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方法文章

评估小鼠后肢缺血模型中的治疗性血管生成

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DOI：

10.3791/59582

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2019年6月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Cardiovascular da Universidade de Lisboa, Lisbon School of Medicine of the Universidade de Lisboa, 2Centro Hospitalar Universitário Lisboa Norte, 3Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa

本文内容

摘要

本文介绍了一种下肢缺血的实验模型，并结合一系列功能学、组织学和分子生物学检测方法 ，用于评估促血管生成疗法的有效性。​

摘要

严重肢体缺血（CLI）是一种具有较高下肢截肢风险的严重疾病。尽管血运重建是目前的金标准疗法，但仍有相当一部分CLI患者不适合接受外科或腔内血管重建治疗。促血管生成疗法正逐渐成为这类患者的潜在治疗选择，但目前仍处于研究阶段。在应用于人体之前，这些疗法必须在动物模型中进行测试，并且其作用机制必须被明确阐明。目前已建立了一种通过结扎并切除小鼠远端髂外动脉、股动脉及相应静脉来诱导后肢缺血（HLI）的动物模型。为全面评估缺血的影响以及潜在促血管生成疗法的效果，已整合了一套涵盖功能学、组织学和分子水平的检测方法。采用激光多普勒技术进行血流测量和灌注功能评估；通过腓肠肌组织切片抗CD31抗体染色后分析毛细血管密度，以及通过骨骼肌透化法测定侧支血管密度，来评价组织反应；在经激光显微切割分离小鼠腓肠肌组织中的内皮细胞（ECs）后，采用RT-PCR定量检测特定促血管生成因子的基因表达水平。这些方法能够灵敏地识别缺血与非缺血肢体之间、以及治疗与未治疗肢体之间的差异。本实验方案提供了一种可重复的CLI动物模型，以及用于评估促血管生成疗法的系统性框架。

引言

外周动脉疾病（PAD）主要影响下肢。PAD 由动脉粥样硬化引起，这是一种动脉阻塞，可导致下肢血流严重受限1。间歇性跛行是 PAD 的首发表现，指行走时出现肌肉疼痛。慢性肢体缺血（CLI）是 PAD 最严重的阶段，诊断依据为患者出现缺血性静息痛、溃疡或坏疽2。CLI 患者截肢风险较高，尤其在未接受治疗的情况下3。目前，下肢血运重建（通过开放手术或腔内介入手术）是唯一可保留肢体的方法。然而，约 30% 的 CLI 患者因病变部位、动脉闭塞模式及严重合并症等原因，不适合接受上述治疗4,5。因此，对于这些难以治疗的患者，亟需开发新的疗法，其中促进血管生成是当前研究最为集中的策略。

在进行人体试验之前，其有效性 新疗法的安全性和有效性 体内 在动物模型中必须考虑这些问题。目前已开发出多种用于研究CLI的模型，主要通过在小鼠中诱导后肢缺血（HLI）来实现。6,7,8,9,10. 然而，这些模型在多个方面存在差异，包括其性质 被结扎和/或切除的动脉 以及是否 周围的静脉和神经也被解剖分离6,7,8,9,10综上所述，这些因素将影响每只动物缺血-再灌注损伤的严重程度， 使得结果难以进行比较。因此，建立一种有效且标准化的实验方案至关重要，该方案应统一缺血诱导的操作流程以及对不同靶标的评估方法，以判断特定的促血管生成疗法是否有效。若能设计出涵盖上述所有方面的实验方案，将有助于全面理解促血管生成疗法发挥作用的机制，并对其各项结局指标的疗效进行量化评估。我们团队近期发表的两项独立研究便是很好的范例11,12，其中采用相同的方案评估了诱导治疗性血管生成的不同方法，该方案将在下文描述 更详细的 在此方案中。

