3D运动性步态分析,用于啮齿动物的临床前研究

在啮齿动物中,神经疾病后前肢和后肢运动缺陷通常使用主观评分^系统1进行评估。自动化系统2、3、4、5 已被采用用于步态分析,但存在缺点,因为主要结果基于足迹分析,未能捕获关键段形和关节运动学变量,否则可以揭示肢体^运动2的真正运动学。由于大多数步态参数是相关的,因此需要收集步态参数,以了解大鼠为完全评估运动缺陷而采用的补偿。

在过去的十年中,已经为人类生物医学研究开发了多个3D运动分析系统6。这些系统已经成功,并证明是有效的捕捉在健康人类成年人的运动缺陷,以及改变的运动学行走6,7。在啮齿类动物中,目前可用的3D运动运动系统采用复杂的算法和建模的运动行为,并利用复杂的数据分析技术8,9,10,11,这最终限制了它们的多功能性。此外,文献中没有充分解释用于收集大多数3D运动采集系统数据的方法。缺乏关于数据收集和分析程序、限制和有效使用系统所涉及的技术的详细信息。

因此,研究人员的一个共同观点是,3D 运动跟踪运动评估相当费时且耗时,需要技术专业知识和精心的数据分析。这项工作的目的是分解数据收集和分析协议,并通过一步一步的过程描述方法,以便它是客观的、易于学习的,并且可以系统地加以处理。今天,在神经损伤和临床前研究的干预之后,越来越强调以更全面和系统的方式评估功能性运动行为。

在四足运动领域,这里介绍的是使用3D运动跟踪系统,它可以提供额外的信息,如身体姿势,爪子旋转相对于身体轴,关节的相互关系,和更准确的信息在协调,同时同时可视化整个动物从所有平面。这反过来又可以通过多种结果揭示健康大鼠和受伤大鼠体内和受伤大鼠之间运动行为的重要差异。通过更精细的运动学分析,准确和客观,错误推断干预的影响的风险最小化。此运动捕获软件生成的数据逐帧可视化,可自动跟踪,数据收集或量化不需要任何其他算法或建模。这项工作的目的是提供方法细节和考虑涉及数据收集和分析3D步态运动学在跑步机运动期间的健康和脊髓受伤的大鼠。该协议供在实验中利用神经大鼠模型的临床前研究人员使用。

这项研究是根据国家卫生研究所《实验室动物护理和使用指南》的建议进行的。该协议得到了石溪大学校长动物研究委员会的批准。

1. 设置运动捕捉系统

1. 设置
2. 使用可精确调节的齿轮头将六个摄像机安装在墙壁(或三脚架)上。将三台摄像机放置在跑步机的每一侧,每台摄像机在地平线以下倾斜 20°-45°,距离跑步机约 2.0 米,距离相邻摄像机约 0.5 米,以实现标记的最大覆盖范围(图 1)。
   1. 为每个摄像机配备环形灯,以可视化反光标记。
3. 启动运动捕捉系统。
   1. 在"项目"下 |规范,为实验定义所需的标记。
      注:出于演示目的,前肢和后肢共使用22个标记(每侧11个标记)来评估双边四足运动。或者,具有特定标记 ID 的导入标记集允许在软件内进行预设计算。

