方法文章

测定小鼠肝脏中胆管密度

DOI：

10.3791/59587

⸱

2019年4月30日

 , 
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Medical Scientist Training Program (MSTP), Baylor College of Medicine, 3Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们介绍一种相对简单且灵敏的方法，用于精确量化小鼠肝脏中的胆管密度。该方法有助于评估遗传和环境因素的影响，以及潜在疗法在胆道疾病小鼠模型中的有效性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小鼠被广泛用作研究胆道疾病的模式生物。为了评估胆道系统的发育和功能，研究人员常采用多种技术，包括血清生化分析、组织学分析以及特定标志物的免疫染色。尽管这些技术能够提供有关胆道系统的重要信息，但它们通常无法全面呈现突变体或转基因小鼠整个肝脏中胆管（BD）发育缺陷的整体情况。部分原因在于，即使在胆道发育存在显著障碍的小鼠中，其肝脏仍具有较强的胆汁引流能力。本文介绍一种简便的方法，用于计算突变体或转基因小鼠肝脏各叶切片中每个门静脉（PV）所关联的平均胆管数量。该方法以标准化的方式对肝脏进行固定和切片，便于不同基因型和实验条件下样本之间的比较。通过细胞角蛋白染色后在光学显微镜下识别胆管上皮细胞来定位胆管，随后统计其数量，并除以肝组织切片中门静脉的总数。作为示例，我们展示了该方法如何清晰地区分野生型小鼠与Alagille综合征小鼠模型。本文所述方法不能替代用于可视化胆道树三维结构的技术，但它为定量评估小鼠胆管发育状况及胆管反应形成程度提供了一种简单而直接的手段。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胆道系统是哺乳动物肝脏的重要组成部分，负责将胆汁从肝细胞输送至肠道。肝内胆管（BDs）由胆管细胞构成，这些胆管细胞通过Notch和TGFβ信号通路从双潜能的肝母细胞分化而来1,2。胆管细胞的正确特化、命运决定及其组装形成成熟的胆管结构，对于肝内胆道系统的发育至关重要。在肝脏发育或器官再生过程中，随着肝脏的生长，胆道系统也必须相应发育，以确保胆汁的正常引流。此外，多种综合征性和非综合征性疾病会导致肝内胆管数量减少3。同时，许多急性和慢性肝病可引发所谓的胆管样反应（ductular reactions），其特征是肝脏中出现大量表达胆管标志物的细胞，但这些细胞并不一定来源于胆管细胞，也不一定形成通畅的胆管结构4。在多系统受累的Alagille综合征（ALGS）中，Notch配体Jagged1（JAG1）基因的单倍剂量不足会导致胆管发育不良和胆汁淤积5,6。我们实验室近期证实，先前构建的Jag1杂合小鼠品系7可作为ALGS中胆管稀少的动物模型8。在该ALGS小鼠模型中，胆管细胞仍然存在，但无法正常定植并整合为成熟、通畅的胆管结构8。因此，在胆管稀少模型中对肝脏进行分析时，仅观察胆管细胞的表观存在与否是不够的，准确评估肝脏中成熟胆管的存在程度尤为重要。

在解剖病理学中，存在公认的定量方法用于评估是否存在胆管稀少（BD paucity）9。例如，针对人类患者中阿拉杰里综合征（ALGS）的研究通常通过分析每例肝活检样本中至少10个门静脉结构来量化胆管（BD）与门静脉（PV）的比值9,10。结合血清生化指标，对开放性胆管的形态及其整体存在与否进行分析，可为小鼠胆管发育情况提供有价值的信息11,12,13。然而，小鼠可能在血清胆红素水平仅有轻度升高时即丢失大量胆管8。因此，一种能够评估每根门静脉所对应的胆管数量的定量方法，可更直接地反映小鼠胆管稀少的程度。在最近的一项研究中，我们量化了所有肝叶中每根门静脉对应的胆管数量，并报道了Jag1+/–动物中胆管与门静脉的比值显著降低8。在分析过程中我们注意到，尽管炎症反应和胆管样反应的程度存在显著差异，但胆管与门静脉的比值变异较小8。此外，通过对胆管与门静脉比值的定量分析，我们得以证明：在Jag1+/–动物中敲除一个拷贝的糖基转移酶基因Poglut1可显著改善其胆管稀少表型8。在Jag1+/+遗传背景下，血管平滑肌细胞中条件性缺失Poglut1会导致胆管数量进行性增加，该变化在出生后第7天（P7）时较为轻微（20–30%），但在成年个体中变得显著8。同样，该技术使我们能够证明，即使在P7阶段，这些动物中胆管密度的增加也具有统计学意义。值得注意的是，该基因型在四月龄时胆管密度的增加也通过树脂铸型分析得到了验证8。这些观察结果以及其他报道中对不同ALGS小鼠模型胆管密度的测量结果14,15促使我们将该方法纳入整体策略，用于分析多种突变型和转基因小鼠中的胆道缺陷。

