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用于啮齿类动物临床前研究的三维运动学步态分析

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DOI：

10.3791/59612

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2019年8月3日

 , 
1Department of Neurobiology and Behavior, Stony Brook University, 2Department of Physical Therapy, Stony Brook University

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于临床前研究的啮齿类动物四足运动三维运动学数据采集与分析方案。

摘要

三维（3D）运动学运动分析系统在啮齿类动物中的应用受到一定限制。造成这种局限性的部分原因在于，3D数据采集与分析过程通常涉及复杂的算法和数学建模。本研究提供了一种简单、用户友好、逐步详述的方法，用于在健康和神经损伤大鼠跑步机运动过程中，利用六摄像头动作捕捉系统进行三维运动学步态分析。同时提供了以下方面的详细信息：1）针对四足运动定制的实验装置中系统的校准方法；2）在成年大鼠跑步机运动过程中，通过在四肢放置标记点进行数据采集；3）视频追踪与数据处理的可选方案；4）利用内置数据采集软件生成、可视化及量化基本三维运动学数据的方法。最后，建议将该动作捕捉系统的应用拓展至研究神经损伤前后多种运动行为的分析。

引言

在啮齿类动物中，神经系统疾病后前肢和后肢的运动功能障碍通常采用主观评分系统进行评估1。尽管已有研究采用自动化系统2,3,4,5进行步态分析，但这些方法存在局限性，因其主要结果依赖于足印分析，无法捕捉关键的节段性和关节运动学参数，而这些参数能够更真实地反映肢体运动的运动学特征2。由于大多数步态参数之间存在相关性，因此需要整合一系列步态参数，以全面理解大鼠为代偿功能缺损所采用的策略，从而完整评估其运动功能障碍。

在过去十年中，已开发出多种用于人类生物医学研究的三维运动分析系统6。这些系统已被证实能够有效捕捉健康成人在运动功能方面的缺陷，以及行走时运动学参数的改变6,7。在啮齿类动物研究中，目前可用的三维运动学分析系统采用了复杂的算法和建模方法来分析运动行为，并依赖于精密的数据分析技术8,9,10,11，这在一定程度上限制了其通用性。此外，大多数三维运动捕捉系统在数据采集过程中所使用的方法在现有文献中并未得到充分说明。有关数据采集与分析流程、技术局限性以及系统有效使用所需的关键技术细节仍较为缺乏。

因此，研究人员普遍认为，三维运动追踪运动学评估是较为费力且耗时的过程，需要专业技术知识和复杂的数据分析。本研究的目的是分解数据采集和分析流程，通过逐步描述方法，使其具有客观性、易于学习，并可系统化实施。目前，在临床前研究中，针对神经系统损伤及干预后的功能性运动行为，人们日益强调以更全面、系统的方式进行评估。

在四足运动研究领域，本文介绍了一种三维运动追踪系统的应用，该系统能够提供额外的信息，例如身体姿势、足爪相对于身体轴线的旋转角度、关节间的相互关系，以及关于运动协调性更精确的数据，同时可从各个平面同步可视化整个动物的运动过程。通过多种结果指标，该方法能够揭示健康大鼠与损伤大鼠在运动行为上的关键差异。借助更精细、准确且客观的运动学分析，可最大限度地降低对干预措施效果产生误判的风险。该运动捕捉软件生成的数据可逐帧可视化，用于评估运动质量，并支持自动追踪，数据采集或量化过程无需额外的算法或建模。本研究旨在提供在健康及脊髓损伤大鼠跑步机运动过程中，进行三维步态运动学数据采集与分析的方法学细节和相关注意事项。本方案适用于在实验中使用神经学大鼠模型的临床前研究人员。

方案

本研究遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的建议进行。实验方案经石溪大学校长动物研究委员会批准。

1. 动作捕捉系统的设置

  1. 设置
  2. 使用可精细调节的齿轮云台将六台摄像机安装在墙壁上（或三脚架上）。在跑步机两侧上方各放置三台摄像机，每台摄像机向下倾斜 20°–45°，距离跑步机约 2.0 m，相邻摄像机之间相距约 0.5 m，以实现对标记点的最大覆盖范围（图 1）。
    1. 为每台摄像机配备环形光源，以便可视化反光标记点。
  3. 启动运动捕捉系统。
    1. 在 项目 | 规格 下，定义实验所需的标记点。
      注意：为演示目的，前肢和后肢共使用 22 个标记点（每侧 11 个），以评估双侧四足运动。或者，可使用 导入带有特定标记点 ID 的标记点集 选项，以实现软件内的预设计算。