2. 运动捕获系统的校准

1. 捕获校准视频
   1. 将 L 形校准框架(以下简称"L 帧")正交放置在跑步机上,L 型框架的长腿指向大鼠的行走方向(图 2)。
   2. 打开运动捕捉软件并选择"录制"以捕获校准视频。
   3. 将三叉形校准框架(以下简称"魔杖")移到整个空间的跑步机区域,以覆盖大鼠将进入的所有区域。
      注: L 帧包含四个建立全局坐标系的标记,魔杖包含三个标记,这些标记将校准大鼠的 3D 行走空间。
   4. 记录至少 1 分钟的素材,以确保有足够的魔杖数据点,以便以 120 帧/秒进行正确校准。
   5. 将视频另存为 3D 校准文件。
2. L 帧跟踪
   1. 右键单击相机组并选择3D跟踪。在下拉窗口下,选择3D校准视频,然后选择所有校准摄像机。
   2. 使用定点功能,在六个校准视频中分别跟踪 L 帧原点、L 帧短帧、L 帧中长和 L 帧长。定义所有点并选择"自动搜索"按钮。
      注:在整个实验过程中,L 帧位置必须相对于跑步机保持一致,以防止坐标系移动。
3. 魔杖跟踪
   1. 右键单击相机组并选择"自动 3D-魔杖跟踪"。
   2. 选择摄像机选择中的所有摄像机。在窗口右下角,选择"选项","取消选择检测 L帧",然后选择"开始跟踪"。
   3. 自动跟踪后,为所有六个摄像机选择"分配魔杖短、魔杖中"和"魔杖长"标记。
   4. 在3D 跟踪窗口中,选择"导出到原始数据",然后选择"覆盖现有魔杖数据"选项以保存跟踪。
   5. 在最后一步之后出现的窗口中选择"是",以保存最准确的数据。
      注: 此新跟踪将保存在左侧边栏的"自动跟踪"选项卡下。以后可以访问和编辑保存的跟踪。
4. 计算校准
   1. 右键单击相机校准组并选择"新魔杖校准组"。
   2. 选择"所有摄像机"并按住Ctrl(控制)键,同时选择"确定"。
   3. 将魔杖长度更改为 100.00 mm,将 L 帧地板偏移更改为 7.00 mm,将异常值检测的迭代更改为 4,并允许魔杖长度偏差为 0.300。
   4. 将魔杖在选项中必须可见的相机更改为 4,并打开以下内容:修复纵横比、修复偏斜参数和修复主要点(表 1)。
      注: 这些设置经实验确定是此设置的最佳选择。
   5. 接受标准偏差小于 3 mm 且残值小于 0.004 的魔杖长度的校准。
      注:如果摄像机或相关设备移动超过此点,则需要重新校准系统。

3. 训练和准备动物跑步机运动

1. 训练大鼠进行跑步机运动
   1. 在^训练课12之前,让大鼠在跑步机上适应5分钟。
   2. 训练大鼠以13厘米/秒的速度以13厘米/秒的速度行走,在上午进行15分钟/次,为期1周。训练所有老鼠,直到他们能够持续行走(至少10个连续步骤)在跑步机12。
   3. 完成每只大鼠在一天中同一时间的训练。
2. 在收集数据之前,通过将大鼠放入孵化室来麻醉大鼠。
   1. 输送非卢兰气体(1.0%-2.5%)和0.4L的氧气约5分钟。捏住大鼠的脚,检查麻醉的深度。
   2. 当大鼠对爪子捏合没有反应时继续(负爪戒反射)。
3. 在放置标记的区域对大鼠进行毛毛处理,以避免毛皮干扰标记跟踪(图1)。
   1. 将皮肤用于骨质地标,以放置标记物。使用笔标记用于肘部和膝关节的远端(图3)。
      注:反光标记是直径为 0.5 厘米的塑料半球,覆盖有反光胶带。
   2. 在数据收集之前,根据需要将标记放在骨质地标上(图3)。
      注:在健康的非神经创伤性大鼠中,放置在远端关节上的反光标记经常被大鼠去除。出于演示目的,反光标记被放置在近端骨质地标(后肢的骨峰、髋关节、前肢的膝关节、肩关节和肘关节)上,笔标记用于较远端的地标。在我们手中,这已经产生了可重复的结果之间和大鼠内部(未公布的数据)。

4. 运动捕捉

1. 选择运动捕捉软件顶部栏上的红色摄像机按钮以记录试用。在计算机上指定保存位置,然后选择"开始录制"以 120 帧/秒进行录制。
2. 设置用户定义的跑步机速度,让大鼠行走约 30 s,或至少连续 10 步。
3. 停止录制并检查素材至少包含 ±10 个连续步骤,然后再继续。
4. 保存录制的视频后,为每个试用版创建新的摄像机组。

