在心脏疾病期间，心肌细胞内的 Na+ 浓度（[Na+]i）会发生改变。<[Na+]i 是细胞内 Ca2+ 的重要调节因子。我们介绍一种新方法，利用电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机和快速可控的照明装置，测量 freshly isolated murine atrial myocytes 中的 [Na+]i。
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摘要
摘要
细胞内钠离子浓度（[Na+]i) 是细胞内 Ca 的重要调节因子2+其研究有助于深入了解肌膜Na+/Ca2+ 交换体，电压门控Na+ 通道和 Na+，K+-ATP酶。细胞内Ca2+ 信号传导在心房疾病（如心房颤动）中发生改变。尽管导致细胞内Ca2+ 稳态特征被明确后，[Na+]i 及其在心房病理中的失调机制尚不明确。[Na+]i 在心房肌细胞中，随着刺激频率的增加，其反应性也随之增强。因此，对外加电场刺激的响应能力对于[Na+]i 这些细胞的测量。此外，较长的准备时间（染料负载）和实验持续时间（校准）要求分离方案能够获得质量极佳的心房肌细胞。由于小鼠心房体积较小且细胞间基质组成特殊，高质量成年小鼠心房肌细胞的分离具有较大难度。本文介绍了一种经过优化的基于兰格多夫灌注的分离方案，可稳定地获得高产量、高质量的小鼠心房肌细胞。
钠结合苯并呋喃异苯二甲酸（SBFI）是最常用的荧光钠离子（Na+）探针。SBFI 可以通过玻璃移液管以盐的形式导入心肌细胞，或以乙酰氧基甲酯（AM 酯）形式加载，后者能够穿透心肌细胞的肌膜。进入细胞后，SBFI-AM 被胞质酯酶去酯化。由于膜穿透效率和胞内去酯化程度存在细胞间差异，每个细胞都必须进行原位校准。通常，使用 SBFI 进行全细胞落射荧光法测定细胞内钠离子浓度（[Na+]i）时，依赖光电倍增管（PMT）进行检测。该实验装置一次只能测量一个细胞。由于心肌细胞染料加载时间较长，且每次实验后均需校准，导致数据产出率较低。因此，我们开发了一种基于 EMCCD 相机的技术来测定 [Na+]i。该方法可同时对多个心肌细胞进行 [Na+]i 测量，从而显著提高实验通量。
引言
在心房疾病（例如心房颤动 [AF]）中，细胞内 Ca2+ 信号发生显著改变1。尽管目前对 AF 中“重构”的细胞内 Ca2+ 信号传导的许多潜在机制已有较深入的认识2,3，但细胞内钠离子浓度（[Na+]i）改变所起的作用仍不清楚。[Na+]i 是调控细胞内 Ca2+ 的重要因子。研究 [Na+]i 有助于理解肌膜 Na+/Ca2+ 交换体（NCX）的激活、Na+ 通道以及 Na+,K+-ATP 酶（NKA）的行为4。我们先前已证实，在 AF 期间出现的高心房激活频率会导致 [Na+]i 显著降低1。以往研究显示，AF 患者中 NCX 电流密度（INCX）和蛋白表达水平均升高3。另有报道指出，来自 AF 患者的分离心房肌细胞中，电压依赖性 Na+
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方案
本文所述所有方法均已获得马里兰大学巴尔的摩分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 从成年小鼠心脏中分离心房肌细胞
- 将每只小鼠放入精密蒸汽麻醉机的诱导室中，以100%氧气为载体通入异氟烷进行麻醉。
- 将异氟烷气流调节至1%，直至动物失去反应性，然后在安乐死前15分钟给予腹腔（IP）肝素注射（1–1.25 U/g）。
- 通过将异氟烷麻醉剂量增加至5%使小鼠深度麻醉，并通过足部夹捏确认麻醉深度。
- 通过快速开胸术实施安乐死12；使用标准图案镊子和手术剪打开胸腔。被动移动心脏和肺，分离主动脉弓，用镊子夹住并剪断主动脉以取出心脏。
- 将心脏置于冰冷的无钙任氏液中2+无细胞分离缓冲液（CIB， 表1).