本实验方案的总体目标是描述一种可重复的实验模型，该模型能够模拟严重肢体缺血（CLI）的影响，并为全面评估潜在促血管生成剂的功能、组织学及分子效应奠定实验基础。

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方案

所有动物实验程序均符合欧盟指令2010/63/EU，并已获得机构动物福利委员会批准，由葡萄牙动物保护主管机构DGAV授权（许可证号023861/2013）

警告：本实验方案中使用的多种化学试剂具有毒性且有害。请务必采取所有适当的安全措施，并穿戴个人防护装备（手套、实验服、长裤和不露脚趾的鞋子）

1. 小鼠后肢缺血模型

注意：所有实验均在22周龄的C57BL/6雌性小鼠上进行。

  1. 溶液的制备
    1. 麻醉溶液的制备
      注意：该麻醉组合（美托咪定和氯胺酮）可提供长达30分钟的固定效果，并具有15分钟的手术窗口期。其作用可通过给予阿替美唑逆转。
      1. 使用一支洁净的1 cc注射器，抽取1 mL美托咪定（1 mg/kg体重），排除气泡以确保剂量准确，并将其加入一个15 mL离心管中。
      2. 使用一支洁净的1 cc注射器，抽取0.75 mL氯胺酮（75 mg/kg体重），排除气泡以确保剂量准确，并将其加入含有美托咪定的15 mL离心管中。
      3. 加入8.25 mL无菌生理盐水（0.9% NaCl），以获得10 mL麻醉溶液。
      4. 在管壁上标注化合物名称、配制日期和有效期。
      5. 避光保存于4 °C环境中。
    2. 抗镇静溶液的制备
      1. 使用一支洁净的1 cc注射器，抽取1 mL阿替美唑（5 mg/kg体重），排除气泡以确保剂量准确，并将其加入一个15 mL离心管中。
      2. 加入9 mL无菌生理盐水（0.9% NaCl），以获得10 mL逆转溶液。
      3. 在管壁上标注化合物名称、配制日期和有效期。
      4. 避光保存于4 °C环境中。
    3. 术后镇痛溶液的制备
      1. 使用一支洁净的1 cc注射器，抽取0.5 mL布托啡诺（100 µL/15–30 g体重），排除气泡以确保剂量准确，并将其加入一个15 mL离心管中。
      2. 加入9.5 mL无菌生理盐水（0.9% NaCl），以获得10 mL镇痛溶液。
      3. 在管壁上标注化合物名称、配制日期和有效期。
      4. 避光保存于4 °C环境中。
  2. 后肢缺血的手术诱导
    1. 本操作所需手术器械包括：尖头镊子、弹簧剪刀、眼科持针器、手术剪刀和持针钳。使用前将所有手术器械在高压灭菌器中灭菌。使用棉签进行皮下脂肪组织的分离。
    2. 在抓取小鼠前，先将注射器抽取麻醉溶液备用。
    3. 通过将手指施力于小鼠耳后并压在笼具网格上，尽可能多地抓住皮肤，以固定动物并使其保持不动。
    4. 将动物倾斜放置，头部略低，以45°角对小鼠身体进行腹腔注射麻醉溶液。
    5. 检查足底回缩反射是否消失，以评估麻醉深度。
    6. 使用电动剃毛器去除右侧后肢的毛发。 使用氯己定消毒皂液进行皮肤准备。用干净的纸巾擦去泡沫。 涂抹氯己定外科消毒液，并在将小鼠转移至无菌手术室前，用无菌洞巾保护手术区域。
    7. 将动物置于仰卧位，四肢外展并用胶带固定。
      警告：操作过程中应将动物置于加热垫上，以维持其体温稳定；手术需在解剖显微镜下进行，放大倍数为10×或20×。
    8. 使用无菌纱布蘸取氯己定消毒液完成皮肤最终准备。 使用11号手术刀片，在右侧后肢大腿部位做一长约1 cm的皮肤切口。
    9. 钝性分离皮下脂肪，暴露神经血管束。使用尖头镊子、弹簧剪刀和眼科持针器，打开膜性髂股鞘，暴露远端髂外动脉和股动静脉。
    10. 将血管（动脉和静脉）与神经分离。使用7.0不可吸收聚丙烯缝线，结扎远端髂外动脉和静脉以及远端股动脉和静脉。
    11. 使用弹簧剪刀在远端和近端结扎线之间切断髂股动脉和静脉段。
    12. 使用可吸收缝线（如5.0 Vicryl缝线）缝合切口。
    13. 将注射器抽取抗镇静溶液，并按照步骤1.2.3和1.2.4所述方法，进行抗镇静溶液的腹腔注射。
  3. 术后监测
    注意：需每15–20分钟仔细观察动物一次，确保所有动物均顺利从镇静状态中恢复；麻醉状态下的动物不得无人看护。
    1. 评估麻醉恢复情况：1）监测呼吸频率和深度；2）评估动物反射（足底反射和眼球位置）
    2. 每8–12小时进行一次术后镇痛药物的皮下注射。
    3. 术后每日观察动物，记录动物健康状况及手术部位外观的简要描述，确保所有缝线闭合良好。
    4. 若发生切口裂开，应重新缝合。如无法缝合，可在切口处涂抹皮肤保护膜，以防止尿液、粪便污染、皮肤摩擦与剪切力，并促进愈合过程。

