使用微量滴定板放射性标记法结合薄层色谱进行体内多重复测定大肠杆菌（Escherichia coli）的(p)ppGpp水平

摘要

在微量滴定板中培养放射性标记的细菌，可实现高通量取样，从而对核苷酸池含量（包括(p)ppGpp）进行多次技术重复和生物学重复检测。可监测由生理应激源引发的生长转换及其从应激中恢复过程中的效应。

摘要

(p)ppGpp 核苷酸在细菌中作为全局性调控因子，响应多种物理和营养胁迫。其响应迅速，可在数秒内启动，导致其浓度迅速积累至接近甚至超过 GTP 池的水平。当胁迫解除时，(p)ppGpp 会迅速降解，半衰期通常不足一分钟。(p)ppGpp 的存在会引起细胞基因表达和代谢的改变，从而抵消胁迫带来的损伤。革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有不同的响应机制，但二者均依赖于 (p)ppGpp 的浓度。因此，在关键的胁迫转换期，有必要在从10秒到数小时不等的时间间隔内，同时监测多个放射性标记的细菌培养物。本实验方案旨在解决这一技术难题。该方法利用温度和摇床可控的微量滴定板培养箱，可并行监测生长情况（吸光度）并快速取样均一磷酸盐放射性标记的培养物，随后通过聚乙烯亚胺-纤维素薄层色谱法分离并定量核苷酸池。该方法仅需少量样品，即可完成多次技术重复和生物学重复分析。诸如双相生长及快速 (p)ppGpp 转换速率等复杂的生长转换过程，均可通过此方法进行定量评估。

引言

（p）ppGpp 是一种全局性调控的第二信使，可调节大量基因的表达，包括核糖体和氨基酸合成相关基因^1,2。尽管最初在Escherichia coli中被发现³，（p）ppGpp 也存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中，以及植物叶绿体中^4,5。对于大肠杆菌（E. coli）及其他革兰氏阴性菌而言，（p）ppGpp 可在两个不同位点直接与RNA聚合酶相互作用^6,7,8。在革兰氏阳性菌中，（p）ppGpp 抑制GTP的丰度，而GTP的变化可被CodY蛋白感知；CodY是一种GTP结合蛋白，具有特异性的DNA识别基序，从而介导基因表达调控^9,10。（p）ppGpp 在多种营养缺乏和应激条件下会积累，导致生长减缓，并通过调节基因表达帮助细胞适应压力环境^11,<....

方案

1. 培养基制备

1. 对于MOPS（3-(N-吗啉代)丙磺酸）培养基²⁵，使用1/10体积的10倍浓缩MOPS盐溶液、1/100体积的100倍浓缩微量元素溶液、用于过夜培养的3 mM磷酸钠或用于³²P均匀标记的0.2 mM磷酸钠、0.2%葡萄糖以及1 µg/mL硫胺素（维生素B1）。如需要，添加氨基酸至终浓度40 µg/mL。
   1. 配制MOPS盐溶液时，使用以下成分：400 mM MOPS、40 mM Tricine、0.1 mM FeSO₄、95 mM NH₄Cl、2.6 mM K₂SO₄、5 µM CaCl₂、10.56 mM MgCl₂和500 mM NaCl。按上述顺序依次加入各组分，以避免沉淀。用KOH调节pH至7.4，并通过过滤除菌。
   2. 配制100倍浓缩微量元素溶液时，使用以下成分：3 µM (NH₄)₆(MO₇)₂₄、0.4 mM H₃BO₄、30 µM CoCl₂、10 µM CuSO₄、80 µM MnCl₂和10 µM ZnS....

结果

在 E. coli K-12 菌株中，添加缬氨酸会引发异亮氨酸的内源性饥饿，导致 5 分钟后 ppGpp 水平升高³。在 MOPS 培养基中培养的细胞（除 ILV 外含有所有氨基酸）按 图1 所示用 ³²P 进行标记。标记后，加入 6 µL 浓度为 10 mg/mL 的 L-缬氨酸（终浓度为 100 µg/mL），以诱导异亮氨酸饥饿。在添加缬氨酸后 0 和 5 分钟分别取样。5 分钟后（图3A），ppGpp 和 pppGpp 的水平分别增加了 2 倍和 2.5 倍。作为阴性对照，使用无细胞标记样品以检测 ³²P 来源中可能存在的非正磷酸盐化合物。此外，使用 ppGpp 缺陷型菌株（ΔrelA ΔspoT）作为阴性对照有助于更准确地鉴定斑点。

异亮氨酸饥饿的逆转可通过氯.......

讨论

实现细胞的近乎均匀标记是本实验方案的关键步骤。因此，使用成分明确的培养基（如MOPS或Tris培养基）至关重要，以便调控载体磷酸盐浓度和比活性。不能使用磷酸盐缓冲培养基，例如M9或培养基A。大多数成分未明确的培养基含有可变含量的磷酸盐，例如LB、胰蛋白胨和酪蛋白氨基酸。磷酸同位素³³P是一种较弱的放射性发射体，可替代³²P。这种替代的优点在于安全性更高，且半衰期为25天，而³²P的半衰期为14天。然而，³²P能量更高的辐射显著提高了检测灵敏度。必须强调操作同位素时的危险性，以及采取适当屏蔽防护和规范处置的重要性。最近发现一种能够特异性识别ppGpp²⁸的核糖开关，未来可能为在体外和体内检测ppGpp提供更安全的方法。如引言中所述，尽管存在其他检测方法，磷酸标记法仍是检测细菌（p）ppGpp以及其他磷酸化化合物（如核糖或脱氧核糖-NTP池、PRPP、PPi或糖磷酸盐）的一种灵敏、直接且快速的高通量检测手段。

另一个关键步骤是确保平行培养物（摇床培养箱.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(NH4)6(MO7)24	费舍尔科技公司	A-674
放射自显影胶片	丹维尔科学公司	E3218
CaCl2	J.T.贝克公司	1-1309
氯霉素	RPI公司	C61000-25.0
CoCl2	费舍尔科技公司	C-371
CuSO4	J.T.贝克公司	1843
FeSO4	费舍尔科技公司	I-146
甲酸	费舍尔生物科技公司	BP1215-500
葡萄糖	Macron公司	4912-12
H3BO4	Macron公司	2549-04
H3PO4	J.T.贝克公司	0260-02
K2SO4	西格玛公司	P9458-250G
KH2PO4	费舍尔生物科技公司	BP362-500
L-缬氨酸	西格玛公司	V-6504
MgCl2	费舍尔科技公司	FL-06-0303
微孔板读数仪 Synergy HT	伯腾公司	Synergy HT
MnCl2	西格玛公司	M-9522
MOPS	西格玛公司	M1254-1KG
Na2HPO4	马林克罗特公司	7892
NaCl	J.T.贝克公司	3624-01
NaH2PO4	马林克罗特公司	7917
NH4Cl	西格玛公司	A0171-500G
P-32 放射性核素，1 mL 水中的正磷酸（5 mCi）	珀金埃尔默公司	NEX053005MC
储存式磷屏	柯达公司	So230
恒温混匀仪	艾本德公司	5382000015
硫胺素	西格玛公司	T-4625
TLC PEI 纤维素 F	默克-密理博公司	1.05579.0001
Tricine	RPI公司	T2400-500.0
Typhoon 9400 成像仪	GE 医疗集团
ZnSO4	费舍尔科技公司	Z-68