在心脏疾病期间，心肌细胞内的 Na+ 浓度（[Na+]i）会发生改变。<[Na+]i 是细胞内 Ca2+ 的重要调节因子。我们介绍一种新方法，利用电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机和快速可控的照明装置，测量 freshly isolated murine atrial myocytes 中的 [Na+]i。
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摘要
摘要
细胞内钠离子浓度（[Na+]i) 是细胞内 Ca 的重要调节因子2+其研究有助于深入了解肌膜Na+/Ca2+ 交换体，电压门控Na+ 通道和 Na+，K+-ATP酶。细胞内Ca2+ 信号传导在心房疾病（如心房颤动）中发生改变。尽管导致细胞内Ca2+ 稳态特征被明确后，[Na+]i 及其在心房病理中的失调机制尚不明确。[Na+]i 在心房肌细胞中，随着刺激频率的增加，其反应性也随之增强。因此，对外加电场刺激的响应能力对于[Na+]i 这些细胞的测量。此外，较长的准备时间（染料负载）和实验持续时间（校准）要求分离方案能够获得质量极佳的心房肌细胞。由于小鼠心房体积较小且细胞间基质组成特殊，高质量成年小鼠心房肌细胞的分离具有较大难度。本文介绍了一种经过优化的基于兰格多夫灌注的分离方案，可稳定地获得高产量、高质量的小鼠心房肌细胞。
钠结合苯并呋喃异苯二甲酸（SBFI）是最常用的荧光钠离子（Na+）探针。SBFI 可以通过玻璃移液管以盐的形式导入心肌细胞，或以乙酰氧基甲酯（AM 酯）形式加载，后者能够穿透心肌细胞的肌膜。进入细胞后，SBFI-AM 被胞质酯酶去酯化。由于膜穿透效率和胞内去酯化程度存在细胞间差异，每个细胞都必须进行原位校准。通常，使用 SBFI 进行全细胞落射荧光法测定细胞内钠离子浓度（[Na+]i）时，依赖光电倍增管（PMT）进行检测。该实验装置一次只能测量一个细胞。由于心肌细胞染料加载时间较长，且每次实验后均需校准，导致数据产出率较低。因此，我们开发了一种基于 EMCCD 相机的技术来测定 [Na+]i。该方法可同时对多个心肌细胞进行 [Na+]i 测量，从而显著提高实验通量。
引言
在心房疾病（例如心房颤动 [AF]）中，细胞内 Ca2+ 信号发生显著改变1。尽管目前对 AF 中“重构”的细胞内 Ca2+ 信号传导的许多潜在机制已有较深入的认识2,3，但细胞内钠离子浓度（[Na+]i）改变所起的作用仍不清楚。[Na+]i 是调控细胞内 Ca2+ 的重要因子。研究 [Na+]i 有助于理解肌膜 Na+/Ca2+ 交换体（NCX）的激活、Na+ 通道以及 Na+,K+-ATP 酶（NKA）的行为4。我们先前已证实，在 AF 期间出现的高心房激活频率会导致 [Na+]i 显著降低1。以往研究显示，AF 患者中 NCX 电流密度（INCX）和蛋白表达水平均升高3。另有报道指出，来自 AF 患者的分离心房肌细胞中，电压依赖性 Na+ 电流的晚成分（INa, late）也增加5。因此，有证据表明 AF 中细胞内 Na+ 稳态发生了显著变化。因此，迫切需要对分离的心房肌细胞进行可靠且可重复的 [Na+]i 测量，以进一步加深对 AF 病理机制的理解。本文中，我们展示了如何可重复地分离出高质量的小鼠心房肌细胞，适用于 [Na+]i 的测量。我们优化的心房细胞分离方案聚焦于小鼠心房肌细胞，因为心房颤动的转基因（TG）小鼠模型已成为 AF 研究的重要组成部分6。这类小鼠通常数量有限，且心房常存在纤维化，给细胞分离带来挑战。
通常，活细胞内的[Na+]i可通过荧光指示剂7,8或多种类型的微电极9进行测定。基于微电极的技术需要穿透肌膜，因此该方法仅适用于较大的细胞，而不适用于体积小且细长、细胞完整性易受破坏的心房肌细胞。
钠结合型苯并呋喃异苯二甲酸（SBFI）是一种荧光指示剂，其在结合钠离子后会发生显著的波长偏移+ 7SBFI 在 340 nm 和 380 nm 处交替激发，发射的荧光经发射滤光片（510 nm）后收集。计算两个激发波长下的信号比值（F340/380）可以消除局部光程长度、染料浓度以及照明强度和检测效率中与波长无关的变化。当使用已知钠离子浓度（[Na+]) 在每个细胞中进行，F340/380 实验过程中获得的比值可对[Na+]i. 由于所有 Na+ 指示剂，SBFI 也对 K 具有一定的亲和力+. 使用此处所示的校准方法可可靠地“钳制”[Na+]i 以及细胞内钾离子浓度（[K+]i) 在校准过程中，使得 [Na+]i 即使在它的情况下也可以可靠地校准 <10% [K+]i 10.