本文详细介绍了一种简单的方法，可用于评估肝病小鼠模型中胆管（BD）缺失的程度（图1）。该方法通过使用胆管细胞标志物——细胞角蛋白（CK）8 和 CK19（下文简称广谱CK，wsCK）进行共染色，以可视化小鼠肝脏中的胆管及未整合的胆管细胞。染色过程中同时加入抗α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）抗体，用于标记血管。通过对涵盖所有肝叶的组织切片进行系统性分析，计算BD与门静脉（PV）的比例，从而确保每种基因型均分析足够数量的PV。由于本方法依赖于在二维图像中对BD和PV进行定量，因此不适用于研究特定突变对胆管树三维结构或细小胆管完整性的影响。尽管如此，该方法仍为研究人员提供了一种简便且客观的策略，用于评估小鼠胆管系统的发育情况。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有动物均按照机构动物护理和使用委员会指南及经批准的动物实验方案，饲养于贝勒医学院的屏障级动物设施中。

1. 小鼠肝脏组织的采集

  1. 小鼠肝脏采集前的准备
    1. 使用异氟烷对小鼠实施安乐死。
    2. 进行颈椎脱位以确认小鼠死亡。
    3. 在肋骨下方约一英寸处做横向切口。
    4. 充分暴露肝脏的整个腹侧表面。
  2. 小鼠肝脏的采集
    1. 使用小剪刀小心剪断肝脏与腹腔内其他器官相连的韧带。
    2. 剪断共同胆管（common BD），使肝脏与肠道分离。
    3. 握住胆囊小心取出肝脏，并立即放入装有四分之三体积4%多聚甲醛（PFA）的50 mL离心管中。

2. 肝脏的固定及石蜡包埋

  1. 固定
    1. 将肝组织在4% PFA中于4 °C固定48小时。
    2. 用70% EtOH在4 °C洗涤组织1小时。
    3. 用95% EtOH在4 °C各洗涤两次，每次1小时。
    4. 用100% EtOH在4 °C各洗涤两次，每次1小时。
  2. 透明
    1. 用透明剂（材料表）在室温下洗涤肝组织三次，每次30分钟。
      注意：第三次洗涤后，肝脏应感觉坚硬。
  3. 石蜡包埋
    1. 将组织包埋盒置于石蜡包埋模具中，进行三次洗涤，每次30分钟。石蜡应预热至60 °C。
    2. 向组织模具中加入石蜡至四分之三高度，并置于60 °C加热板上。
    3. 将肝脏置于模具中，腹面朝上。
    4. 小心将模具从加热板上取下。
    5. 将包埋盒盖放在模具上，并用热的液态石蜡加满。
    6. 让模具和组织块在室温下过夜冷却。
      注意：组织块现在可在室温下保存。

3. 肝组织切片

  1. 切片前组织块的准备
    1. 在取出组织块之前，将模具置于冰上5分钟。
    2. 将组织块放置在冰上，组织块与冰之间垫一张实验室用纸巾。
    3. 在不进行切片时，应将组织块保持在冰上，以获得最佳的组织切片效果。
  2. 肝脏组织块的切片
    1. 使用切片机，从肝脏的浅层背侧开始切片，切片厚度应为5 µm。
    2. 在解剖显微镜下检查浅层切片，确保切片无撕裂或折叠现象。
    3. 取包含尾状叶的肝脏切片。
      注意： 对于某些组织块，左叶、中叶、右叶和尾状叶可能位于同一组织切片上。
    4. 对于无法在同一张切片上同时显示四个叶的组织块，应继续切片，直至左叶、中叶和右叶同时出现在同一张切片上。

