我们描述了制备卵囊并纯化子孢子的方案，用于研究人肠道和呼吸道类器官的感染过程 微小隐孢子虫 我们展示了将寄生虫显微注射至肠道类器官腔内以及对类器官进行免疫染色的操作步骤。最后，我们描述了从类器官中分离所产生卵囊的方法。
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本文内容
摘要
摘要
Cryptosporidium parvum 是人类腹泻疾病的主要病因之一。为了理解该寄生虫的致病机制并开发高效的药物，需要建立一种能够在体外重现宿主内环境的培养系统。类器官因其结构与来源组织高度相似，是研究宿主-病原体相互作用的理想模型。类器官是由成体干细胞来源的三维（3D）组织结构，可在体外长期培养，且不发生任何遗传异常或转化。它们具有明确的极性，包含顶膜和基底侧膜两个表面。类器官在药物筛选、生物样本库构建、疾病建模以及宿主-微生物相互作用研究中具有广泛的应用。本文提供了一步一步的操作方案，介绍如何制备用于感染人肠道和呼吸道类器官的Cryptosporidium卵囊和子孢子。随后，我们展示了如何通过显微注射将微生物注入类器官腔内。目前有三种主要方法可用于利用类器官开展宿主-微生物相互作用研究：显微注射、机械剪切后铺板以及形成单层细胞。其中，显微注射能够维持类器官的三维结构，实现对寄生虫接种量的精确控制，并使微生物直接接触顶膜表面。我们还详细说明了为成像分析或卵囊生产而优化类器官生长的条件。最后，我们展示了如何从类器官中分离新生成的卵囊，以便进行后续处理和分析。
引言
用于治疗和预防的药物或疫苗的开发 隐孢子虫 感染研究因缺乏能够精确模拟人体内环境的体外系统而受到阻碍1,2. 目前许多可用的系统仅允许短期感染（<5天）或无法支持寄生虫的完整生命周期3,4其他能够支持寄生虫完整发育的系统基于永生化细胞系或肿瘤细胞系，但这些细胞系无法真实再现人体内的生理状况。5,6,7类器官或“迷你器官”是来源于三维组织的结构，在添加了多种组织特异性生长因子的细胞外基质中培养而成。类器官已从多种器官和组织中成功构建，具有遗传稳定性，能够重现其来源器官的大部分功能，并可在体外长期培养。我们已建立一种方法，用于将人肠道和肺类器官感染 隐孢子虫 为研究与肠道和呼吸道隐孢子虫病相关的宿主-寄生虫相互作用提供准确的体外模型8,9,10,
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方案
所有组织处理和切除操作均在机构审查委员会（IRB）批准的方案下进行，并取得患者的知情同意。
1. 注射用 C. parvum 卵囊的制备
注意：Cryptosporidium 卵囊购自商业来源（参见材料表）。这些卵囊由犊牛产生，并保存在含抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS）中。可在 4 °C 下保存约 3 个月，切勿冷冻。我们通常在一个月内使用卵囊。可使用完整卵囊感染类器官，或者也可从脱囊卵囊中分离子孢子用于感染类器官，以避免原始接种物中的卵囊残留。
- 准备 隐孢子虫 用于感染细胞的卵囊（图1A).
- 在整个操作过程中，将卵囊保持在冰上，直至添加至类器官中。
- 计算一个完整的六孔板类器官所需的卵囊数量（通常约为 5 x 105–2.5 × 105 用血细胞计数板对载玻片上的卵囊数量进行计数以确认数量，随后转移至离心管中。
注意： 为便于观察，可将卵囊与卵囊特异性荧光抗体按1:1比例混合（参见 材料表) 后再加载到血细胞计数板上....
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结果
本文所展示的方案可高效纯化卵囊和子孢子（图1A），适用于显微注射。通过脱囊方案可从约70–80%的卵囊中释放出子孢子，因此必须使用3 µm滤膜过滤去除残留的卵囊及囊壳。过滤后可实现接近100%的子孢子纯度（图1B）。此外，加入绿色染料有助于确保所有类器官均被注射，并可在注射后至少24小时内对已注射的类器官进行可视化观察（图2B）。
这些制备卵囊和子孢子的方案简单易行，已使用多年，因此预期处理后的卵囊和纯化的子孢子具有活力且具备感染性。然而，在我们的研究中，我们采用扫描电子显微镜确认脱囊过程未对子孢子或卵囊造成损伤（图2A）10。通过简单的显微成像可直观确认等量卵囊已注入类器官腔内（图2C）。应取部分感染的类器官样本，采用我们已描述的方法通过.......
