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方法文章

无核酸酶氧清除剂原儿茶酸3,4-双加氧酶的表达与纯化

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DOI：

10.3791/59599

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2019年11月8日

 ,  ,  , 
1Cancer Biology and Genetics, College of Medicine, The Ohio State University

本文内容

摘要

原儿茶酸3,4-双加氧酶（PCD）可利用其底物原儿茶酸（PCA）在水相体系中通过酶促反应去除游离的双原子氧。本方案描述了该除氧酶的表达、纯化及活性分析方法。

摘要

单分子（SM）显微技术用于实时研究荧光标记生物分子的动态分子相互作用。然而，荧光基团易受溶解氧（O2）引起的光漂白影响而导致信号丢失。为防止光漂白并延长荧光基团的寿命，通常采用氧气清除系统（OSS）来降低O2浓度。市售的OSS可能被核酸酶污染，从而损伤或降解核酸，干扰实验结果的解读。本文详细描述了一种高效表达与纯化无核酸酶污染的Pseudomonas putida原儿茶酸-3,4-双加氧酶（PCD）的实验方案。PCD可通过将底物原儿茶酸（PCA）转化为3-羧基-顺,顺-粘康酸，有效清除活性O2物种。该方法适用于任何O2对数据采集产生不利影响的水相体系。与市售PCD相比，本方法在制备高活性且无核酸酶污染的PCD方面更具优势。

引言

单分子生物物理学是一个快速发展的领域，正在改变我们观察生命现象的方式 生物现象。该领域具有独特的能力，可将物理学和化学的基本定律与 生物学。荧光显微镜是一种可实现单分子灵敏度的生物物理方法。通过将生物分子与小分子有机荧光染料或量子点连接，利用荧光对其进行检测1这些分子在激光激发下可在发生不可逆光漂白前发射光子2荧光标记发生化学损伤时会出现光漂白现象 从而破坏其在目标波长下激发的能力2,3活性氧（ROS）在水相缓冲液中的存在是光漂白的主要原因2,4此外，活性氧（ROS）可损伤生物分子，导致单分子实验（SM实验）中出现错误的观测结果5,6为防止氧化损伤，可使用氧气清除系统（OSS）。3,7,8葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶（GODCAT）系统在去除氧气方面具有高效性8，但会产生可能具有破坏性的过氧化物作为中间产物。这些过氧化物可能对单分子研究中关注的生物分子造成损伤。

或者，原儿茶酸3,4-双加氧酶（PCD）可利用其底物原儿茶酸（PCA）高效去除水溶液中的O27,9。PCD是一种金属酶，利用非血红素铁结合PCA，并以溶解态O2催化儿茶酚环的开环反应10。研究表明，该一步反应在整体上优于其他OSS系统，可提高单分子实验（SM实验）中荧光团的稳定性7。然而，许多市售的OSS酶（包括PCD）含有污染性核酸酶11，这些污染物可能导致单分子实验中所用核酸类底物的降解。本文将阐明 一种基于色谱的纯化方案，用于在单分子系统中使用重组PCD。PCD可广泛应用于任何活性氧（ROS）会破坏数据采集所需底物的实验中。