5. 运动跟踪

1. 选择"+"符号相邻的保存的相机组。 这将显示所有六个摄像机的列表。
2. 为摄像机文件分配 3D 校准
   1. 转到相机校准组,右键单击"计算校准"。选择"分配 3D 摄像机参数"。将校准文件分配给保存的摄像机组中的相应摄像机文件。将鼠标悬停在相机文件上以验证校准(读取为3D 校准有效)。
3. 单个摄像机 2D 跟踪
   1. 右键单击摄像机组进行运动跟踪。选择2D 跟踪。
   2. 选择七到十个最佳连续和一致的跟踪步骤。记录每一步在跑步机上参考肢体的第一次接触时的框架编号。
      注:出于演示目的,选择左后肢作为参考肢体。
4. 提供各种跟踪选项。
   1. 右键单击感兴趣的标记并选择"自动跟踪",这将检测由反光标记创建的亮点(图 4)。
   2. 或者,使用模式匹配来跟踪标记,它将使用软件中内置的算法来跟踪基于大小和颜色的标记(图 4)。
   3. 手动跟踪和更正无法检测到的标记或跟踪错误。
5. 当远端关节反光标记无法时,请使用黑色标记。
   1. 通过将黑色标记反转到亮点以进行自动跟踪,使用高级图像处理跟踪黑色标记。
      注:图像处理选项可用于帮助跟踪难以检测或查看的标记。
   2. 右键单击 2D 跟踪窗口中的大鼠视频。选择图像处理。
   3. 选择"高级视图"并添加四个滤镜(亮度、对比度、伽玛)的组合,以使黑色标记与其周围环境尽可能暗。最后,添加反转,黑色标记将成为可自动跟踪的明亮标记(图 5)。
6. 标记放置校正
   1. 手动跟踪和更正无法检测到的标记或跟踪错误。
   2. 要手动跟踪视频,请在右侧边栏上选择所需的标记。右键单击并选择"手动跟踪"。开始跟踪逐帧显示的大鼠视频上的选定标记。
   3. 要纠正任何错误,请访问发生跟踪错误的帧。右键单击右侧边栏中的特定标记选项卡,然后单击"删除点"。在准确位置手动重新跟踪点。
7. 使用上述方法,对连续步长帧范围内用于所有所需标记的所有摄像机进行 2D 跟踪。
8. 单击整个跟踪过程的"保存"。

6. 运动学分析

1. 阶段分配
   1. 右键单击"阶段"并选择"编辑阶段模型"。
   2. 根据一个人选择研究的不足,根据每个肢体的步态周期阶段(例如,添加拖动阶段、脚趾卷曲阶段等)在步进周期的传统姿势和摆动阶段定制步态周期阶段。定义实验的阶段 (图 6)。
      注:出于演示目的,此处显示了三个阶段,左后肢用作七到十个步态周期的参考肢体。
   3. 右键单击摄像机组中的摄像机并选择显示视频。
   4. 使用添加相位按钮或 F11 快捷键为软件中的每个肢体分配步态周期的阶段。
   5. 选择要分析的肢体,并将第一帧跟踪指定为Stance 阶段的开始。
   6. 将视频前进到姿态相位结束和摆动阶段开始的帧。指定此帧为摆动阶段的开始。
   7. 将视频前进到脚开始下降的第一帧。指定此帧为中回转阶段的开始。
      注:本文将每个肢体的步进周期的姿势阶段定义为肢体接触跑步机表面的第一帧。摆动阶段被定义为肢体离开跑步机表面的第一帧。中间摆动阶段是肢体达到最大间隙并开始下降的框架。从初始姿态开始到下一个步态周期的姿势阶段分配,定义了完整的步态周期。
   8. 重复这些步骤,直到每个步骤的肢体阶段分配完成。对其他三肢重复上述步骤。
2. 3D 坐标计算
   1. 跟踪所有六台摄像机后,执行 3D 计算。
   2. 右键单击相机组并选择"新建 3D计算",单击"全部"以选择相机,然后选择"确定"。
      注: 将显示一个新文件夹。此文件夹包含跟踪的所有标记的所有 3D 坐标数据。要查看和/或编辑相位,请右键单击左侧边栏中的3D 坐标并选择"编辑相位"(图 7)。
   3. 通过拖出感兴趣的标记,与分配的步态相并排查看,生成感兴趣的数据,例如带有数据点的关节高度或速度图。(例如,图8中的关节运动学)。
3. 3D 图
   1. 单击3D 关系图生成试用版 3D 图形。
4. 通过右键单击3D 坐标/导出导出原始数据。
   1. 右键单击3D 坐标文件并选择"导出"。
   2. 在电子表格软件中打开文件,并将数据导入 MATLAB。
   3. 创建程序以创建肢体步长协调图。
      注:3D 坐标数据可以导出到分析软件或自定义宏脚本中,以生成超出软件功能提供的数据。

