无核酸酶氧清除剂原儿茶酸3,4-双加氧酶的表达与纯化

摘要

原儿茶酸3,4-双加氧酶（PCD）可利用其底物原儿茶酸（PCA）在水相体系中通过酶促反应去除游离的双原子氧。本方案描述了该除氧酶的表达、纯化及活性分析方法。

摘要

单分子（SM）显微技术用于实时研究荧光标记生物分子的动态分子相互作用。然而，荧光基团易受溶解氧（O₂）引起的光漂白影响而导致信号丢失。为防止光漂白并延长荧光基团的寿命，通常采用氧气清除系统（OSS）来降低O₂浓度。市售的OSS可能被核酸酶污染，从而损伤或降解核酸，干扰实验结果的解读。本文详细描述了一种高效表达与纯化无核酸酶污染的Pseudomonas putida原儿茶酸-3,4-双加氧酶（PCD）的实验方案。PCD可通过将底物原儿茶酸（PCA）转化为3-羧基-顺,顺-粘康酸，有效清除活性O₂物种。该方法适用于任何O₂对数据采集产生不利影响的水相体系。与市售PCD相比，本方法在制备高活性且无核酸酶污染的PCD方面更具优势。

引言

单分子生物物理学是一个快速发展的领域，正在改变我们观察生命现象的方式 生物现象。该领域具有独特的能力，可将物理学和化学的基本定律与 生物学。荧光显微镜是一种可实现单分子灵敏度的生物物理方法。通过将生物分子与小分子有机荧光染料或量子点连接，利用荧光对其进行检测¹这些分子在激光激发下可在发生不可逆光漂白前发射光子²荧光标记发生化学损伤时会出现光漂白现象 从而破坏其在目标波长下激发的能力^2,3活性氧（ROS）在水相缓冲液中的存在是光漂白的主要原因^2,4此外，活性氧（ROS）可损伤生物分子，导致单分子实验（SM实验）中出现错误的观测结果^5,6为防止氧化损伤，可使用氧气清除系统（OSS）。^3,7,8葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶（GODCAT）系统在去除氧气方面具有高效性

方案

1. 在大肠杆菌（E. coli）中诱导PCD表达

1. 在离心管中混合1 μL pVP91A-pcaHG PCD表达质粒（20 ng/μL，图1A）和20 μL E.coli BL21（20 μL市售菌株，> 2 x 10⁶ cfu/μg质粒）。轻弹管壁混匀，将离心管置于冰上5分钟。
2. 将转化体系在42 °C下热激30秒，随后立即置于冰上2分钟。
3. 加入80 μL SOC培养基（含分解代谢抑制的超优肉汤：2.5 mM KCl、10 mM NaCl、2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、10 mM MgSO₄、10 mM MgCl₂、20 mM葡萄糖），在37 °C下以225转/分钟（rpm）振荡培养1小时。
4. 将转化反应液涂布于LB氨苄琼脂平板（1 L LB琼脂：10 g NaCl、10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、15 g琼脂、50 μg/mL氨苄青霉素；每10 cm直径培养皿使用25 mL）。
5. 将平板倒置，在37 °C下培养16–18小时。
6. 从平板上挑取单菌落接种至250 mL锥形瓶中的50 mL LB氨苄液体培养基（1 L LB：10 g胰蛋白胨、10 g NaCl、5 g酵母提取物、50 μg/mL氨苄青霉素），....