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方案

1. 在大肠杆菌（E. coli）中诱导PCD表达

  1. 在离心管中混合1 μL pVP91A-pcaHG PCD表达质粒（20 ng/μL，图1A）和20 μL E.coli BL21（20 μL市售菌株，> 2 x 106 cfu/μg质粒）。轻弹管壁混匀，将离心管置于冰上5分钟。
  2. 将转化体系在42 °C下热激30秒，随后立即置于冰上2分钟。
  3. 加入80 μL SOC培养基（含分解代谢抑制的超优肉汤：2.5 mM KCl、10 mM NaCl、2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、10 mM MgSO4、10 mM MgCl2、20 mM葡萄糖），在37 °C下以225转/分钟（rpm）振荡培养1小时。
  4. 将转化反应液涂布于LB氨苄琼脂平板（1 L LB琼脂：10 g NaCl、10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、15 g琼脂、50 μg/mL氨苄青霉素；每10 cm直径培养皿使用25 mL）。
  5. 将平板倒置，在37 °C下培养16–18小时。
  6. 从平板上挑取单菌落接种至250 mL锥形瓶中的50 mL LB氨苄液体培养基（1 L LB：10 g胰蛋白胨、10 g NaCl、5 g酵母提取物、50 μg/mL氨苄青霉素），在37 °C下以225 rpm振荡培养16–18小时。
  7. 将20 mL种子液转移至含1 L LB氨苄培养基的4 L锥形瓶中，在37 °C下以225 rpm振荡培养。
  8. 每小时测定一次菌液OD600（600 nm处的光密度值）。当OD600接近0.5时，将测量频率提高至每15分钟一次。目标菌液密度为0.5 OD600。
  9. 将4 L锥形瓶置于冰浴中，轻轻摇动以降低菌液温度。
    注意： 冰浴时间应尽可能短，以保持细胞的代谢活性。理想情况下，冰浴时间应少于10分钟。
  10. 程序性细胞死亡（PCD）的成功诱导可通过变性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析进行观察。取1 mL未诱导的菌液置于离心管中，在室温下以14,000 × g离心1分钟，弃去上清液。
    1. 用150 μL PBS（磷酸盐缓冲盐水）重悬菌体沉淀。
    2. 加入等体积的2×上样缓冲液（1.2% SDS、30%甘油、150 mM Tris-HCl，pH 6.8、0.0018%溴酚蓝、15% β-巯基乙醇），涡旋混匀。
    3. 将样品煮沸3分钟，随后立即置于冰上。样品可于-20 °C冰箱中保存以备后续分析。
      注意： PBS市售产品可能含或不含CaCl2和MgCl2。许多实验室在细胞培养方法中使用不含CaCl2和MgCl2的PBS。我们发现使用含或不含CaCl2和MgCl2的PBS对实验结果无显著差异。
  11. 将4 L锥形瓶转移至17 °C、180 rpm振荡的培养箱中继续培养，每20分钟监测一次OD600。
  12. 当OD600达到0.7时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.5 mM（使用0.25 M储存液），并加入硫酸亚铁铵（六水合物）至终浓度10 mg/L（使用10 mg/mL储存液，Fe(NH4)2(SO4)2）。PCD基因pcaH和pcaG通过添加IPTG从T5启动子诱导表达（图1A）。硫酸亚铁被PCD结合，并在儿茶酚开环反应中通过配位氧分子发挥催化作用所必需。
  13. 在17 °C、180 rpm条件下继续振荡培养18小时。
  14. 参照步骤1.2将菌液锥形瓶置于冰浴中，参照步骤1.3取1 mL诱导后的菌液进行SDS-PAGE分析。
  15. 将菌液转移至适合离心的瓶子中。1 L菌液可分装至4个250 mL锥形离心瓶中，在4 °C、3000 × g条件下离心20分钟，弃去上清液，并妥善处理细菌液体废弃物。
  16. 用移液器将每升菌液的沉淀重悬于25 mL冷PBS中（CaCl2和MgCl2可选添加）。
  17. 将重悬液转移至50 mL锥形管中（每升菌液使用1个50 mL管），在4 °C、3000 × g条件下离心20分钟，弃去上清液并妥善处理。
  18. 用移液器将细胞重悬于10 mL裂解缓冲液（300 mM NaCl、50 mM Tris-HCl，pH 7.5、20 mM咪唑、10%甘油、800 ng/mL抑肽酶、1 μg/mL亮抑蛋白酶肽、87.1 μg/mL苯甲基磺酰氟（PMSF））中。使用液氮在杜瓦瓶中速冻重悬液，将样品管储存于-80 °C冰箱中。我们曾使用储存于-80 °C长达一年的菌体沉淀纯化PCD，未见明显活性损失。
  19. 通过SDS-PAGE比较未诱导和诱导后的菌体蛋白表达情况。
    注意： 我们在PCD异源二聚体的诱导方面未遇到困难，但仍建议在继续纯化前先测试诱导效果，以防某些试剂意外失效。
    1. 准备SDS-PAGE凝胶板（尺寸：7.3 cm × 8.3 cm × 0.75 mm厚）。浓缩胶为1.5 mL 6%聚丙烯酰胺（6%丙烯酰胺、125 mM Tris-HCl，pH 6.8、0.1% SDS、0.1%过硫酸铵、0.001% TEMED）。分离胶为3.5 mL 12%聚丙烯酰胺（12%丙烯酰胺、375 mM Tris-HCl，pH 8.8、0.1% SDS、0.1%过硫酸铵、0.001% TEMED）。在浓缩胶层插入10孔梳子。
    2. 每孔上样10 μL未诱导和诱导的细菌样品，另取4 μL预染蛋白分子量标准品上样（图1B）。
    3. 以约16.5 V/cm的电压进行电泳，持续约1小时，直至溴酚蓝迁移至凝胶底部。
    4. 将凝胶放入塑料容器中的考马斯亮蓝染色液（10%乙酸、40%甲醇、0.1%考马斯亮蓝染料）中，确保染色液完全浸没凝胶。室温染色20分钟，可选择轻柔摇动。
    5. 更换为脱色液（10%乙酸、40%甲醇），室温孵育并可选择轻柔摇动，直至蛋白条带清晰可见。
    6. 用去离子水替换脱色液。在细菌总蛋白中，诱导后的PCD亚基应在诱导样品中可见。六组氨酸标签的PCD亚基pcaH分子量为28.3 kDa，pcaG亚基为22.4 kDa。若未观察到明显的PCD亚基条带，应重新挑取新菌落进行诱导。