我们介绍一种基于新型EMCCD相机的技术，用于利用SBFI进行细胞内[Na+]i的比率测定。该EMCCD相机首次实现了在多个细胞中同时进行[Na+]i的测量（及校准）。这一优势在实验动物数量受限的情况下尤为突出（例如转基因小鼠模型）。通常，使用SBFI进行[Na+]i测量时，采用光电倍增管（PMT）采集全细胞表面荧光信号1,11。尽管PMT可提供优异的荧光信号时间分辨率，但其空间分辨率极低，且每次实验仅限于单个细胞。
我们的新型方案可实现细胞内钠离子浓度 [Na+]i 的高重复性和高灵敏度测量。该方案优化用于同时获取多个小鼠心房肌细胞中 [Na+]i 的变化，但也可适用于多种其他细胞类型。
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方案
本文所述所有方法均已获得马里兰大学巴尔的摩分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 从成年小鼠心脏中分离心房肌细胞
- 将每只小鼠放入精密蒸汽麻醉机的诱导室中，以100%氧气为载体通入异氟烷进行麻醉。
- 将异氟烷气流调节至1%，直至动物失去反应性，然后在安乐死前15分钟给予腹腔（IP）肝素注射（1–1.25 U/g）。
- 通过将异氟烷麻醉剂量增加至5%使小鼠深度麻醉，并通过足部夹捏确认麻醉深度。
- 通过快速开胸术实施安乐死12；使用标准图案镊子和手术剪打开胸腔。被动移动心脏和肺，分离主动脉弓，用镊子夹住并剪断主动脉以取出心脏。
- 将心脏置于冰冷的无钙任氏液中2+无细胞分离缓冲液（CIB， 表1).
- 用22 G套管在CIB溶液中通过3倍放大解剖显微镜下对主动脉进行插管，并用丝线结扎图1A，B).
- 通过连接注射器的套管输送CIB溶液，并在显微镜下确认冠状动脉灌注，以确保套管位于主动脉窦上方适当位置。
注意：此步骤对于确保心房组织的充分灌注至关重要，因为已有研究表明，小鼠的冠状动脉解剖结构具有高度变异性。13. - 将心脏安装在基于重力的Langendorff装置上，并用含Ca2+在37 °C下用无CIB溶液冲洗5分钟，以洗去残留血液，直至流出液澄清（图1C).
- 更换为酶解溶液（表 2）并在37 °C下灌注3–5分钟，直至心房组织变软并松弛。
- 使用超级抓握力镊子和小型弹簧剪切除右心房和左心房，并转移至含有CIB酶解液的小型培养皿中，该酶解液与步骤1.8中所用相同，但含0.15 mM CaCl₂。2 并在37 °C培养箱中孵育5–8分钟（图1D).