2. 动作捕捉系统的校准

  1. 采集校准视频
    1. 将L形校准架（下文简称 "L架"）垂直放置于跑台上，使L架的长边指向大鼠行走方向（图2）。
    2. 打开运动捕捉软件，选择 录制 以采集校准视频。
    3. 在跑台空间范围内移动三叉形校准架（下文简称 "探针"），确保覆盖大鼠行走的所有区域。
      注：L架包含四个标记点，用于建立全局坐标系；探针包含三个标记点，用于校准大鼠的三维行走空间。
    4. 至少录制1分钟的视频，以确保在120帧/秒的条件下获得足够多的探针数据点。
    5. 将视频保存为3D校准文件。
  2. L架追踪
    1. 右键单击相机组，选择 3D追踪。在下拉窗口中，选择 3D校准视频，然后选择 所有校准相机。
    2. 使用固定点功能，在六段校准视频中的每一帧上分别追踪L架原点、L架短边、L架中点和L架长边。定义所有点后，点击 自动搜索 按钮。
      注：在整个实验过程中，L架相对于跑台的位置必须保持一致，以防止坐标系发生偏移。
  3. 探针追踪
    1. 右键单击相机组，选择 自动3D探针追踪。
    2. 在相机选择中选中所有相机。在窗口右下角选择 选项，取消勾选 检测L架，然后点击 开始追踪。
    3. 自动追踪完成后，为全部六台相机选择 分配探针短端、探针中点和探针长端标记。
    4. 在 3D追踪 窗口中选择 导出至原始数据，然后选择 覆盖现有探针数据 以保存追踪结果。
    5. 在上一步完成后弹出的窗口中选择 是，以保存最精确的数据。
      注：此次新的追踪结果将保存在左侧侧边栏的 自动追踪 选项卡下的 追踪 项中。已保存的追踪数据可后续访问并编辑。
  4. 计算校准
    1. 右键单击 相机校准组，选择 新建探针校准组。
    2. 选择 所有 相机，并在按住 Ctrl （控制）键的同时点击 确定。
    3. 将探针长度设为100.00 mm，L架地面偏移设为7.00 mm，离群值检测迭代次数设为4，允许的探针长度偏差设为0.300。
    4. 将 探针必须可见的相机数量 选项设为4，并启用以下选项：固定宽高比、固定剪切参数和固定主点（表1）。
      注：这些参数经实验确定为此装置的最佳设置。
    5. 接受探针长度标准差小于3 mm且残差值小于0.004的校准结果。
      注：若此后移动了相机或相关设备，则必须重新校准系统。

3. 动物跑台运动的训练与准备

  1. 训练大鼠在跑步机上行走
    1. 在每次训练前，让大鼠在跑步机上适应 5 分钟12。
    2. 训练大鼠以四肢完全负重的方式在早上以 13 cm/s 的速度行走，每次 15 分钟，持续 1 周。对所有大鼠进行训练，直至它们能够持续在跑步机上行走（至少连续 10 步）12。
    3. 每天在大致相同的时间为每只大鼠完成训练。
  2. 在数据采集前，将大鼠放入孵育室中进行麻醉。
    1. 输送异氟烷气体（1.0%–2.5%）和 0.4 L/min 的氧气，持续约 5 分钟。轻捏大鼠足部以检查麻醉深度。
    2. 当大鼠对足部夹捏无反应（足部回缩反射阴性）时，继续下一步操作。
  3. 剃除将要放置标记物区域的毛发，以避免毛发干扰标记物的追踪（图 1）。
    1. 触诊皮肤以确定骨性标志的位置并放置标记物。肘关节和膝关节远端的关节使用笔式标记物（图 3）。
      注：反光标记物为直径 0.5 cm 的塑料半球，表面覆盖反光胶带。
    2. 在数据采集前，按需将标记物放置于骨性标志处（图 3）。
      注：在健康、无神经损伤的大鼠中，放置于远端关节的反光标记物常被大鼠自行移除。为演示目的，反光标记物被放置于近端骨性标志处（如髂嵴、髋关节、膝关节用于后肢，肩关节和肘关节用于前肢），而远端标志则使用笔式标记物。据我们观察，这种方法在不同大鼠之间及同一大鼠内部均能获得可重复的结果（未发表数据）。