2. 血管生成效应的评估

注意：在诱导缺血后，应用研究中的治疗剂，并执行以下步骤。在其他时间点进行的步骤详见相应部分。

  1. 激光多普勒血流成像
    1. 在分析前一日使用电动剃须刀去除双侧后肢的毛发，随后使用脱毛膏进一步处理。
    2. 使用麻醉溶液对小鼠进行麻醉。
    3. 将动物置于37 °C加热垫上5分钟，以确保在操作过程中体温保持稳定。
    4. 将动物仰卧位固定，双腿伸展并固定。测量每只动物右腿与左腿及足部之间的距离，因为每次重复操作时动物的体位应保持一致，以便随时间追踪后肢灌注的变化。
    5. 使用激光多普勒血流成像仪开始采集数据。
    6. 数据采集完成后，使用拮抗镇静溶液逆转麻醉状态。
    7. 打开图像分析软件，在缺血后肢周围绘制感兴趣区域（ROI），并在非缺血后肢周围绘制相应的ROI。
    8. 观察血流值，并将灌注定义为缺血肢体与非缺血肢体灌注的比值。随时间测量灌注比值的变化。 
  2. 免疫组织化学与毛细血管密度分析
    1. 麻醉后，通过颈椎脱位法处死小鼠。
    2. 为获取双侧后肢的腓肠肌，首先去除双侧后肢的皮肤。
    3. 识别跟腱，并使用11号刀片解剖刀将肌腱从骨骼上分离。
    4. 夹持跟腱，使用弹簧剪从胫骨和腓骨向上分离肌肉至膝关节。
    5. 将股二头肌与腓肠肌分离。
    6. 使用弹簧剪在膝关节水平切断腓肠肌的附着点。 
    7. 借助10%刺梧桐胶，将获取的腓肠肌以横向方向放置于小软木片上。
    8. 将标本在液氮冷却的异戊烷中速冻，并在-80 °C保存直至切片。
    9. 在恒冷箱切片机上切取7 µm厚的肌肉切片，并贴附于载玻片上。
      注：此处可暂停本方案。
    10. 将载玻片置于含冷丙酮（约50 mL）的瓶中，在-20 °C固定10分钟。
    11. 加入0.3%过氧化氢甲醇溶液（50 mL），室温孵育30分钟。
    12. 用磷酸盐缓冲液（PBS）（50 mL）洗涤两次，共10分钟。
    13. 使用疏水笔在切片周围画圈。
      注：使用疏水笔可减少实验过程中试剂的消耗量。所有孵育步骤中，每张切片使用100 µL试剂。
    14. 加入含5%兔血清的PBS封闭液，室温孵育30分钟。
    15. 加入抗CD31大鼠单克隆抗体（以1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液稀释至1:500），室温孵育1小时。
    16. 用PBS洗涤三次，共30分钟。
    17. 加入生物素标记的兔抗大鼠IgG二抗（以含1% BSA和5%兔血清的PBS溶液稀释至1:200），室温孵育30分钟。
    18. 按前述方法用PBS洗涤，加入标记的亲和素-过氧化物酶复合物，室温孵育30分钟。
    19. 用PBS冲洗三次，每次5分钟，随后加入二氨基联苯胺（DAB）过氧化物酶底物试剂盒，继续孵育5分钟。