该协议演示了一种使用简单的内置软件对啮齿动物跑步机运动进行定量3D运动数据收集和分析的方法。结果表明,该方案在采集和分析健康、脊髓损伤大鼠的四足运动运动运动学方面是可行的。具有大鼠处理经验的研究人员必须在大鼠身上放置标记,然后校准和使用运动捕捉系统,没有任何关键问题。无需使用复杂的算法即可轻松生成数据。

在这里,该协议在健康和脊髓损伤(C5右截面)大鼠中实施。就本手稿而言,仅显示具有代表性的结果。总体而言,从每个标记的3D坐标中很容易获得关节和肢体段运动的各种运动学。异常步态周期和健康步态周期之间的严重差异很容易被检测出来,结果包括(但不限于)步高测量、关节速度、关节角度(图9)、四肢的步进周期相长,和肢体协调(图10)。以图和棒图的形式分析定性数据,可以指导确定用于实现此分析方法最终结果的定量工具(图11)。

在具有代表性的健康大鼠中,肘部角度轮廓显示平滑的单峰,相邻步态周期一致,显示完整的运动范围(图9)。走线交替姿态相和摆动阶段持续时间表明,肢体内协调一致。相比之下,代表性脊髓损伤大鼠的肘角轮廓显示多个扭曲峰,这些峰的一致性较低,运动范围较小。除了改变延长的姿势阶段和缩短摆动阶段持续时间外,RFL的肢体内协调也不足。

在绘制用于协调的代表性数据中,发现由有代表性的健康大鼠生成的协调图(图10)在步态期间在益边四肢中表现出定义明确、交替的节律协调周期(L形图案)和相内D形图案与反向四肢。相比之下,一只代表性的脊髓损伤(C5右截面)大鼠在侧肢中表现出较差的非交替和非节奏协调,以及其中一个反向侧侧异常的交替节奏协调(L形模式)肢体配对(图10)。鉴于在录制的运动视频中右前肢的可观察到的缺失,这表明RFL和LHL在任何特定时间没有LFL或RHL的支持就无法承受全部重量。这种趋势建议一种补偿机制,以应对跑步机上的强迫行走速度。

使用 3D 系统可以轻松生成可量化数据,但这涉及访问单独的选项卡并从软件中可用的多种选项中进行选择。目前正在开发一个自动化模板,将定量和定性数据生成到单个报告中,以产生最明显的感兴趣结果(无需单独产生不同的结果),这是通常使用用于临床研究的运动学系统。因此,可以以报表格式编译和导出多个终结点,在试用后立即轻松可视化。

图 1:实验设置。(A) 为跑步机行走任务设置的六相机运动数据收集设置的原理图。一套三个摄像头被放置在跑步机的两侧,以捕捉(逐帧)在运动过程中左右标记运动。(B) 描绘在啮齿动物前肢和后肢的骨质地标上的标记放置图,以捕捉四足运动运动运动学。总共在大鼠的每一侧放置11个标记。带沙的区域显示大鼠被扫描的区域。请点击此处查看此图的较大版本。

图 2:用于校准的标记。(A) 使用两个校准帧(L-帧和魔杖 (B) 标记设置工作,坐标系由 L 帧定义,其中 L 帧原点(框架两条腿的交集)定义为 (0,0)。L-Frame、L-Frame 短和 L 帧长的两个四肢分别定义 x 轴和 y 轴,z 轴定义为垂直于 XY 平面。请点击此处查看此图的较大版本。

图 3:标记类型。(A) 大鼠下躯干的照片,显示所使用的两种标记。(B)照片显示,在圆锥顶上放置了一个反光标记,带有双面胶带,旨在粘附在皮肤上(圆圈红色)。(C)照片显示笔标记在右元质关节(圆圈红色)上的位置。请点击此处查看此图的较大版本。

图 4:运动跟踪。(A) 图像显示运动跟踪界面,其中可以使用"自动跟踪"和"使用模式匹配跟踪"功能同时跟踪多个标记。(B) 在标记分配期间,在"自动跟踪"函数中,反光标记的放大视图被检测为明亮的白色圆形点。该软件将此点识别为明亮的蓝色圆形点。红点最终被识别为指定标记的中心。圆形标记中的中心红点可降低数据跟踪期间出现实验错误的可能性。偏离中心表明,后续的测量和分析可能不准确。(C)为图案匹配选择的反射标记的放大视图。根据所选标记的大小、形状和颜色,软件会自动识别与后续视频帧中描述匹配的标记。请点击此处查看此图的较大版本。