4. 动作捕捉

  1. 在动作捕捉软件顶部工具栏中选择红色摄像机按钮以开始录制试验。指定计算机上的保存位置，然后选择开始录制，以120帧/秒的速度进行录制。
  2. 设置用户自定义的跑步机速度，使大鼠行走约30秒，或至少连续行走10步。
  3. 停止录制，并在继续操作前检查视频是否包含至少约10个连续步态周期。
  4. 保存录制的视频后，为每次试验创建一个新的摄像机组。

5. 运动追踪

  1.  点击保存的相机组旁边带有 " +" 的符号。这将显示所有六个相机的列表。
  2. 为相机文件分配三维校准
    1. 进入 相机校准组，右键单击 计算出的校准，选择 分配三维相机参数。将校准文件分配给已保存相机组中对应的相机文件。将鼠标悬停在相机文件上以确认校准状态（显示为 三维校准有效）。
  3. 单个相机的二维追踪
    1. 右键单击用于运动追踪的相机组，选择 二维追踪。
    2. 选择七到十个最佳的连续且稳定的步态周期用于追踪。记录每个步态周期中参考肢体首次接触跑步机时的帧编号。
      注：为演示目的，本实验选择左后肢作为参考肢体。
  4. 提供多种追踪选项。
    1. 右键单击感兴趣的标记点，选择 自动追踪，系统将检测由反光标记产生的明亮圆形斑点（图4）。
    2. 或者使用 模式匹配 进行标记点追踪，该功能将利用软件内置算法，根据标记点的大小和颜色进行追踪（图4）。
    3. 手动追踪并修正无法自动检测的标记点或追踪错误。
  5. 当远端关节无法使用反光标记时，可使用黑色标记点。
    1. 通过高级图像处理技术对黑色标记点进行追踪，将其反转为亮斑以实现自动追踪。
      注：图像处理 功能可用于辅助追踪难以检测或观察的标记点。
    2. 在二维追踪窗口中右键单击大鼠视频，选择 图像处理。
    3. 选择 高级视图，并组合使用四种滤镜（亮度、对比度、伽马值），使黑色标记点相对于周围背景尽可能变暗。最后添加“反相”处理，黑色标记点将变为亮斑，从而可被自动追踪（图5）。
  6. 标记点位置校正
    1. 手动追踪并修正无法检测的标记点或追踪错误。
    2. 要手动追踪视频，请在右侧侧边栏中选择目标标记点，右键单击并选择 手动追踪，然后在逐帧显示的大鼠视频中开始追踪所选标记点。
    3. 若需修正错误，请跳转至发生追踪错误的帧，右键单击右侧侧边栏中对应的标记点标签，点击 删除点，然后在正确位置手动重新追踪该点。
  7. 使用上述方法，完成在连续步态周期帧范围内所有相机对所有目标标记点的二维追踪。
  8. 在整个追踪过程中，定期点击 保存。