    20. 封片前用苏木精复染切片10秒。
    21. 使用正置明场显微镜（即每单位肌细胞数量中的毛细血管数），在每份标本的4个不同解剖区域中各选取2个不同切片，测量毛细血管密度。
  3. 造影剂灌注
    1. 使用麻醉溶液对小鼠进行麻醉  。
    2. 使用15号刀片进行正中腹切开术。
    3. 牵拉小肠至侧方后，暴露腹主动脉和尾腔静脉，并使用弹簧剪进行操作。
    4. 将一根26号导管头端向上插入腹主动脉，另一根同方向插入尾腔静脉。
    5. 使用5/0丝线缝合固定导管，作为固定缝线。
    6. 使用10 mL注射器将含肝素（500单位/100 mL）的37 °C生理盐水溶液经腹主动脉推注，冲洗血管系统。持续轻柔灌注，直至从尾腔静脉内的导管流出澄清液体。
      注：通常需要30至40 mL肝素化生理盐水冲洗成年大鼠的血管系统。
    7. 给予腺苷（1 mg/L）和罂粟碱（4 mg/L）混合液，持续2分钟。
    8. 经主动脉导管注入10 mL含50%硫酸钡和5%明胶的混合液。
      注：溶液需保持在60 °C，以防变稠。
    9. 将小鼠置于- 4 °C环境中至少4小时，使血管铸型充分固化。
    10. 去除每只小鼠下半身的皮肤。
  4. 透明化处理 - Spalteholz技术
    1. 将小鼠浸入10%甲醛溶液中固定，至少72小时。
    2. 将小鼠浸入30%过氧化氢溶液中漂白，持续24小时。
    3. 采用冷冻置换法对小鼠进行脱水。该方法包括将小鼠在- 20 °C下依次通过纯丙酮溶液（平均四次），每次24小时。
    4. 将小鼠浸入含100%苯甲酸苄酯和100%水杨酸甲酯按3:5比例混合的溶液中（该混合液亦称Spalteholz溶液）进行透明化处理13。
    5. 将小鼠置于真空腔内的Spalteholz溶液中，直至其变得透明，通常需要5至7天。
    6. 若溶液在标本变清前变暗，则需更换溶液。
  5. 侧支血管定量分析
    1. 将浸于Spalteholz溶液中的小鼠置于体视显微镜下透射光观察。使用显微外科镊子轻轻夹持并移动标本。
    2. 使用连接显微镜的数码相机拍摄整个肢体。
    3. 使用适当软件获取完整肢体图像。
    4. 通过适当软件手动分割侧支血管，并对其进行高亮标记。
      注：侧支血管根据Longland定义，指具有明确主干、中段和再进入段，直径介于20至300 µm之间的血管，不包括股动脉、隐静脉和腘动脉以及所有静脉结构。
    5. 在每只小鼠的相同解剖区域（内收肌区域，手术闭塞周围及下方）定义感兴趣区域（ROI）。
    6. 在相当于肢体总面积20%的等效ROI中定量侧支血管密度（CVD）。CVD计算为血管面积与ROI面积的比值。所有密度测量均使用ImageJ软件完成。