- 将心房组织转移至含有4 mL预热（37 °C）保存液（改良Tyrode溶液）的细胞培养皿中表3) 含15 mM 牛血清白蛋白和30 mM 2,3-丁二酮单肟。
- 使用小型弹簧剪刀和超强抓握力镊子将心房切成小条状组织（10–20条，根据心房大小而定）。
- 使用开口直径在2–5 mm之间的不同火焰抛光玻璃巴斯德吸管，轻柔地对组织悬液进行机械解离。先用最大口径的吸管，逐步换用至最小口径的吸管，每根吸管吹打5–10次。
- 通过200 µm滤网过滤细胞悬液，并加入CaCl2 每10分钟一次，共三次，以达到0.3 mM的终浓度。
2. 细胞质量评估
- 将含有 freshly isolated 心房肌细胞的 200 µL 细胞悬液置于玻璃盖玻片上。
- 使用 10 倍物镜计数视野中的所有细胞，并将其分类为圆形或杆状。确定有多少杆状细胞显示出清晰的横纹（如果难以判断，可切换至 25 倍物镜，见图 2C）。
- 重复步骤 2.1–2.2。
- 计算圆形、杆状以及具有清晰横纹的杆状细胞所占的百分比。
- 调整细胞分离步骤，直至 80% 的细胞为具有清晰横纹的杆状细胞。
- 将 500 µL 心房细胞悬液置于经层粘连蛋白包被的玻璃盖玻片上，并将细胞腔室放置于倒置显微镜下。静置 5 分钟使细胞沉降。用含有 1.8 mM Ca2+ 的 Tyrode 溶液进行灌流。
- 使用细胞刺激系统开始电场刺激（2 ms 双相脉冲，30 V），频率为 0.5 Hz，用 10 倍物镜在视野中计数发生收缩的细胞数量。
- 以 3 Hz 的外加电场刺激重复上述步骤。
- 计算对 0.5 Hz 和 3 Hz 刺激频率有反应的细胞百分比（见图 2B）。优化细胞分离方案，直至 50% 的细胞对 3 Hz 电场刺激产生反应。
3. 新鲜分离的小鼠心房肌细胞Na+指示剂负载
- 使用荧光探针钠结合苯并呋喃异邻苯二甲酸（SBFI）的细胞通透性乙酰氧基甲酯（AM酯）（SBFI-AM）。
- 为促进染料分散并实现细胞均匀负载，将SBFI溶解于二甲基亚砜（DMSO）和合适的表面活性聚醇（例如Pluronic）中，使细胞悬液中SBFI的终浓度为10 μM。
- 将细胞在室温下避光、置于摇床上孵育60分钟，以负载SBFI。
- 让细胞静置30分钟，去除上清液，将沉淀物重新悬浮于保存液中（1–2 mL）。
注意：实验应在细胞分离后4小时内完成。在实验开始前，通过台氏液灌流洗去BDM14。
4. 仪器设备、细胞内钠离子浓度（[Na+]i）测定及细胞内钠离子浓度（[Na+]i）校准
注意：图3 展示了实验仪器的光路示意图。
- 按照表4–6所述方法配制Na+浓度递增的校准溶液。
- 向每种校准溶液中加入透化试剂短杆菌肽D（gramicidin D，10 μM；来自-20 °C保存的储备液）和Na+、K+ ATP酶抑制剂毒毛旋花苷（strophanthidin，100 μM，来自-20 °C保存的储备液）。充分涡旋混匀，或使用超声仪确保短杆菌肽和毒毛旋花苷完全溶解。
- 将步骤4.1和4.2中制备的含递增[Na+]o的校准溶液加入多通道灌流系统中，并通过较低的灌流速率（约1 mL/min；灌流速率可根据细胞腔体积调整）连接至细胞腔室。
- 将负压吸引连接至细胞腔室，并将灌流液收集至地面适当（玻璃）容器中。
- 停止灌流和吸引。
- 在SBFI去酯化反应进行30分钟后，取100 μL浓缩的（步骤3.5）染料负载细胞悬液，滴加至倒置显微镜40倍物镜视野上方的层粘连蛋白（laminin）包被的玻璃盖玻片上。
- 使用配备300 W氙灯光源的快速切换照明系统。通过快速切换扫描镜和窄带激发滤光片（340 nm ± 10 nm；380 nm ± 10 nm），实现双激发波长（340 nm和380 nm）的宽场成像。
- 优化EMCCD相机的视野范围。较大的观察区域需要更长的帧时间，而更长的帧时间会导致指示剂发生更多漂白。因此，需平衡视野大小与帧时间，以避免探针出现明显漂白。
- 通过检测未负载SBFI的一组心房细胞的本底荧光，确认其本底荧光水平与背景荧光相近（如图4所示），以确定内源性自发荧光极低。
- 根据实验设计确定合适的采样频率（由于[Na+]i的变化相对较慢，采样频率可较低，例如每10–20秒采集一个数据点）。
- 通过使用适当的中性密度（ND）滤光片并适当降低光源强度（例如通过操作软件调节光强），衰减激发光强度。
- 使用连接至倒置显微镜的EMCCD相机，配合适当的滤光片，收集510 ± 40 nm波段的发射光信号。
- 为每个细胞定义感兴趣区域（ROI），并定义背景ROI（见图4）。从记录的F340和F380信号中扣除背景信号（可在采集时或数据分析阶段完成）。
- 开始数据采集。
- 重新启动灌流和吸引。用含1.8 mM Ca2+的Tyrode溶液灌流10–15分钟，并在实验开始前记录稳定的F340/380基线。
注意：确保记录10–15分钟的稳定基线。若出现漂白现象（例如F340/380基线下降），应进一步降低照明强度，可通过增加ND滤光片密度、降低激发光强度和/或缩短采集帧时间实现（参见步骤4.10–4.11）。 - 根据研究问题开始[Na+]i的测量。
5. [Na+]i 校准
- 实验结束后（步骤 4.16），对每个细胞原位进行 F340/380 信号的校准。
- 通过使用校准溶液（按步骤 4.1–4.3 配制）灌注负载 SBFI 的心肌细胞，校准 F340/380 信号。
- 逐步灌注，使细胞外 [Na+]o 从 0 升至 20 mM。每次更换浓度后，需等待 F340/380 信号稳定再进行下一步（约 5 分钟，具体时间取决于流速；参见 图 3B 和 图 5A）。