6. 运动学分析

  1. 相位分配
    1. 右键单击 Phases，然后选择 编辑相位模型。
    2. 根据所选研究的缺陷，自定义每个肢体步态周期中的相位（例如，在步态周期的传统支撑相和摆动相内添加拖拽相、脚趾蜷缩相等）。为实验定义相位（图6）。
      注意：出于演示目的，此处显示了三个相位，并以左后肢作为参考肢体，分析7到10个步态周期。
    3. 右键单击相机组中的相机，然后选择 显示视频。
    4. 在软件中使用“添加相位”按钮或F11快捷键，为每个肢体的步态周期分配相位。
    5. 选择正在分析的相应肢体，并将跟踪的第一帧指定为 支撑相 的起始帧。
    6. 推进视频至支撑相结束、摆动相开始的帧，将此帧指定为 摆动相 的起始帧。
    7. 继续推进视频至足部开始下降的第一帧，将此帧指定为 中摆动相 的起始帧。
      注意：本文中，每个肢体步态周期的支撑相定义为肢体首次接触跑台表面的帧；摆动相定义为肢体离开跑台表面的第一帧；中摆动相定义为肢体达到最大 Clearance 并开始下降的帧。一个完整的步态周期从初始支撑相开始，至下一个步态周期的支撑相开始为止。
    8. 重复上述步骤，直至完成每一步中各肢体的相位分配。对其他三个肢体重复相同操作。
  2. 三维坐标计算
    1. 在完成全部六个相机的跟踪后，执行三维计算。
    2. 右键单击相机组，选择 新建三维计算，在相机选择中点击 全部，然后选择 确定。
      注意：此时将出现一个新文件夹，其中包含所有被跟踪标记点的三维坐标数据。如需查看和/或编辑相位，可在左侧边栏中右键单击 3D coordinates，然后选择 编辑相位（图7）。
    3. 通过将感兴趣的标记点拖出，与已分配的步态相位并排查看，生成感兴趣的数据，例如关节高度或速度图，并显示数据点（例如，图8 中的关节运动学数据）。
  3. 三维图
    1. 单击 3D diagram，生成该试验的三维图像。
  4. 通过右键单击 3D coordinates/Export 导出原始数据。
    1. 右键单击 3D coordinate file，然后选择 导出。
    2. 在电子表格软件中打开该文件，并将数据导入 MATLAB。
    3. 编写程序以生成肢体步高协调性的图表。
      注意：三维坐标数据可导出至分析软件或自定义宏脚本中，以生成超出软件功能范围的更多数据。

结果

本方案展示了一种利用简单内置软件对啮齿类动物在跑步机上运动时进行定量三维运动学数据采集与分析的方法。结果表明，该方案可用于采集和分析健康大鼠及脊髓损伤大鼠的四足运动运动学参数。具备大鼠操作经验的研究人员可顺利为大鼠贴附标记点，并完成运动捕捉系统的校准与使用，无任何关键技术难题。数据可直接生成，无需使用复杂算法。

本方案在健康大鼠和脊髓损伤（C5 右侧半切）大鼠中实施。为便于本文阐述，仅展示代表性结果。总体而言，通过各标记点的三维坐标可轻松获取关节和肢体节段运动的多种运动学参数。利用多种指标可轻易检测异常步态与正常步态周期之间的关键差异，这些指标包括（但不限于）步高测量值、关节速度、关节角度（图9）、四肢步态周期各时相持续时间以及肢体协调性（图10）。以图表和骨骼示意图形式呈现的定性数据分析，有助于确定用于本分析方法最终结果的定量工具（图11）。

在一只典型的健康大鼠中，肘关节角度曲线呈现出平滑的单峰形态，相邻步态周期一致，且表现出完整的运动范围（图9）。轨迹中交替出现的支撑相和摆动相持续时间表明同侧肢体协调性良好。相比之下，一只典型的脊髓损伤大鼠的肘关节角度曲线则表现出多个扭曲的峰形，峰形一致性较差，运动范围也较小。除了支撑相延长、摆动相缩短外，右前肢（RFL）还存在同侧肢体协调功能缺陷。

在所示的代表性协调性数据中，从健康大鼠获得的协调性图谱（图10）显示，在步态周期中同侧肢体表现出清晰的交替节律性协调（L形模式），而对侧肢体则呈现同相位的D形模式。相比之下，一只代表性的脊髓损伤（C5右侧半切）大鼠在同侧肢体中表现出较差的非交替、非节律性协调，而在一对对侧肢体组合中则出现异常的交替节律性协调（L形模式）（图10）。鉴于在记录的运动视频中可观察到右前肢功能缺陷，这表明在任何时刻，右前肢和左后肢均无法在没有左前肢或右后肢支撑的情况下完全承重。这一趋势提示存在一种代偿机制，以应对跑步机上强制行走速度带来的挑战。