      注：每只小鼠非缺血肢体的CVD值设定为100%，以排除解剖结构、灌注或透明化处理过程中的个体差异。因此，缺血肢体的CVD百分比相对于非缺血肢体计算。
    7. 将缺血与非缺血肢体之间的CVD百分比差值定义为CVD增加的百分比。
  6. 毛细血管激光捕获显微切割
    1. 麻醉后，通过颈椎脱位法处死小鼠。
    2. 为获取双侧后肢的腓肠肌，去除小鼠双侧后肢的皮肤。
    3. 识别跟腱，并使用11号刀片解剖刀将肌腱从骨骼上分离。
    4. 夹持跟腱，使用弹簧剪从胫骨和腓骨向上分离肌肉至膝关节。
    5. 将股二头肌与腓肠肌分离。
    6. 使用弹簧剪在膝关节水平切断腓肠肌的附着点。 
    7. 借助10%刺梧桐胶，将获取的腓肠肌以横向方向放置于小软木片上。
    8. 将标本在液氮冷却的异戊烷中速冻，并在-80 °C保存直至切片。
    9. 在恒冷箱切片机上切取12 µm厚的肌肉切片，并贴附于载玻片上。
      注：为保护RNA，取预冷载玻片，用戴手套的手指轻触玻片背面，仅加热放置切片的区域。将切片从恒冷箱刀片转移至加热区域，随后在恒冷箱内-20 °C干燥2-3分钟。此处可暂停本方案。
      1. 将载玻片置于含冷丙酮（约50 mL）的瓶中，在-20 °C固定5分钟，随后空气干燥。
      2. 使用疏水笔在切片周围画圈。
        注：使用疏水笔有助于减少实验过程中试剂的消耗量。所有孵育步骤中，每张切片使用100 µL试剂。
      3. 用2 M NaCl/PBS在4 °C下复水，并在4 °C下与抗CD31大鼠单克隆抗体（以2M NaCl/PBS稀释至1:500）孵育过夜。
      4. 用2M NaCl/PBS洗涤两次，共6分钟。
      5. 加入生物素标记的兔抗大鼠IgG二抗（以含2M NaCl/PBS和5%兔血清的溶液稀释至1:200），在4 °C孵育30分钟。
      6. 按前述方法用2 M NaCl/PBS洗涤，加入标记的亲和素-过氧化物酶复合物，在4 °C孵育30分钟。
      7. 冲洗后加入DAB过氧化物酶底物试剂盒，孵育5分钟。
      8. 依次用冰冻90%乙醇和100%乙醇脱水，并使其干燥。
      9. 使用配备脉冲固态355 nm激光的激光显微切割系统，从每只小鼠中分离约10,000条毛细血管，并将切割下的毛细血管弹射至带粘性盖的微量离心管中。
  7. RNA提取、cDNA合成、预扩增及RT-PCR
    1. 使用适当的试剂盒从显微切割的毛细血管中提取总RNA，所得总RNA浓度为1.5–3 ng/µL。
    2. 使用cDNA合成试剂盒进行cDNA合成，并使用表1中所述引物进行两轮预扩增。
    3. 对前一步所述的相同靶标进行RT-PCR。程序包括：95 °C初始变性10分钟，随后进行50个循环（95 °C变性15秒，60 °C退火1分钟）。