注意：F340/380 信号与校准溶液中 [Na+] 之间的关系必须呈线性，才能有效完成 F340/380 信号的校准（图 5 和 图 6）。
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结果
心房细胞质量评估
根据本方案中所述方法，在连续六次心房细胞分离实验中，通过细胞形态和对外加电场刺激的反应性来评估新分离的心房肌细胞。如图2所示，绝大多数心房肌细胞呈杆状，并保持清晰的横纹结构。同样，约50%的心房细胞能够响应高达3 Hz的高频外部电场刺激。
SBFI 校准
我们通过将校准实验进行至 40 mM 的 [Na+]o，评估了在心房肌细胞中使用 SBFI 可测量的 [Na+]i 上限。我们将一组心房肌细胞在 [Na+]o 达 25 mM 条件下的 SBFI 校准线性回归结果，与另一组在 [Na+]o 达 40 mM 条件下的校准结...
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讨论
本文介绍了一种基于EMCCD相机的新技术，可利用钠离子结合苯并呋喃异邻苯二甲酸盐（SBFI）对多个存活的心房肌细胞内的钠离子浓度（[Na+]i）进行同步定量测定。本方法首次实现了对多个细胞内[Na+]i的同步测量。该新方案的主要优势在于：（i）显著提高实验数据产出量；（ii）由于EMCCD相机具有高灵敏度，可降低激发光的强度和照射时间，从而显著减少细胞损伤。
使用苯并呋喃异苯二甲酸钠结合染料（SBFI）的乙酰甲氧基酯（AM）对心肌细胞进行负载所需时间显著长于使用基于荧光素的发色团AM（例如Fluo-3、Fluo-4；分别为45–90分钟与20分钟）。此外，基于SBFI的细胞内钠离子浓度（[Na+]i）定量测量需对每个细胞进行原位校准，通常耗时较长（60–90分钟）。综合来看，在单个分离的心肌细胞中进行基于SBFI的定量[Na+]i测量所需时间较长，导致在细胞质量显著下降前，每个实验日仅能完成1至2次测量（使用...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国心脏协会（American Heart Association）的科学家发展奖（14SDG20110054）资助MG；由美国国立卫生研究院（NIH）肌肉生物学跨学科培训基金（T32 AR007592）和NIH心血管疾病 培训基金 （2T32HL007698-22A1）资助LG；由美国心脏协会科学家发展奖（15SDG22100002）资助LB；以及由NIH基金R01 HL106056、R01 HL105239和U01 HL116321资助WJL。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,3-丁二酮单肟（BDM） | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 340 激发滤光片 | Chroma | ET40X | 25 mm |
| 380 激发滤光片 | Chroma | ET80X | 25 mm |
| 510 发射滤光片 | Chroma | ET510/80m | 25 mm |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 气泡捕集器 | BD Medical Technologies | 904477 | 由一个5 ml鲁尔锁型注射器定制而成，位于灌流液通路至套管之间 |
| 氯化钙溶液（CaCl2 solution） | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| 套管（Cannula） | BD Medical Technologies | 305167 | 由22 G × 1.5英寸针头定制，剪至1英寸长，并打磨远端尖端1 mm |
| 细胞灌流腔室（Cell Chamber） | 定制加工，带有一个可牢固固定25 mm圆形玻璃盖玻片的开口，配有带进液口和出液口的盖子用于灌流 | ||
| 循环水浴槽（Circulating Water Bath） | VWR | ||
| 胶原酶II（Collagenase II） | Worthington | LS004176 | 比活性290 U/g |
| 肌酐（Creatinine） | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| DG5-plus 光源激发系统 | Sutter Instrument | Lambda DG-4/DG-5 Plus | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Thermo Fischer | BP231 | |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA） | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| EMCCD相机（EMCCD camera） | Princeton Instruments | ProEM-HS | |
| 精细止血钳（Fine Hemostats） | Fine Science Tools | 130-20 | |