利用3D系统可轻松生成可量化的数据，但该过程需要访问多个独立的标签页，并从软件提供的大量选项中进行选择。目前正在进行开发一种自动化模板，旨在将定量和定性数据自动生成一份综合报告，涵盖最显著的关注结果（无需单独生成各项结果），类似于临床研究中常规使用的运动学系统。因此，多个终点指标可被汇总并导出为报告格式，以便在试验结束后立即直观查看。

大鼠步态分析装置与跑步机；示意图显示了相机位置和关节标记点位置。
图1：实验装置示意图。（A）用于跑步机行走任务的六相机运动学数据采集系统的示意图。在跑步机两侧各放置一组三台相机，以逐帧捕捉运动过程中左右侧标记点的运动。（B）显示在啮齿类动物前肢和后肢的骨性标志上放置标记点的示意图，用于捕捉四足运动的运动学参数。每侧大鼠共放置11个标记点。阴影区域表示需要剃毛的部位。请点击此处查看此图的放大版本。

静态平衡装置与坐标轴；三维框架示意图；物理实验分析。
图2：用于校准的标记点。（A）使用两个校准框架（L形框架和探棒）的探棒校准系统的标记点分配。（B）L形框架定义了坐标系，其中L形框架的原点（框架两臂的交点）定义为（0,0）。L形框架的两个臂，即短臂和长臂，分别定义x轴和y轴，z轴则垂直于XY平面。 请点击此处查看该图的放大版本。

植入传感器的大鼠模型，突出显示跖趾关节和髂嵴。
图3：标记物类型。（A）大鼠下躯干的实物照片，显示所使用的两种标记物类型。（B）照片展示使用双面胶带将反光标记物固定在髂嵴上，该胶带设计用于粘附于皮肤表面（红色圆圈标示）。（C）照片展示在右侧跖趾关节上方放置笔式标记物（红色圆圈标示）。请点击此处查看该图的放大版本。

运动分析过程；模式匹配算法；追踪设置示意图
图4运动追踪 (A图像显示了运动追踪界面，可使用“自动追踪”和“基于模式匹配的追踪”功能同时追踪多个标记。B) 在标记点分配过程中，“自动追踪”功能会将反光标记点的放大视图识别为一个明亮的白色圆形斑点。软件将此斑点识别为亮蓝色圆形区域，最终红点被确定为规定标记点的中心。红色斑点位于圆形标记点中央时，可降低数据追踪过程中的实验误差；若红点偏离中心，则表明后续测量与分析结果可能不准确。（C）用于模式匹配的反光标记点的放大视图。根据所选标记点的大小、形状和颜色，软件会自动在后续视频帧中识别出符合该描述的标记点。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图像处理步骤：亮度、对比度、伽马值和反相效果对图像的影响示意图。
图5：基本与高级追踪选项。（A）在分析过程中，通过右键单击视频，可在软件内对视频进行处理，使模糊或不清晰的标记变得清晰可见，从而实现自动追踪。为演示目的，展示了两种图像处理设置，这些设置可根据数据采集期间不同的环境光照条件进行调整，以方便追踪。（B）图像处理前的一个代表性视频帧。（C）对于基本图像处理（处理类型I），调整亮度和对比度设置以获得更清晰的视野。（D）使用高级图像处理设置（处理类型II），可将右侧跖趾关节标记（黑色标记）反相，随后即可实现自动追踪。请点击此处查看该图的放大版本。

啮齿类动物运动中的步态分析阶段；示意图显示站立相和摆动相及标记点。
图6：时相划分。 根据实验设计，每个肢体的步态周期可划分为不同的时相。为便于说明，本图展示了三个步态周期时相。（A）站立相定义为肢体首次接触跑台表面的帧图像。（B）摆动相定义为肢体首次离开跑台表面的帧图像。（C）中段摆动相为肢体 Clearance 后 paw 开始下降的第一帧图像。（D）一个完整的步态周期定义为从初始站立相开始，至下一个步态周期的站立相开始为止。 请点击此处查看该图的放大版本。