2. PCD 的镍亲和层析纯化

  1. 将一管50 mL的诱导细胞置于冰上解冻。样品完全解冻可能需要2-3小时。
  2. 保持试管在冰上，以30%的振幅对样品进行1分钟超声处理，工作周期为开1秒、关1秒。使用锥形微头（直径0.125英寸）超声破碎仪。最大功率为400 W，频率为20 kHz，适用于每升培养物沉淀。
  3. 超声处理后，加入溶菌酶至终浓度0.2 mg/mL（使用10 mg/mL的储存液），并在冰上于4 °C孵育30分钟。
  4. 将细菌裂解物倒入预冷的聚碳酸酯瓶中（尺寸：25 mm × 89 mm）。该瓶子应与固定角转子超速离心机兼容。可使用其他试管和/或转子替代，但最终离心力必须保持一致。
  5. 在4 °C下以120,000 × g离心60分钟。细胞碎片将形成沉淀，上清液可能呈黄色。
    1. 可在后续SDS-PAGE分析中包含该沉淀，以确定PCD的溶解性（图1B）。通过在10 mL PBS中涡旋振荡溶解沉淀，转移150 μL至1.5 mL离心管中。按步骤1.3的方法制备样品用于SDS-PAGE。
  6. 将上清液转移至预冷的50 mL锥形管中，记录体积。若上清液被细菌DNA污染，样品可能变得黏稠，细菌基因组DNA可能堵塞层析柱流速。此时应重复步骤2.2的超速离心以沉淀细菌DNA。第二次离心所得沉淀可能不易观察或呈透明状。
  7. 配制500 mL Ni Buffer A（300 mM NaCl、50 mM Tris-HCl，pH 7.5、10%甘油、800 ng/mL抑肽酶、1 μg/mL亮抑蛋白酶肽和87.1 μg/mL PMSF）和500 mL Ni Buffer B（300 mM NaCl、50 mM Tris-HCl，pH 7.5、10%甘油、800 ng/mL抑肽酶、1 μg/mL亮抑蛋白酶肽和87.1 μg/mL PMSF、250 mM咪唑，pH 8.0）。将两种Ni缓冲液均通过0.2 μm孔径滤器过滤。
  8. 样品、缓冲液及FPLC（快速蛋白液相色谱）系统均置于4 °C冷藏室内。使用Ni Buffer A冲洗泵A，使用Ni Buffer B冲洗泵B。用含20 mM咪唑的缓冲液（8% Ni Buffer B，92% Ni Buffer A）冲洗系统，直至紫外吸收值和电导率稳定。常规操作中流速为5 mL/min，压力上限为1.0 MPa。流速和压力上限应根据所用FPLC仪器的规格确定。
  9. 准备一根装有1.5 mL镍离子负载树脂的层析柱（尺寸：长110 mm × 直径5 mm）。树脂结合能力为50 mg/mL，可耐受1 MPa压力。可在纯化前将柱子装好并储存于4 °C。
    注意： 若需要处理超过一管50 mL的诱导细胞以获得更多的蛋白，可按比例增大柱体积。我们通常每次纯化均使用新柱，以确保目标蛋白不被残留蛋白污染。然而，镍树脂可根据制造商说明进行回收再利用。
  10. 将镍离子负载树脂柱连接至FPLC系统。以0.5 mL/min流速、0.5 MPa压力上限，用20 mL含20 mM咪唑的缓冲液（92% Ni Buffer A和8% Ni Buffer B）过柱平衡。FPLC系统应实时监测A280（280 nm紫外吸收值）和电导率。若在20 mL缓冲液通过后这些数值仍未稳定，则继续冲洗直至稳定。
  11. 以0.15 mL/min流速将样品（约10 mL）上样至柱中，设定压力上限为0.5 MPa，收集穿流液。
  12. 用20 mL含20 mM咪唑的Ni缓冲液（92% Ni Buffer A和8% Ni Buffer B）洗涤层析柱，将洗脱液保留在50 mL管中用于分析。再用15 mL含125 mM咪唑的缓冲液（50% Ni Buffer A和50% Ni Buffer B）洗涤柱子，收集洗脱液为19个组分，每管0.8 mL。随后用15 mL 100% Ni Buffer B洗涤柱子，额外收集75个组分，每管0.2 mL。部分PCD异源二聚体将在50% Ni Buffer B洗脱时出现，但大部分异源二聚体将在100% Ni Buffer B洗脱时被洗出。
  13. 在12% SDS-PAGE凝胶上分析所收集的各组分，确认PCD的存在。向穿流液、洗涤液及A280峰组分中加入等体积的2×上样缓冲液，煮沸3分钟，然后置于冰上。倒入两块12% SDS-PAGE凝胶（如步骤1.7所述），重复1.7中描述的凝胶方法。