图 5:基本和高级跟踪选项。(A) 视频可以在软件内处理,在分析过程中右键单击视频,以便清晰显示清晰或模糊的标记,以便自动跟踪。出于演示目的,将显示两种类型的图像处理设置,这些设置在数据收集期间进行了调整以适应不同的环境照明条件,以便于跟踪。(B) 图像处理前的代表性视频帧。(C) 对于基本图像处理(处理类型 I),亮度和对比度设置会调整为更清晰的视图。(D) 使用高级图像处理设置(处理类型 II),将反转正确的元状关节关节标记(黑色标记),然后自动跟踪。请点击此处查看此图的较大版本。

图 6:相位分配。根据实验设计,每个肢体的步态周期可分为离散相位。出于演示目的,显示了三个步态循环阶段。(A) 姿态相定义为肢体接触跑步机表面的第一帧.(B) 摆动阶段被定义为肢体离开跑步机表面的第一帧 (C) 中摆动阶段是肢体间隙后的第一帧,其中爪子开始下降。在 (D) 中,从初始姿态开始到下一个步态周期的姿势阶段分配,定义了完整的步态周期。请点击此处查看此图的较大版本。

图 7:步骤相分析的高级选项。此选项允许深入了解跟踪和相位分配,以及更改相位分配的能力。(A) 标记选择框,用于查看和选择所需的标记。(B) 坐标选择窗口:突出显示兴趣坐标(在本例中为 z 坐标)将在主关系图窗口中以红色显示。(C) 相位选择窗口:可以相对于 (A) 和 (B) 中选择的标记和坐标查看肢体的分配相位。也可以通过此窗口编辑阶段。(D) 图表窗口:特定标记的坐标可在单个步态周期阶段同时比较。绿色和黄色分别表示四肢运动期间右后肢的姿势和摆动阶段。请点击此处查看此图的较大版本。

图 8:3D 运动学数据样本。(A) 在视频跟踪 (B ) 为每个前肢和后肢的姿势和摆动相周期生成代表性数据后,每个关节标记的各种结果可以从 3D 坐标数据集中形象化显示四足动物在老鼠中行走。颜色表示连续步进周期的姿势和摆动阶段。红色和绿色分别对应于右前肢和后肢姿势阶段。蓝色和青色分别对应于左前肢和后肢姿势阶段。黄色对应于每个肢体的摆动阶段。(C) 多个数据组(离散标记或结果)可以同时比较, 轻松.任意选择左右膝关节标记的 z 坐标速度数据,以显示跑步机表面膝关节标记的垂直速度。请点击此处查看此图的较大版本。

图 9:在跑步机运动过程中,来自健康及颈椎损伤大鼠的代表性关节角运动学数据。(A) 健康代表性大鼠的弯头关节角度轮廓显示平滑的单峰关节角度轨迹与一致的相邻步态周期,显示完整的运动范围。红色和黄色条分别表示前肢步数周期的姿势和摆动阶段。(B) 相反,代表性脊髓损伤大鼠的足迹相对失真较多,并且与整体较小关节运动范围的多个峰不一致。请点击此处查看此图的较大版本。

图 10:在跑步机运动过程中,来自健康及颈椎损伤大鼠的肢体协调数据。(A) 在四足行走期间,从大约 10 个步骤的四肢之间绘制了描绘步长高度度量的元细胞-喉(MCP) 和元骨素 (MTP) 标记的 z 坐标值。所示是所有六种可能的肢体协调对的代表性演示。(B) 健康大鼠对所有对(i、ii、iii、iv)表现出明显的交替节奏协调(L形图案)。当四肢处于相(v,vi)时,协调对遵循D形模式。(C) 在颈椎受伤的大鼠中,注意 (i) 两个前肢之间的协调不良,(iii) 右侧对和 (iv) 一个反向肢体对的异常协调。请注意,协调图 (B、C) 不共享相同的比例。请点击此处查看此图的较大版本。

图 11: 动画3D棒图。从跟踪数据生成的 3D 斗杆图形的示例。请点击此处下载此图。  

表 1:高级校准设置。下表总结了我们用于精确校准六摄像机设置的参数。这些设置经过实验测试,发现最适合我们的设置。

作者没有什么可透露的。