步态分析示意图，包含标记点选择、坐标轴、相位选择及运动曲线。
图7：步态相位分析的高级选项。该选项可深入查看追踪结果与相位分配情况，并允许修改相位分配。（A）标记点选择框，用于查看并选择所需标记点。（B）坐标选择窗口：在主图窗口中高亮显示所选坐标（本例中为 z 坐标），将以红色呈现。（C）相位选择窗口：可查看某一肢体在（A）和（B）中选定的标记点与坐标下的相位分配情况，并可通过此窗口编辑相位。（D）图示窗口：可在单个步态周期的不同相位期间，同时比较特定标记点的坐标变化。绿色和黄色分别代表四足运动时右后肢的支撑相和摆动相。请点击此处查看该图的放大版本。

步态分析示意图；Z轴速度选择；相位结果比较；跑步机标记点数据。
图8：三维运动学数据示例。 （A）在视频追踪后，可从三维坐标数据集中以图示方式可视化各个关节标记点的多种结果。（B）大鼠四足行走过程中，前肢和后肢在支撑相与摆动相周期中的代表性数据。不同颜色表示连续步态周期中的支撑相和摆动相。红色和绿色分别对应右前肢和右后肢的支撑相，蓝色和青色分别对应左前肢和左后肢的支撑相，黄色对应各肢体的摆动相。（C）可轻松同时比较多组数据（离散标记点或结果）。此处任意选取左侧和右侧膝关节标记点的Z轴坐标速度数据，以展示膝关节标记点相对于跑步机表面的垂直速度。请点击此处查看该图的放大版本。

健康大鼠与脊髓损伤大鼠肘关节角度图，显示时间序列运动对比。
图9：健康大鼠与颈段脊髓损伤大鼠在跑台行走过程中典型的关节角度运动学数据。（A）健康代表性大鼠的肘关节角度曲线显示出平滑的单峰特征，关节角度轨迹在相邻步态周期中具有一致性，并表现出完整的运动范围。红色和黄色条带分别表示前肢步态周期中的支撑相和摆动相。（B）相比之下，代表性脊髓损伤大鼠的轨迹相对更扭曲，表现出不一致的多个峰，且关节运动总体范围较小。请点击此处查看该图的放大版本。

步态分析示意图，显示肢体协调性：健康与损伤状态下的步高比较。
图10：健康大鼠与颈段脊髓损伤大鼠在跑台行走过程中的代表性肢体协调数据。（A）前肢掌指关节（MCP）和后肢跖趾关节（MTP）标记点的Z轴坐标值被用于反映步高，在四足行走过程中约10个步态周期内，六个不同肢体组合的步态数据被绘制出来。图中展示了全部六种可能的肢体协调配对的代表性示例。（B）健康大鼠在所有配对（i, ii, iii, iv）中均表现出清晰的交替节律性协调（L形模式）；当肢体处于同相位时（v, vi），协调配对呈现D形模式。（C）在颈段脊髓损伤大鼠中，可见（i）双侧前肢间协调性差，（iii）右侧同侧肢体配对，以及（iv）某一交叉对侧肢体配对出现异常协调模式。请注意，协调性图谱（B, C）的刻度并不相同。请点击此处查看该图的放大版本。

用于生物力学研究的健康大鼠步态分析示意图及运动捕捉。
图11： 三维动画线框模型。由追踪数据生成的三维线框模型示例。请点击此处下载该图。  

校准参数校准输入
标定杆长度 [mm]100
L型框架地面偏移量 [mm]7
异常值检测迭代次数4
允许的标定杆长度偏差0.3
标定杆必须在至少 __ 个摄像机中可见4
固定长宽比已勾选
固定倾斜参数已勾选
固定主点已勾选

表1：校准的高级设置。 该表格总结了我们用于精确校准六相机系统的参数。这些设置经过实验测试，被证明对我们的系统配置最为优化。

讨论

本实验方案文章展示了利用运动追踪系统在啮齿类动物四肢跑步机运动过程中采集和分析三维运动学数据的方法。三维运动学分析系统的重要特性包括：可同时对多个关节和肢体进行关节运动的详细量化分析（步态时相运动学、关节角度、活动范围、步速），检测肉眼无法测量的运动功能障碍，消除数据采集与分析中的主观偏差，以及对整个肢体和姿势运动学进行直观可视化，可与运动中大鼠整体图像的同步并列比较。该方法无需额外的算法和建模，即可展示软件在步态运动学定量分析方面的高细节度、高效率、简便性、精确性和可重复性。