4. wsCK 和 αSMA 的免疫组织化学染色

  1. 免疫组织化学切片处理
    1. 为每种基因型选择一张待分析的切片。
    2. 将切片依次在二甲苯、100% 乙醇、95% 乙醇和70% 乙醇中各洗涤一次，每次15分钟（每种溶液中浸泡3次，每次5分钟）。
    3. 在去离子水（H2O）中洗涤切片5分钟。
    4. 将切片浸入抗原修复液（Tris缓冲液，高pH值）中。
    5. 在压力锅中加压加热3分钟，压力为10 psi。
    6. 让切片自然冷却至室温（约35分钟）。
  2. 组织切片封闭
    1. 使用Pap Pen在切片上标记出组织区域的轮廓。
    2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）+ 0.1% Tween覆盖切片，洗涤两次，每次5分钟。
    3. 配制封闭缓冲液：将正常山羊血清（NGS）以1:50比例加入PBS + 0.3% Triton中。为确保封闭和一抗孵育均有足够缓冲液，每张切片准备100 µL即可。
    4. 每张切片上加100 µL封闭液。
    5. 将加有封闭液的切片在4 °C下孵育1小时。
  3. wsCK 和 αSMA 染色
    1. 使用封闭缓冲液将抗CK8和抗CK19抗体16（Developmental Studies Hybridoma Bank，分别为TROMA-I和TROMA-III）按1:20稀释，用于wsCK染色；在同一缓冲液中将抗αSMA抗体17（材料表）稀释至1:200。
    2. 每张切片上加100 µL含上述三种抗体的稀释液。
    3. 将加有抗体溶液的切片在4 °C下孵育过夜。
    4. 用PBS + 0.1% Triton洗涤切片三次，每次5分钟。
    5. 将二抗（抗大鼠-Alexa488和抗小鼠-Cy5）以1:200比例溶于PBS + 0.3% Triton中进行稀释。
    6. 每张切片上加100 µL含两种二抗的稀释液。
    7. 在室温下孵育1小时。
  4. DAPI 核染色与封片
    1. 用PBS洗涤切片三次，每次5分钟。
    2. 每张切片加100 µL DAPI（1:3000），染色10分钟。
    3. 向切片上加抗荧光淬灭封片剂（材料表），并在组织区域上加盖玻璃盖玻片。将切片置于4 °C过夜，次日进行封固。
    4. 将切片存放在4 °C，封片后一周内完成成像。

5. BDs 的成像与定量分析

  1. 肝脏切片成像
    1. 成像前，在实验室成员的协助下对样本的基因型进行盲化处理。确保所有成像文件中均不包含基因型或其他特定识别信息，仅保留动物/样本编号。
    2. 使用荧光显微镜以20倍物镜、1倍缩放拍摄每个切片的图像，并确保每个PV 对肝脏进行成像，包括左叶、方叶、右叶和尾状叶。
      注意： 每只动物通常可发现60至90个门管区，具体数量取决于肝脏大小。
    3. 为了鉴定门静脉支，需观察αSMA与wsCK的共染色情况。仅呈αSMA阳性而无wsCK染色的结构不属于门管区结构。
  2. BDs的鉴定与计数
    1. 创建一个包含以下列的电子表格：动物/样本编号、图像编号、PV数量和BD数量。
    2. 逐张检查图像，识别并记录每张图像中PV的数量。
    3. 通过观察每个图像中是否存在围绕明确管腔的胆管上皮细胞（wsCK+）来识别专利性胆管结构（BDs）。这些结构应清晰可辨，并由间质组织与其他wsCK+细胞分隔开。
    4. 统计每个有专利的BD，并将其填入与图像编号相同的列中。
    5. 对每张拍摄的PV图像都进行此操作。
    6. 计算肝样本中所有PV和BD的总和。
    7. 计算肝组织样本的BD与PV比值。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们先前已记录了Jag1+/–动物中的胆道缺陷，这是一种ALGS的小鼠模型8。为了确定胆管（BD）与门静脉（PV）的比例，我们对出生后30天（P30）小鼠肝脏进行切片，并联合染色CK8和CK19（wsCK）以及血管标志物αSMA。随后，我们对每个肝叶中的所有门静脉进行了成像。如图2A所示，我们将门静脉定义为具有相邻wsCK染色（箭头所示）的αSMA染色血管。仅有αSMA染色而无wsCK染色的结构为中央静脉，不应纳入分析（箭头）。