- 用22 G套管在CIB溶液中通过3倍放大解剖显微镜下对主动脉进行插管，并用丝线结扎图1A，B).
- 通过连接注射器的套管输送CIB溶液，并在显微镜下确认冠状动脉灌注，以确保套管位于主动脉窦上方适当位置。
注意：此步骤对于确保心房组织的充分灌注至关重要，因为已有研究表明，小鼠的冠状动脉解剖结构具有高度变异性。
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结果
心房细胞质量评估
根据本方案中所述方法，在连续六次心房细胞分离实验中，通过细胞形态和对外加电场刺激的反应性来评估新分离的心房肌细胞。如图2所示，绝大多数心房肌细胞呈杆状，并保持清晰的横纹结构。同样，约50%的心房细胞能够响应高达3 Hz的高频外部电场刺激。
SBFI 校准
我们通过将校准实验进行至 40 mM 的 [Na+]o，评估了在心房肌细胞中使用 SBFI 可测量的 [Na+]i 上限。我们将一组心房肌细胞在 [Na+]o 达 25 mM 条件下的 SBFI 校准线性回归结果，与另一组在 [Na+]o 达 40 mM 条件下的校准结.......
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讨论
本文介绍了一种基于EMCCD相机的新技术，可利用钠离子结合苯并呋喃异邻苯二甲酸盐（SBFI）对多个存活的心房肌细胞内的钠离子浓度（[Na+]i）进行同步定量测定。本方法首次实现了对多个细胞内[Na+]i的同步测量。该新方案的主要优势在于：（i）显著提高实验数据产出量；（ii）由于EMCCD相机具有高灵敏度，可降低激发光的强度和照射时间，从而显著减少细胞损伤。
使用苯并呋喃异苯二甲酸钠结合染料（SBFI）的乙酰甲氧基酯（AM）对心肌细胞进行负载所需时间显著长于使用基于荧光素的发色团AM（例如Fluo-3、Fluo-4；分别为45–90分钟与20分钟）。此外，基于SBFI的细胞内钠离子浓度（[Na+]i）定量测量需对每个细胞进行原位校准，通常耗时较长（60–90分钟）。综合来看，在单个分离的心肌细胞中进行基于SBFI的定量[Na+]i测量所需时间较长，导致在细胞质量显著下降前，每个实验日仅能完成1至2次测量（使用.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国心脏协会（American Heart Association）的科学家发展奖（14SDG20110054）资助MG；由美国国立卫生研究院（NIH）肌肉生物学跨学科培训基金（T32 AR007592）和NIH心血管疾病 培训基金 （2T32HL007698-22A1）资助LG；由美国心脏协会科学家发展奖（15SDG22100002）资助LB；以及由NIH基金R01 HL106056、R01 HL105239和U01 HL116321资助WJL。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,3-丁二酮单肟（BDM） | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 340 激发滤光片 | Chroma | ET40X | 25 mm |
| 380 激发滤光片 | Chroma | ET80X | 25 mm |
| 510 发射滤光片 | Chroma | ET510/80m | 25 mm |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 气泡捕集器 | BD Medical Technologies | 904477 | 由一个5 ml鲁尔锁型注射器定制而成，位于灌流液通路至套管之间 |
| 氯化钙溶液（CaCl2 solution） | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| 套管（Cannula） | BD Medical Technologies | 305167 | 由22 G × 1.5英寸针头定制，剪至1英寸长，并打磨远端尖端1 mm |
| 细胞灌流腔室（Cell Chamber） | 定制加工，带有一个可牢固固定25 mm圆形玻璃盖玻片的开口，配有带进液口和出液口的盖子用于灌流 | ||
| 循环水浴槽（Circulating Water Bath） | VWR | ||
| 胶原酶II（Collagenase II） | Worthington | LS004176 | 比活性290 U/g |
| 肌酐（Creatinine） | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| DG5-plus 光源激发系统 | Sutter Instrument | Lambda DG-4/DG-5 Plus | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Thermo Fischer | BP231 | |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA） | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| EMCCD相机（EMCCD camera） | Princeton Instruments | ProEM-HS | |
| 精细止血钳（Fine Hemostats） | Fine Science Tools | 130-20 | |
| 精细剪刀（Fine Scissors） | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| 超握力镊子（Forceps Supergrip） | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| 玻璃盖玻片（Glass Cover slips） | VWR | 4838089 | 25 mm 圆形 |