在啮齿类动物中，脊髓损伤（SCI）后的前肢和后肢运动功能障碍通常采用主观且标准化的运动功能评分系统进行评估，例如 BBB 评分系统1。由于不同研究人员可能对相同的运动功能障碍赋予不同的评分，或对不同的功能障碍给予相同的评分，主观评分系统通常会引入测试者偏倚，从而降低实验的可重复性和敏感性13。此外，无法检测细微功能缺陷的风险可能导致对干预措施效果的错误推断。

为应对这些问题，一些研究者已采用自动化系统2,3,4,5以及使用或不使用复杂算法的系统14,15。这些检测方法可进行步态周期分析，通过大鼠在跑道上行走时足部触地动作所形成的足迹，揭示负重分布特征及步序模式。然而，腹侧平面视频步态分析的一个主要缺点是无法直接观察受试动物的身体本身2,3。因此，所获取的数据仅限于足部印迹和足爪运动的信息，这使得在评估功能缺陷时对步态参数的选择与解释受到质疑（参见 Chen 等人16）。肢体运动和定位过程中反映动态节段性运动学的细节无法被准确获取，从而限制了运动功能分析的准确性3,5。关节角度数据的关键偏差（如活动范围、运动速度等）、同一肢体内部各关节之间以及不同肢体之间的相互关系，以及改变步态模式的潜在身体力学机制均无法获得。因此，任何可观察到的步态障碍是否继发于单个和/或多个节段性关节运动的改变（例如，肢体内部近端-远端协调性、躯干相对于肢体位置及步态周期的姿势关系等）仍无法明确。

目前可用的系统中，能够捕捉步态运动学特征并定性与定量评估运动功能障碍的系统较少，且应用范围较窄。一种全身高速视频追踪步态分析系统可从三个方向（一个腹侧和两个侧向平面）记录自发步态周期，并追踪骨性标志点，从而输出多项步态参数17,18。部分研究人员采用矢状面运动学步态分析方法，以获取目标后肢的二维运动数据19,20。然而，在此类分析中，发生在观察平面（侧向或矢状面）正交方向上的第三维度运动无法被检测到11,18,19。

其他更为复杂的三维三体段啮齿类动物身体姿势数据采集系统，采用三维数学建模方法进行数据采集与分析，以追踪并量化啮齿类动物体段在运动过程中的三维动作，同时包含头部运动模式8。Madete 等人9开发了一种基于标记点的光电运动捕捉系统，利用七相机系统来量化啮齿动物在行走横梁上进行地面行走时的三维身体姿势运动学参数。后两项研究的主要关注点集中在啮齿类动物的整体姿势，而非步态分析。正如 Bhimani 等人所综述21，三维运动捕捉系统可通过多台相机和复杂的软件系统，实现高通量的三维运动学步态数据采集。此前版本的三维运动分析系统已在具有或不具有神经损伤的大鼠研究中得到应用12,22,23。

尽管已有可用于研究的三维运动采集与分析系统，但该技术在啮齿类动物临床前研究中的应用仍相对有限。造成这一问题的部分原因在于，数据采集与分析流程高度依赖于构建运动学模型以及复杂的算法，这些算法需拟合大鼠行走时后肢的运动学模型，以生成精细、高分辨率的步态运动学数据8,9,11,22。本文所介绍的详细方法涵盖了整个实验过程中涉及的操作步骤，包括动物处理、训练、实验装置设置、数据采集以及分析流程。

此外还提供了系统校准的详细信息，这是该方案的基本组成部分，可确保同一受试者内部以及不同受试者之间相邻试验的可重复性。所描述的逐步操作技术使数据采集过程具有客观性，并极大提高了可重复性。该运动捕捉软件生成的数据可逐帧可视化，以评估动作质量，并实现自动追踪。文中进一步说明，此类数据采集或量化过程无需任何额外算法或建模。学生、工作人员和研究人员均可利用简单的统计软件生成基本的运动学输出结果，而无需依赖特定的技术专长。