3. 核酸酶活性检测

  1. 根据 SDS-PAGE 分析，确定含有近乎纯的 PCD 的镍亲和层析组分。将 5 μL 层析组分与 500 ng 3 kb 超螺旋质粒 pXba+ 加入反应缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，100 mM NaCl，5 mM MgCl2，0.1 mM DTT）中，总体积为 50 μL。
    1. 在 37 °C 下孵育 1 小时。
    2. 设置阴性对照（不加蛋白）和阳性对照（商用 PCD）。加入 10 μL 终止液（150 mM EDTA，pH 8.0，0.6% SDS，18% 甘油，0.15% 橙 G）终止反应。
    3. 样品可保存于 -20 °C 冰箱中，待后续分析。在核酸酶活性检测中可使用任何超螺旋质粒，只要超螺旋和松弛环状的反应产物可通过琼脂糖凝胶电泳分辨即可。
  2. 在凝胶模具（尺寸：15 × 10 cm）中倒入 120 mL 含 1% 琼脂糖的 1× TAE 溴化乙锭缓冲液（40 mM Tris-乙酸盐，1 mM EDTA，0.5 µg/mL 溴化乙锭）。使用 15 孔梳子（孔尺寸：5 mm × 1.5 mm）。待凝胶凝固后，将其浸入 1× TAE 溴化乙锭缓冲液中。
  3. 取 30 μL 反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。在室温下以 10 V/cm 的电压电泳约 1 小时，橙 G 染料前沿应迁移至凝胶末端。
  4. 立即使用荧光扫描仪成像凝胶中的溴化乙锭信号。若使用 3 kb 质粒，则最慢条带为约 3.5 kb 的松弛环状 DNA，线性 DNA 迁移在 3 kb 处，而超螺旋质粒迁移最快，位于约 2 kb 处。
    1. 使用图像分析软件计算每条带的总像素体积。
    2. 测定不同 DNA 形式（如超螺旋、线性及切口环状）的像素体积，并据此计算各 DNA 形式的百分比。例如，与阴性对照相比，若某组分中切口环状 DNA 的比例升高，则表明存在核酸酶活性。计算方法为：将某泳道中切口环状 DNA 的像素体积除以该泳道总 DNA 的像素体积，再乘以 100 得到百分比。
  5. 根据 SDS-PAGE 分析结果，合并第二洗脱峰中几乎纯的 PCD 异源二聚体组分，且其核酸酶活性应极低或检测不到。我们通常合并的体积约为 2 mL。
  6. 将样品加入截留分子量为 10 kDa 的离心过滤装置中。在 4 °C 条件下，于摆桶转子中以 4000 × g 离心 40 分钟。也可使用 35° 固定角转子，在 4 °C 条件下以 7500 × g 离心 20 分钟。
    1. 重复离心操作，直至最终截留液体积为 100–200 μL。
    2. 将滤膜装置倒置，于 4 °C 条件下以 1000 × g 离心 2 分钟，回收截留液。