| 葡萄糖（Glucose） | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| 短杆菌肽D（Gramicidin D） | Sigma-Aldrich | G5002 | |
| 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 内层硅胶管（Inner silicon Tubing） | VWR | VWRselect品牌硅胶管 | |
| 倒置显微镜（Inverted microscope） | Nikon Instruments | NikonTE 2000 U | |
| 分离工具（Isolation Tools） | |||
| 葡萄糖酸钾（K Gluconate） | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| 氯化钾（KCI） | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | Calbiochem | 529568 | |
| 朗根多夫灌流装置（Langendorff perfusion apparatus） | |||
| 六水合氯化镁（MgCl2.6H2O *） | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MyoPacer细胞刺激器（MyoPacer Cell Stimulator） | IonOptix | ||
| 葡萄糖酸钠（Na Gluconate） | Sigma-Aldrich | S2054 | |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| 磷酸二氢钠（NaH2PO4） | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| 天然小鼠层粘连蛋白 | Thermo Fischer | 23017015 | 0.5–2.0 mg/ml |
| 外层管路（Outer tubing） | VWR | ||
| 35×10 mm 培养皿（Petri dish 35X10 mm） | Falcon | 351008 | |
| PowerLoad | Thermo Fischer | P10020 | |
| 蛋白酶XXIV（Protease XXIV） | Sigma-Aldrich | P8038 | |
| SBFI-AM | Thermo Fischer | S1264 | |
| 丝线缝合线（Silk suture） | Fine Science Tools | 18020-50 | 直径0.12 mm |
| 小型弹簧剪刀（Small Spring scissors） | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| 标准齿形镊（Standard Pattern Forceps） | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| 毒毛旋花子苷元（Strophanthidin） | Sigma-Aldrich | G5884 | |
| 外科剪刀（坚韧切割型）（Surgical Scissors Tough Cut） | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| 打结镊（Suture Tying Forceps） | Fine Science Tools | 00272-13 | |
| 牛磺酸（Taurine） | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| 三羟甲基氨基甲烷碱基（Trisbase） | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| 胰蛋白酶（Trypsin） | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| UVFS反射型0.1中性密度滤光片（UVFS Reflective 0.1 ND Filter） | Thorlabs | NDUV01B | 25 mm |
| UVFS反射型0.2中性密度滤光片（UVFS Reflective 0.2 ND Filter） | Thorlabs | NDUV02B | 25 mm |
| UVFS反射型0.3中性密度滤光片（UVFS Reflective 0.3 ND Filter） | Thorlabs | NDUV03B | 25 mm |
| UVFS反射型0.5中性密度滤光片（UVFS Reflective 0.5 ND Filter） | Thorlabs | NDUV05B | 25 mm |
| UVFS反射型1.0中性密度滤光片（UVFS Reflective 1 ND Filter） | Thorlabs | NDUV010B | 25 mm |
参考文献
- Greiser, M., et al. Tachycardia-induced silencing of subcellular Ca2+ signaling in atrial myocytes. Journal of Clinical Investigation. , (2014).
- Greiser, M., Lederer, W. J., Schotten, U. Alterations of atrial Ca(2+) handli....
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重印与许可