确定门静脉（PV）后，我们根据其特征性形态识别出开放的胆管（BD）。如图3所示，开放的胆管具有清晰可辨的管腔，周围被细胞角蛋白广谱抗体（wsCK）阳性的胆管上皮细胞（cholangiocytes）所包绕。这些胆管通常由间充质组织与邻近的胆管或胆...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

分析小鼠胆管（BD）的发育与修复是研究胆汁淤积性疾病发病机制和病理机制的重要工具。此外，新疗法的开发在一定程度上依赖于建立可重复且尽可能可量化的表型。目前在小鼠模型中的表型分析通常包括血清生化检测、肝脏组织学检查以及细胞类型特异性标志物的免疫染色。尽管这些技术能够提供有关胆道系统结构与功能的宝贵信息，但它们无法直接衡量特定基因操作对胆管数量的影响。在解剖病理学中，人类患者的胆管稀少症是通过活检切片中胆管与门静脉（PV）比例的分析来确定的9。虽然临床医生常采用血清生化分析来评估Alagille综合征（ALGS）及其他胆汁淤积性疾病中胆汁淤积和肝病的严重程度18,19，但在小鼠模型中进行组织学评估对于理解疾病修饰因子对胆管发育的影响以及评估治疗手段恢复正常胆管发育的效果至关重要。部分原因在于，小鼠即使出现开放性胆管数量严重减少，其血清胆红素水平也可能仅呈现轻度升高8，这可能是由于小鼠肝脏具有高效的胆汁引流能力所致。我们先前的研究表...

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致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢美国国立卫生研究院（NIH）（R01 GM084135 和 R01 DK109982）、德克萨斯医学中心消化疾病中心在 NIH P30 DK56338 项目下提供的试点/可行性奖励，以及来自医学基金会的阿拉吉尔综合征加速奖。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
异氟烷（Isoflurane）Henry Schein11695-6776-2
干燥器Bel-Art16-800-552
10% PFAElectron Microscopy Sciences15712
50 mL 离心管ThermoScientific339653
70% 乙醇Decon Laboratories2401
95% 乙醇Decon Laboratories2801
100% 乙醇Decon Laboratories2701
HistoChoiceVWR Life SciencesH103-4L透明剂
Omnisette 组织包埋盒Fisher HealthCare15-197-710E
MacrosetteSimportM512
Paraplast X-TRAMcCormick Scientific39503002石蜡
组织包埋模具Fisher Scientific62528-32
切片机MicromHM 325
Superfrost Plus 显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-15
二甲苯Fisher ScientificC8H10
Tris 基抗原修复液Vector LaboratoriesH-3301
高压锅Instant PotLux Mini
小型 Pap PenLife Technologies8877
聚氧乙烯 20 山梨醇单月桂酸酯（Tween-20）J.T. BakerX251-07
辛基苯基聚氧乙烯醚（Triton-X-100）J.T. BakerX198-07
正常山羊血清Jackson Immunoresearch005-000-121
抗-CK8 抗体发育研究杂交瘤库TROMA-I抗体注册号 AB531826
抗-CK19 抗体发育研究杂交瘤库TROMA-III抗体注册号 AB2133570
抗-αSMA 抗体Sigma AldrichA2547, 克隆号 1A4
抗大鼠-Alexa488 二抗ThermoFisherA21208
抗小鼠-Cy5 二抗Jackson Immunoresearch715-175-151
DAPIVector LaboratoriesH-1000
22 × 50 mm2 微型盖玻片VWR Life Sciences48393 059
荧光显微镜LeicaDMI6000 B
Kimwipes 擦镜纸Kimtech Science05511
VECTASHIELDVector LaboratoriesH-1000抗荧光淬灭封片剂

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
  2. Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
  3. Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
  4. Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
  5. Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235(1997).
  6. Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243(1997).
  7. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  8. Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
  9. Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
  10. Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
  11. Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
  12. Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
  13. McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
  14. Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
  15. Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
  16. Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
  17. Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
  18. Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526(2010).
  19. Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
  20. Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
  21. Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
  22. Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
  23. Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
  24. Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
  25. Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
  26. Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272(2012).
  27. Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
  28. Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).

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Alpha SMA

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