该系统还可用于地面行走、伸手抓握以及其他可根据实验目标定制的实验设置。可根据需要调整尾部、背部、躯干或耳朵等部位的标记点数量和类型。与现有系统相比，本软件的一大优势在于能够采集受试对象的高分辨率视频数据。因此，可将复杂的计算结果（例如关节角度运动、连接多个关节的线条等）叠加到录制的视频上。通过大鼠实际运动情况，可以验证标记点的放置位置以及生成的三维数据。相比之下，其他三维运动捕捉系统仅能捕捉标记点，任何重新分析都必须基于骨骼示意图（即骨架结构）进行，而无法使用受试对象的实际视频。因此，难以根据受试对象的实际运动来验证标记点的放置准确性。

根据使用该系统的经验，校准在数据采集的成功中起着至关重要的作用。系统的校准对变化极为敏感，任意一台摄像机的轻微移动都可能破坏整个三维坐标数据的采集与分析过程。每个观察平面的两侧仅需两台摄像机即可进行数据采集，但强烈建议使用第三台摄像机，以便通过与其他摄像机交叉参考各标记点的位置来提高精度。随着追踪摄像机数量的增加，特定标记点的三维坐标准确性也会相应提高。在某些情况下，由于步态障碍（例如神经损伤后步态中出现的脚趾蜷曲或拖拽），标记点可能被遮挡，此时可能需要大量手动追踪。然而，最终从追踪中生成的数据量足以证明手动追踪所投入时间的价值，使其成为检测细微运动功能障碍的宝贵工具。

根据我们的经验，使用该系统相关的繁琐之处并不存在于设备和技术本身的使用过程中。与其他运动行为评估方案类似，大鼠在实验任务中的抓取和训练方式会显著影响实验结果。例如，在测试期间将大鼠与其同伴隔离至关重要；否则，那些未接受测试但在测试现场存在的大鼠最终会出现任务表现下降的情况。适宜的室温、光照和噪声水平也是影响结果的重要因素。Fouad 等人曾发表过关于大鼠功能性运动测试中其他挑战的相关研究24。事实上，本实验室中遵循正确方法的盲法操作人员在数据采集、运动追踪和数据分析过程中均未遇到任何重大障碍。

本文介绍了一种三维运动捕捉系统，可有效采集和分析运动数据，使研究人员能够快速从多只大鼠中获取大量深入的运动学数据。目前，我们正在开发一种自动化数据分析模板，该模板可集成到软件中，能够在数秒内生成关于啮齿类动物跑台运动的预设结果报告，类似于在人类研究中使用运动捕捉与分析系统所实现的功能6,25。该模板的开发将使临床前研究人员仅需点击几下鼠标，即可便捷地获得详细的啮齿类动物运动数据。希望本文所提供的方法能够帮助临床前研究人员更客观地评估啮齿类动物的运动行为。目前，我们正在优化该系统的应用，以在常见的复杂前肢行为（如伸手和抓握）过程中采集高通量的三维运动学数据。重要的是，该方法的应用范围可进一步拓展至患有多种神经创伤性和非神经创伤性损伤的大鼠模型。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们特别感谢 Pawan Sharma 在本视频实验装置搭建以及本项目中的智力贡献方面所提供的帮助。我们还感谢 Christopher Palacio 在视频实验方案演示过程中给予的协助与贡献。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6 摄像头 Basler（Scout scA640-120gu）运动捕捉系统。Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, GermanyN/A用于运动分析的记录设备。
校准框架和校准棒Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, GermanyN/AL 形校准装置用于定义全局坐标系，三叉形校准棒（100 mm）。
标记点Shah LabN/A用于运动分析的记录设备。标记点由本实验室自制，采用直径 0.5 cm 的活动眼珠并覆盖反光胶带制成。
MatlabMathworks, Inc, Natic, CaN/A数据分析软件
啮齿类动物笼具Stony Brook 内部定制。N/A透明有机玻璃笼具，用于将啮齿类动物固定在跑步机上。
Simi Reality Motion SystemsSimi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, GermanyN/A三维追踪软件。
跑步机Mk Automation Inc., Bloomfield, CT 06002N/A用于啮齿类动物运动的跑步机。

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啮齿类动物运动运动捕捉系统跑步机行走标记点放置系统校准数据追踪三维数据分析步态周期时相神经创伤研究
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