹侧入路法；在这些案例中，有49例标本带有颈部。凡提交时带有颈部的标本，均会在剖检过程中将其去除，以便尽可能采用腹侧入路法。共提交了三种大型动物（牛、鹿、猪），其中两例使用了大型动物操作规程。猪未采用该规程，因其需要额外采集脑组织样本进行进一步检测。一只松鼠因颅骨压碎，仅需剪除外皮即可暴露脑组织，因此未采用上述任何一种方法（表1）。

对于新鲜完整的样本，这三种方法均能获得可靠的狂犬病诊断检测所需的组织。偶尔小脑和脑干无法完整取出，但在移除后脑的所有组织后，仍可识别并相应处理这些组织。

讨论

送检进行狂犬病尸检的标本通常具有与神经系统疾病相符的临床症状史。临床疾病的出现可能与多种疾病相关，包括人畜共患病，从而增加实验室工作人员发生实验室获得性感染的风险。为降低此类风险，已实施一些技术以减少对标本的接触和操作。

本方法仅演示了从单个动物体内取出所需组织的剖检操作。更常见的情况是在一次操作中处理多个样本，此时必须注意避免样本间的交叉污染。必须使用洁净的工作台面（一次性牛皮纸或垫片）、一套新的洁净且已消毒的器械，并更换手套。获取组织后，可按照各实验室的常规流程进行后续处理，包括制备显微镜载片或进行分子实验所需的RNA提取。

在实验室或野外成功实施这些技术需满足若干基本前提。对任何进行疑似狂犬病动物尸体剖检的人员而言，事先接种狂犬病疫苗并使用个人防护装备（PPE）至关重要。在狂犬病实验室工作的人员应每六个月进行一次血清检测，以确保体内存在足够水平的抗狂犬病抗体¹⁰。需要注意的是，其他一些人畜共患疾病，例如东部马脑炎病毒（EEEV）、西尼罗病毒（WNV）和牛海绵状脑病（BSE）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学勺	任意
弯曲、尖端钝头梅奥剪刀	Sklar	14-2055	Sklar 手术剪 5-1/2 英寸 优质手术级不锈钢指环手柄 弯曲尖/钝头
大型锋利餐厅级切肉刀	Dexter	P94848	8" 锯齿状实用刀，白色手柄
带锁止功能的肿瘤抓钳	Diamond Scientific and Surgicals	N/A	Czerny 抓钳
改装的短剑刀（6.5 英寸长刀片磨至 0.5 英寸宽）	Dexter	P94848	改装 8" 锯齿状实用刀，白色手柄
骨科用锤子-木槌	Mortech	N/A	尸检用带钩锤子
锋利的市政官骨凿	Shandon	60-5	市政官骨凿刀片：2 英寸 × 2.25 英寸 标准 7 英寸
磨锋的汤匙或其他长柄勺	任意
光滑尖端无齿组织敷料钳	Shandon	63-03	Shandon 宽头敷料拇指钳
无粉非乳胶手套	任意
护目镜、安全眼镜或面罩	任意
外科口罩或 N-95 口罩	任意
牛皮纸、屠夫纸、吸水垫等	任意