评估小鼠后肢缺血模型中的治疗性血管生成

摘要

本文介绍了一种下肢缺血的实验模型，并结合一系列功能学、组织学和分子生物学检测方法 ，用于评估促血管生成疗法的有效性。​

摘要

严重肢体缺血（CLI）是一种具有较高下肢截肢风险的严重疾病。尽管血运重建是目前的金标准疗法，但仍有相当一部分CLI患者不适合接受外科或腔内血管重建治疗。促血管生成疗法正逐渐成为这类患者的潜在治疗选择，但目前仍处于研究阶段。在应用于人体之前，这些疗法必须在动物模型中进行测试，并且其作用机制必须被明确阐明。目前已建立了一种通过结扎并切除小鼠远端髂外动脉、股动脉及相应静脉来诱导后肢缺血（HLI）的动物模型。为全面评估缺血的影响以及潜在促血管生成疗法的效果，已整合了一套涵盖功能学、组织学和分子水平的检测方法。采用激光多普勒技术进行血流测量和灌注功能评估；通过腓肠肌组织切片抗CD31抗体染色后分析毛细血管密度，以及通过骨骼肌透化法测定侧支血管密度，来评价组织反应；在经激光显微切割分离小鼠腓肠肌组织中的内皮细胞（ECs）后，采用RT-PCR定量检测特定促血管生成因子的基因表达水平。这些方法能够灵敏地识别缺血与非缺血肢体之间、以及治疗与未治疗肢体之间的差异。本实验方案提供了一种可重复的CLI动物模型，以及用于评估促血管生成疗法的系统性框架。

引言

外周动脉疾病（PAD）主要影响下肢。PAD 由动脉粥样硬化引起，这是一种动脉阻塞，可导致下肢血流严重受限¹。间歇性跛行是 PAD 的首发表现，指行走时出现肌肉疼痛。慢性肢体缺血（CLI）是 PAD 最严重的阶段，诊断依据为患者出现缺血性静息痛、溃疡或坏疽²。CLI 患者截肢风险较高，尤其在未接受治疗的情况下³。目前，下肢血运重建（通过开放手术或腔内介入手术）是唯一可保留肢体的方法。然而，约 30% 的 CLI 患者因病变部位、动脉闭塞模式及严重合并症等原因，不适合接受上述治疗^4,5。因此，对于这些难以治疗的患者，亟需开发新的疗法，其中促进血管生成是当前研究最为集中的策略。

在进行人体试验之前，其有效性 新疗法的安全性和有效性 体内 在动物模型中必须考虑这些问题。目前已开发出多种用于研究CLI的模型，主要通过在小鼠中诱导后肢缺血（HLI）来实现。^6,7,8,

方案

所有动物实验程序均符合欧盟指令2010/63/EU，并已获得机构动物福利委员会批准，由葡萄牙动物保护主管机构DGAV授权（许可证号023861/2013）

警告：本实验方案中使用的多种化学试剂具有毒性且有害。请务必采取所有适当的安全措施，并穿戴个人防护装备（手套、实验服、长裤和不露脚趾的鞋子）

1. 小鼠后肢缺血模型

注意：所有实验均在22周龄的C57BL/6雌性小鼠上进行。

1. 溶液的制备
   1. 麻醉溶液的制备
      注意：该麻醉组合（美托咪定和氯胺酮）可提供长达30分钟的固定效果，并具有15分钟的手术窗口期。其作用可通过给予阿替美唑逆转。
      1. 使用一支洁净的1 cc注射器，抽取1 mL美托咪定（1 mg/kg体重），排除气泡以确保剂量准确，并将其加入一个15 mL离心管中。
      2. 使用一支洁净的1 cc注射器，抽取0.75 mL氯胺酮（75 mg/kg体重），排除气泡以确保剂量准确，并将其加入含有美托咪定的15 mL离心管中。
      3. 加入8.25 mL无菌生理盐水（0.9% NaCl），以获得10 mL麻醉溶液。
      4. 在管壁上标注化合物名称、配制日期和有效期。
      ....