4. PCD 的凝胶过滤层析纯化

  1. 配制 250 mL 尺寸排阻色谱（SEC）运行缓冲液（100 mM NaCl、50 mM Tris-HCl，pH 7.5、10% 甘油、0.1 mM EDTA、800 ng/mL 胃蛋白酶抑制剂、1 μg/mL 亮肽素和 87.1 μg/mL PMSF）。将缓冲液通过 0.2 μm 孔径滤膜过滤，并于 4 °C 保存。
    注意： 所有操作步骤均需在 4 °C 的冷藏环境中进行。尺寸排阻色谱纯化为可选步骤，但蛋白应保存在 SEC 运行缓冲液中。若省略 SEC 纯化步骤，则应在 4 °C 下将 3.6.2 步骤中收集的截留物置于 10 kDa 截留分子量（MWCO）透析袋中，对 1 L SEC 缓冲液透析过夜。
  2. 使用 SEC 运行缓冲液以 0.5 mL/min 流速平衡交联琼脂糖 SEC（尺寸排阻色谱）柱（规格：10 mm × 300 mm；柱床体积 24 mL；上样体积 25–500 μL；耐压上限 1.5 MPa；排阻极限 2 × 106 Da；分离范围 1–300 kDa）。
    注意： 如有需要，可使用其他尺寸的 SEC 柱替代。
  3. 将浓缩后的组分加载至 200 μL 体积的进样环中，并以 0.5 mL/min 流速上样至色谱柱。上样体积越小，SEC 分辨率越高。用 23 mL SEC 运行缓冲液洗脱，共收集 94 个 250 μL 的组分。SEC 色谱图应呈现一个单一的 A280 峰，对应 PCD 异源二聚体。我们发现 PCD 在 8.9 mL 处洗脱。若使用不同的 SEC 柱，洗脱时间将有所变化。

5. PCA 氧化与核酸酶活性检测

  1. 在96孔平底板中进行检测PCA氧化和核酸酶活性的反应。在4 °C冷室中将反应体系置于冰上，在96孔板中组装反应，以防止过早发生催化反应。最终反应体积为50 μL，包含：130 mM NaCl、50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、5 mM MgCl2、0.1 mM DTT、5 mM PCA、10 ng/mL超螺旋质粒pXba+以及10 μL单独的PCD SEC组分。
    注意：PCD SEC组分应最后加入，并在加入后立即开始分析，因为蛋白在加入时即开始催化反应。
  2. PCD对PCA的氧化导致PCA在290 nm处的吸光度（A290）降低。将96孔板转移至设定内部温度为37 °C的酶标仪样品架上。将样品架缩回仪器内，每隔20秒测量一次A290，持续1小时。每次读数前让仪器振荡板子5秒。
  3. 反应1小时后，加入10 μL终止液（150 mM EDTA，pH 8.0，0.6% SDS，18%甘油，0.15%橙G）终止反应。
  4. 按照步骤3.2的方法制备、上样并运行琼脂糖凝胶电泳。
  5. 按照步骤3.3的方法对琼脂糖凝胶进行成像和分析。
  6. 选择PCA氧化活性最高且未检测到核酸酶污染的组分，用于在-80 °C长期保存。测定A280。
  7. 利用A280和摩尔消光系数（ε280）734,700 M-1cm-1计算总PCD浓度。
  8. 将各组分在液氮中快速冷冻，储存于-80 °C冰箱中。或者，也可将具有活性且无核酸酶污染的组分合并后分装，并以相同方式冷冻。我们通常每升培养物可获得1–2 mg PCD。在SM实验中的典型使用量为3 μg PCD。我们将PCD在-80 °C保存长达1年，未观察到活性下降。