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结果

根据所述方案，脐带间充质干细胞和低剂量电离辐射（LDIR）被测试作为潜在的促血管生成疗法11,12。在诱导缺血前以及从缺血诱导后即刻至缺血后45天的预设时间点，获取激光多普勒灌注读数。激光多普勒组织灌注结果以彩色编码图像记录，无灌注显示为深蓝色，最高灌注水平显示为红色。如图2A和3A所示，并在图2B和3B中进行量化，所有小鼠在诱导后肢缺血后即刻均出现后肢灌注完全丧失，证明该诱导后肢缺血技术具有可重复性。重要的是，所有动物的缺血严重程度相似。在缺血后肢周围绘制感兴趣区域（ROI），并在非缺血后肢周围绘制相应的ROI，用于灌注量化的分析。灌注水平以缺血肢体与非缺血肢体灌注值的比值表示。随时间推移监测灌注比值的变化。

在...

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讨论

小鼠CLI模型主要通过结扎股深动脉起始处远端的股动脉来建立4,5,6,7,8,9。研究表明，该方法大多保留了侧支循环的完整性，可在术后7天内恢复肢体血流9。通过切除股动脉可去除侧支循环床，但由于大部分侧支血管起源于髂内动脉，术后7天内仍可恢复高达三分之一的原始血流量7。Lejay et al 提出采用序贯结扎法，即在髂总动脉进行第二次结扎，从而有效减少来自髂内动脉的侧支灌注4。本方案中的关键步骤不仅包括识别腹股沟韧带上方的髂外动脉，还包括对远端髂外动脉、股动脉及伴行静脉的结扎与切除，这一...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 José Rino 和 Tânia Carvalho，他们分别是里斯本大学 João Lobo Antunes 医学分子研究所生物影像中心以及组织学与比较病理学实验室的负责人。我们还感谢里斯本新大学 Nova 医学院/医学科学学院解剖学系的 Vyacheslav Sushchyk。

资金参考：本项目由葡萄牙科学技术基金会（Fundação para a Ciência e a Tecnologia）资助，项目编号为 UID/IC/0306/2016。Paula de Oliveira 由葡萄牙科学技术基金会提供的博士奖学金（SFRH/BD/80483/2011）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
7500 Fast 实时荧光定量 PCR 仪Applied Biosystems仪器
丙酮Merk1000141000试剂；注意——高度易燃
腺苷Valdepharm试剂
阿替美唑OrionPharma试剂
硫酸钡（Micropaque）Guebert8671404 (ref. Infarmed)试剂
丁丙诺啡RichterPharma试剂
卡尔·蔡司 Opmi-1 FC 外科手术显微镜Carl Zeiss Microscopy, Germany仪器
cDNA RT2 PreAMP cDNA 合成试剂盒Qiagen7335730试剂
Leica CM 冷冻切片机Leica Microsystems3050S仪器
DAB 过氧化物酶底物试剂盒DAKO;Vector LaboratoriesK3468试剂
过氧化氢Merk1072090250试剂；注意——有害
疏水笔Dako411121试剂；注意——有毒
氯胺酮（Ketamidor）RichterpharmaCN:580393,7 630/01/12 Dfvf试剂
激光多普勒血流成像仪 moorLDI2-HIRMoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK5710仪器
Leica DM2500 直立式明场显微镜Leica Microsystems仪器
美托咪定（Medetor）Virbac037/01/07RFVPT试剂
甲醇VWRUN1230试剂；注意——有毒且高度易燃
罂粟碱Labesfal试剂
戊烷（Pentano Isso）Merk1060561000试剂；注意——高度易燃
Power SYBR® GreenApplied Biosystems4309155试剂
纯化大鼠抗小鼠 CD31 抗体Pharmingen550274试剂
RNeasy Micro 试剂盒Qiagen74004试剂
Surgic-Pro 6.0Medtronic (Coviden)VP733X缝线
VECTASTAIN ABC HRP 试剂盒（过氧化物酶，大鼠 IgG）Vectastain ABC kit; Vector LaboratoriesPK-4004试剂
Vicryl 5.0 / Vicryl 6.0Medtronic (Covidien)UL202/ UL101缝线
蔡司 PALM MicroBeam 激光显微切割系统Carl Zeiss Microscopy, Germany1023290916仪器
立体定位显微镜Carl Zeiss Microscopy, Germany仪器
数码相机Linux仪器

参考文献

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