| 精细剪刀（Fine Scissors） | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| 超握力镊子（Forceps Supergrip） | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| 玻璃盖玻片（Glass Cover slips） | VWR | 4838089 | 25 mm 圆形 |
| 葡萄糖（Glucose） | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| 短杆菌肽D（Gramicidin D） | Sigma-Aldrich | G5002 | |
| 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 内层硅胶管（Inner silicon Tubing） | VWR | VWRselect品牌硅胶管 | |
| 倒置显微镜（Inverted microscope） | Nikon Instruments | NikonTE 2000 U | |
| 分离工具（Isolation Tools） | |||
| 葡萄糖酸钾（K Gluconate） | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| 氯化钾（KCI） | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | Calbiochem | 529568 | |
| 朗根多夫灌流装置（Langendorff perfusion apparatus） | |||
| 六水合氯化镁（MgCl2.6H2O *） | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MyoPacer细胞刺激器（MyoPacer Cell Stimulator） | IonOptix | ||
| 葡萄糖酸钠（Na Gluconate） | Sigma-Aldrich | S2054 | |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| 磷酸二氢钠（NaH2PO4） | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| 天然小鼠层粘连蛋白 | Thermo Fischer | 23017015 | 0.5–2.0 mg/ml |
| 外层管路（Outer tubing） | VWR | ||
| 35×10 mm 培养皿（Petri dish 35X10 mm） | Falcon | 351008 | |
| PowerLoad | Thermo Fischer | P10020 | |
| 蛋白酶XXIV（Protease XXIV） | Sigma-Aldrich | P8038 | |
| SBFI-AM | Thermo Fischer | S1264 | |
| 丝线缝合线（Silk suture） | Fine Science Tools | 18020-50 | 直径0.12 mm |
| 小型弹簧剪刀（Small Spring scissors） | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| 标准齿形镊（Standard Pattern Forceps） | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| 毒毛旋花子苷元（Strophanthidin） | Sigma-Aldrich | G5884 | |
| 外科剪刀（坚韧切割型）（Surgical Scissors Tough Cut） | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| 打结镊（Suture Tying Forceps） | Fine Science Tools | 00272-13 | |
| 牛磺酸（Taurine） | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| 三羟甲基氨基甲烷碱基（Trisbase） | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| 胰蛋白酶（Trypsin） | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| UVFS反射型0.1中性密度滤光片（UVFS Reflective 0.1 ND Filter） | Thorlabs | NDUV01B | 25 mm |
| UVFS反射型0.2中性密度滤光片（UVFS Reflective 0.2 ND Filter） | Thorlabs | NDUV02B | 25 mm |
| UVFS反射型0.3中性密度滤光片（UVFS Reflective 0.3 ND Filter） | Thorlabs | NDUV03B | 25 mm |
| UVFS反射型0.5中性密度滤光片（UVFS Reflective 0.5 ND Filter） | Thorlabs | NDUV05B | 25 mm |
| UVFS反射型1.0中性密度滤光片（UVFS Reflective 1 ND Filter） | Thorlabs | NDUV010B | 25 mm |
参考文献
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