结果

根据所述方案，脐带间充质干细胞和低剂量电离辐射（LDIR）被测试作为潜在的促血管生成疗法^11,12。在诱导缺血前以及从缺血诱导后即刻至缺血后45天的预设时间点，获取激光多普勒灌注读数。激光多普勒组织灌注结果以彩色编码图像记录，无灌注显示为深蓝色，最高灌注水平显示为红色。如图2A和3A所示，并在图2B和3B中进行量化，所有小鼠在诱导后肢缺血后即刻均出现后肢灌注完全丧失，证明该诱导后肢缺血技术具有可重复性。重要的是，所有动物的缺血严重程度相似。在缺血后肢周围绘制感兴趣区域（ROI），并在非缺血后肢周围绘制相应的ROI，用于灌注量化的分析。灌注水平以缺血肢体与非缺血肢体灌注值的比值表示。随时间推移监测灌注比值的变化。

在.......

讨论

小鼠CLI模型主要通过结扎股深动脉起始处远端的股动脉来建立^4,5,6,7,8,9。研究表明，该方法大多保留了侧支循环的完整性，可在术后7天内恢复肢体血流⁹。通过切除股动脉可去除侧支循环床，但由于大部分侧支血管起源于髂内动脉，术后7天内仍可恢复高达三分之一的原始血流量⁷。Lejay et al 提出采用序贯结扎法，即在髂总动脉进行第二次结扎，从而有效减少来自髂内动脉的侧支灌注⁴。本方案中的关键步骤不仅包括识别腹股沟韧带上方的髂外动脉，还包括对远端髂外动脉、股动脉及伴行静脉的结扎与切除，这一.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7500 Fast 实时荧光定量 PCR 仪	Applied Biosystems		仪器
丙酮	Merk	1000141000	试剂；注意——高度易燃
腺苷	Valdepharm		试剂
阿替美唑	OrionPharma		试剂
硫酸钡（Micropaque）	Guebert	8671404 (ref. Infarmed)	试剂
丁丙诺啡	RichterPharma		试剂
卡尔·蔡司 Opmi-1 FC 外科手术显微镜	Carl Zeiss Microscopy, Germany		仪器
cDNA RT2 PreAMP cDNA 合成试剂盒	Qiagen	7335730	试剂
Leica CM 冷冻切片机	Leica Microsystems	3050S	仪器
DAB 过氧化物酶底物试剂盒	DAKO;Vector Laboratories	K3468	试剂
过氧化氢	Merk	1072090250	试剂；注意——有害
疏水笔	Dako	411121	试剂；注意——有毒
氯胺酮（Ketamidor）	Richterpharma	CN:580393,7 630/01/12 Dfvf	试剂
激光多普勒血流成像仪 moorLDI2-HIR	MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK	5710	仪器
Leica DM2500 直立式明场显微镜	Leica Microsystems		仪器
美托咪定（Medetor）	Virbac	037/01/07RFVPT	试剂
甲醇	VWR	UN1230	试剂；注意——有毒且高度易燃
罂粟碱	Labesfal		试剂
戊烷（Pentano Isso）	Merk	1060561000	试剂；注意——高度易燃
Power SYBR® Green	Applied Biosystems	4309155	试剂
纯化大鼠抗小鼠 CD31 抗体	Pharmingen	550274	试剂
RNeasy Micro 试剂盒	Qiagen	74004	试剂
Surgic-Pro 6.0	Medtronic (Coviden)	VP733X	缝线
VECTASTAIN ABC HRP 试剂盒（过氧化物酶，大鼠 IgG）	Vectastain ABC kit; Vector Laboratories	PK-4004	试剂
Vicryl 5.0 / Vicryl 6.0	Medtronic (Covidien)	UL202/ UL101	缝线
蔡司 PALM MicroBeam 激光显微切割系统	Carl Zeiss Microscopy, Germany	1023290916	仪器
立体定位显微镜	Carl Zeiss Microscopy, Germany		仪器
数码相机	Linux		仪器