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讨论
培养 隐孢子虫 肠道和气道类器官中的寄生虫为研究宿主-寄生虫相互作用提供了精确的模型10 但还具有许多其他应用。例如，目前选择和扩增转基因的常用方法 隐孢子虫 寄生虫需要在小鼠体内传代19 无法分离出对体内感染至关重要的已发生修饰的寄生虫。类器官培养 隐孢子虫 为该操作提供了一种替代方法。然而，我们注意到电穿孔处理后的子孢子容易发生聚集，从而堵塞微移液管。为了筛选基因修饰的寄生虫，可在胶原包被的transwell上以二维形式培养类器官，并在分化条件下培养，以允许转染后的子孢子感染，进而筛选获得基因修饰的卵囊。transwell装置可同时接触顶端和基底外侧表面，并可在较长时间内保持稳定。
目前，我们将类器官以二维形式进行培养，用于对源自癌组织的类器官开展高通量药物筛选（未发表数据）。该类器官培养方法也可适用于抗肿瘤药物的测试隐孢子虫 使用基因修饰的荧光素酶标记药物 隐孢子虫 菌株
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢美国亚利桑那大学农业与生命科学学院动物与比较生物医学科学系（位于亚利桑那州图森市）的 Deborah A. Schaefer 在卵囊制备与分析方面提供的帮助。我们还感谢华盛顿州立大学 Franceschi 显微镜与影像中心以及 D.L. Mullendore 在分离类器官卵囊的透射电镜样品制备与成像方面给予的支持。
D.D. 获得了荷兰科学研究组织（NWO-ALW，016.Veni.171.015）的 VENI 项目资助。I.H. 获得了荷兰科学研究组织（NWO-ALW，863.14.002）的 VENI 项目资助，并获得了欧洲委员会玛丽·居里奖学金（项目编号 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF）的支持。本研究工作获得了欧洲研究理事会高级资助协议编号 67013 以及美国国立卫生研究院国家补充与综合健康研究中心（NIH NIAIH）R21 AT009174 项目对 RMO 的资助。本研究属于 Oncode 研究所的一部分，该研究所部分由荷兰癌症协会资助，并获得了荷兰癌症协会资助项目的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 基底膜提取物（细胞外基质） | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo 抗体（卵囊特异性抗体） | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | 终浓度 = 每张载玻片使用 2–3 滴 |
| Crypto-Grab IgM 包被磁珠 | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 磁架 | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 磁架 | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore 聚碳酸酯膜滤器 - 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| 快绿染料 | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i 显微注射仪 | Eppendorf | 5252000013 | |
| 直径为 1 mm 的玻璃毛细管 | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel（细胞外基质） | Corning | 356237 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| 微量加样器吸头 | Eppendorf | 612-7933 | |
| 玻璃毛细管拉制仪 P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| 正常驴血清 | Bio-Rad | C06SB | |
| 青链霉素双抗（Penstrep） | Gibco | 15140-122 | |
| 次氯酸钠（使用 5%） | Clorox | 50371478 | |
| 超强粘附载玻片 | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47 mm 聚碳酸酯滤器支架 | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| 牛磺胆酸钠水合物 | SIGMA | T4009-5G | |
| 吐温-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield 封片剂 | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 涡旋振荡器 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++（DMEM+青链霉素+谷氨酰胺+HEPES） | 最终体积 | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500 mL |
| 青链霉素双抗（Penstrep） | Gibco | 15140-122 | 500 mL DMEM 中加入 5 mL 储存液 |
| 谷氨酰胺（Glutamax） | Gibco | 35050038 | 500 mL DMEM 中加入 5 mL 储存液 |
| HEPES | Gibco | 15630056 | 500 mL DMEM 中加入 5 mL 储存液 |
| 肠道类器官培养基-OME（扩增培养基） | 终浓度 | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5 µM |
| Adv+++ | 定容至 100 mL | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1x |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| 胃泌素 | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
| Noggin CM | 本实验室制备* | 10% | |
| p38 抑制剂（SB202190） | Sigma | S7076-25 mg | 10 µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 每 500 mL 培养基加入 1 mL |
| RSpoI CM | 本实验室制备* | 20% | |
| Wnt3a CM | 本实验室制备* | 50% | |
| 本实验室制备* — 细胞系可根据请求提供 | |||
| 肠道类器官培养基-OMD（分化培养基） | 为诱导类器官分化，将扩增中的小肠类器官在富含 Wnt 的培养基中培养 6–7 天后，转入分化培养基（从富含 Wnt 的培养基或 OME 中去除 Wnt、烟酰胺、SB202190 和前列腺素 E2） | ||
| 肺类器官培养基-LOM（分化培养基） | 终浓度 | ||
| Adv+++ | 定容至 100 mL | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500 nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25 ng/mL |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| 烟酰胺 | Sigma | N0636-100G | 5 mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | 直接联系公司 | 10% |
| p38 MAPK 抑制剂 | Sigma | S7076-25 mg | 1 µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| Rho 激酶抑制剂 Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5 µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | 直接联系公司 | 10% |
| 还原缓冲液（用于重悬卵囊和子孢子以进行注射） | 终浓度 | ||
| 还原型 L-谷胱甘肽 | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μL OME/OMD/LOM |
| 甜菜碱 | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μL OME/OMD/LOM |
| L-半胱氨酸 | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μL OME/OMD/LOM |
| 亚油酸 | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/mL OME/OMD/LOM |
| 牛磺酸 | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μL OME/OMD/LOM |
| 封闭缓冲液（用于免疫荧光染色） | 终浓度 | ||
| 驴/山羊血清 | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | 定容至 100 mL |
| 吐温 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| 所用抗体列表 | |||
| Alexa 568 标记山羊抗兔 IgG | Invitrogen | A-11011 | 稀释比例 - 1:500；RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo 综合试剂盒 - 荧光素标记抗体 Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | 稀释比例 - 1:200 |
| Crypta-Grab IMS 磁珠 - 单克隆抗体包被的磁珠 | Waterborne, Inc | IMS400-20 | 稀释比例 - 1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | 稀释比例 - 1:1,000；RRID: AB_2629482 |
| 鬼笔环肽-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | 稀释比例 - 1:1,000；RRID: AB_2620155 |
| 由 R. M. O’Connor（共同作者）制备的兔抗 gp15 抗体 | 根据请求提供 | 根据请求提供 | 稀释比例 - 1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | 稀释比例 - 1:200 |
参考文献
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al.
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