结果

市售的氧气清除剂PCD常被DNA核酸酶污染。这种污染的核酸酶活性可能导致荧光实验中出现假象结果，尤其是在分析DNA或与DNA相互作用的蛋白质的研究中。我们发现，重组PCD（由六组氨酸标记的pcaH和pcaG组成的异源二聚体）可在大肠杆菌（图1）中表达。首先通过镍亲和层析纯化该异源二聚体（图2）。PCD以两种不同浓度的咪唑进行两步洗脱。通过SDS-PAGE分析层析组分。将含有近乎纯PCD的组分浓缩后，进一步通过SEC进行纯化（图3）。分别检测SEC各组分的PCA氧化活性和核酸酶活性（图4）。选择氧化活性高且无明显核酸酶活性的组分测定蛋白浓度，并保存于-80 °C冰箱中以供实验使用。

讨论

在单分子荧光显微镜中，通常会加入氧气清除系统以减少光漂白^3,7,8。这些显微技术常用于观察核酸或蛋白质与核酸之间的相互作用^1,13,14。若氧气清除系统被核酸酶污染，可能导致虚假结果。

已有研究表明，市售的OSS（包括GODCAT和PCD）含有显著的核酸酶污染¹¹。虽然可以购买PCD并通过尺寸排阻色谱法（SEC）去除核酸酶污染物¹¹，但在该方法发表后，某供应商的市售PCD价格增长了5倍。本方法可制备出高活性且无核酸酶的PCD异源二聚体，理论上可在1周内完成。根据我们的经验，在拥有两套荧光成像系统的高效实验室中，1 L培.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148	β机械工程
30% 丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液，29:1	伯乐（Bio-Rad）	161-0156
乙酸，冰醋酸，符合ACS标准	费希尔化学	A38C-212
琼脂，颗粒状	BD 生物科学	DF0145-17-0
AKTA FPLC 系统	GE Healthcare Life Sciences	AKTA 纯化系统：Box-900、pH/C-900、UV-900、P-900 和 Frac-920
Amicon Ultra-2 离心滤过装置	EMD Millipore	UFC201024	10 kDa 分子量截留值
六水合硫酸亚铁铵	Sigma	F-2262
过硫酸铵（APS）片剂	Amresco	K833-100TABS
氨苄青霉素	Amresco	0339-25G
Bacto 胰蛋白胨	BD 生物科学	DF0123173
BD Bacto 脱水培养基添加剂：酵母提取物瓶装	VWR	90004-092
BIS-TRIS丙烷>≥99.0%（滴定法）	Sigma-Aldrich	B6755-500G
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	B0126-25G
考马斯亮蓝	Amresco	0472-50G
Costar 96–平底孔板–底部EIA板	Bio-Rad	2240096EDU
DTT	P212121	SV-DTT
杜氏磷酸盐缓冲液 500 mL	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	PBS
溴化乙锭	赛默飞世尔科技	BP1302
甘油	Fisher Scientific	G37-20
Granulated LB Broth Miller	EMD Biosciences	1.10285.0500
高分辨率标准琼脂糖	AGTC 生物产品	AG500D1
咪唑	Sigma-Aldrich	I0250-250G
IPTG	Goldbio	I2481C25
亮抑蛋白酶肽	罗氏	11017128001
来自鸡蛋清的溶菌酶	Sigma-Aldrich	L6876-1G
六水合氯化镁	Amresco	0288-1KG
微量分光光度计，具备比色皿功能	赛默飞世尔科技	ND-2000C
NaCl	P212121	RP-S23020
Ni-NTA Superflow（100 ml）	Qiagen	30430
Novagen BL21 感受态细胞	EMD Millipore	69-449-3	SOC 培养基包含
橙G	Fisher Scientific	0-267
Pepstatin	Gold Biotechnology	P-020-25
PMSF	Amresco	0754-25G
原儿茶酸	Fisher Scientific	ICN15642110	主成分分析
十二烷基硫酸钠	P212121	CI-00270-1KG
SpectraMax M2 微孔板读板仪	分子装置
带PES膜的无菌一次性滤器单元 > 250 mL	赛默飞世尔科技	09-741-04
带PES膜的一次性无菌滤器单元 > 500 mL	赛默飞世尔科技	09-741-02
Superose 12 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17517301
TEMED	Amresco	0761-25ML
Tris 超纯	Gojira精细化学品	UTS1003
Typhoon 9410 多功能荧光成像仪	GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
ZnCl2	Sigma-Aldrich	208086