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结果

市售的氧气清除剂PCD常被DNA核酸酶污染。这种污染的核酸酶活性可能导致荧光实验中出现假象结果，尤其是在分析DNA或与DNA相互作用的蛋白质的研究中。我们发现，重组PCD（由六组氨酸标记的pcaH和pcaG组成的异源二聚体）可在大肠杆菌（图1）中表达。首先通过镍亲和层析纯化该异源二聚体（图2）。PCD以两种不同浓度的咪唑进行两步洗脱。通过SDS-PAGE分析层析组分。将含有近乎纯PCD的组分浓缩后，进一步通过SEC进行纯化（图3）。分别检测SEC各组分的PCA氧化活性和核酸酶活性（图4）。选择氧化活性高且无明显核酸酶活性的组分测定蛋白浓度，并保存于-80 °C冰箱中以供实验使用。

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讨论

在单分子荧光显微镜中，通常会加入氧气清除系统以减少光漂白3,7,8。这些显微技术常用于观察核酸或蛋白质与核酸之间的相互作用1,13,14。若氧气清除系统被核酸酶污染，可能导致虚假结果。

已有研究表明，市售的OSS（包括GODCAT和PCD）含有显著的核酸酶污染11。虽然可以购买PCD并通过尺寸排阻色谱法（SEC）去除核酸酶污染物11，但在该方法发表后，某供应商的市售PCD价格增长了5倍。本方法可制备出高活性且无核酸酶的PCD异源二聚体，理论上可在1周内完成。根据我们的经验，在拥有两套荧光成像系统的高效实验室中，1 L培...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为GM121284和AI126742，授予KEY。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇Sigma-AldrichM3148β机械工程
30% 丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液，29:1伯乐（Bio-Rad）161-0156
乙酸，冰醋酸，符合ACS标准费希尔化学A38C-212
琼脂，颗粒状BD 生物科学DF0145-17-0
AKTA FPLC 系统GE Healthcare Life SciencesAKTA 纯化系统：Box-900、pH/C-900、UV-900、P-900 和 Frac-920
Amicon Ultra-2 离心滤过装置EMD MilliporeUFC20102410 kDa 分子量截留值
六水合硫酸亚铁铵SigmaF-2262
过硫酸铵（APS）片剂AmrescoK833-100TABS
氨苄青霉素Amresco0339-25G
Bacto 胰蛋白胨BD 生物科学DF0123173
BD Bacto 脱水培养基添加剂：酵母提取物瓶装VWR90004-092
BIS-TRIS丙烷>≥99.0%（滴定法）Sigma-AldrichB6755-500G
溴酚蓝Sigma-AldrichB0126-25G
考马斯亮蓝Amresco0472-50G
Costar 96–平底孔板–底部EIA板Bio-Rad2240096EDU
DTTP212121SV-DTT
杜氏磷酸盐缓冲液 500 mLSigma-AldrichD8537-500MLPBS
溴化乙锭赛默飞世尔科技BP1302
甘油Fisher ScientificG37-20
Granulated LB Broth MillerEMD Biosciences1.10285.0500
高分辨率标准琼脂糖AGTC 生物产品AG500D1
咪唑Sigma-AldrichI0250-250G
IPTGGoldbioI2481C25
亮抑蛋白酶肽罗氏11017128001
来自鸡蛋清的溶菌酶Sigma-AldrichL6876-1G
六水合氯化镁Amresco0288-1KG
微量分光光度计，具备比色皿功能赛默飞世尔科技ND-2000C
NaClP212121RP-S23020
Ni-NTA Superflow（100 ml）Qiagen30430
Novagen BL21 感受态细胞EMD Millipore69-449-3SOC 培养基包含
橙GFisher Scientific0-267
PepstatinGold BiotechnologyP-020-25
PMSFAmresco0754-25G
原儿茶酸Fisher ScientificICN15642110主成分分析
十二烷基硫酸钠P212121CI-00270-1KG
SpectraMax M2 微孔板读板仪分子装置
带PES膜的无菌一次性滤器单元 > 250 mL赛默飞世尔科技09-741-04
带PES膜的一次性无菌滤器单元 > 500 mL赛默飞世尔科技09-741-02
Superose 12 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences17517301
TEMEDAmresco0761-25ML
Tris 超纯Gojira精细化学品UTS1003
Typhoon 9410 多功能荧光成像仪GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTAInvitrogen/Gibco15575
ZnCl2Sigma-Aldrich208086

参考文献

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