简易自制工具处理果蝇——Drosophila melanogaster

摘要

本文介绍了几种自制工具的使用方法，用于转移、冷却和杀死成虫 果蝇，以及清洁玻璃培养管和收集卵。这些工具易于制作，在操作中效率较高 果蝇

摘要

果蝇（Drosophila melanogaster）在生物学研究和生物学教育中被广泛应用。在实际操作中，成年果蝇的处理虽常见但较为困难，因为成年果蝇具有飞行能力。本文演示了如何制作一些简单且成本低廉的工具，以解决Drosophila操作中的难题。通过在泡沫塞上打孔，并将移液器吸头或漏斗插入孔中，可使果蝇仅单向移动进入移液器吸头/漏斗组件，从而高效控制成年Drosophila转入或转出培养瓶的过程。现有低温麻醉果蝇的方案已进行改进：将果蝇置于碎冰中冷却，随后转移至冰冷坚硬的冰袋表面。冰袋表面覆盖一层医用纱布，可在体视显微镜下观察时防止被麻醉的果蝇接触冷凝水。最后，果蝇可通过微波处理进行安乐死，以便计数和分选，或直接丢弃。此外，还开发了一种瓶状饲养笼用于收集卵，以及一种节省劳力的装置及配套方案，用于清洗玻璃培养瓶。

引言

果蝇， 黑腹果蝇， 是一种在生物研究和生物学教育中广泛使用的模式生物，用于研究多种主题^1,2处理的基本问题 果蝇 将成虫从一个样品管转移到另一个样品管，以及固定果蝇以使其更易于操作，因为所有成虫（除某些突变体外）^3,4）能够飞行。

传统上，研究人员通过将两个培养瓶口对口对接来转移果蝇，轻敲使果蝇落入或让果蝇飞入另一个培养瓶，然后分离两个培养瓶并重新塞上瓶塞⁴。显然，这种方法要求两个培养瓶的口径必须相同，且难以控制转移的果蝇数量。同时，操作需要迅速，否则逃逸的果蝇可能给实验室或课堂带来问题。Drosophila 实验中另一项常规操作是向已准备好的杂交培养瓶中添加额外的处女蝇或雄蝇。传统方法要求在添加额外果蝇之前，必须先将杂交瓶中的果蝇进行麻醉固定。

成年个体 果蝇 通常使用乙醚、CO麻醉₂，或冷处理⁵与乙醚和CO相比₂ 暴露后，冷处理是固定成虫最经济有效的方法 果蝇 对果蝇和研究人员（尤其是年轻学生）的伤害最小^6,7然而，持续在冷表面或冷室上凝结的水会润湿果蝇。润湿的果蝇难以准确观察其表型，且在操作过程中容易受损。^8,9这使得该冷却方法难以被更广泛地接受。

果蝇转移工具及果蝇冷却方法此前已有描述¹⁰。本文报道了一种改良的冷麻醉技术，该技术安全、可靠，适用于黑腹果蝇（Drosophila）实验。本文还描述了：1）用于杀死成虫以进行计数、分选或丢弃的方法；2）节省人力的玻璃培养瓶清洗装置与操作流程；3）一种简单的收卵笼具。文中所述工具设计简便、成本低廉，可用于解决果蝇操作中的难点问题。这些方法经过验证，对有经验的研究人员和初学者而言均具有稳健性、可靠性且易于操作。

方案

1. 准备工具和配件

1. 吸头/漏斗塞
   1. 准备两个海绵塞（海绵塞的直径必须略大于用于转移果蝇的小瓶的内径）。使用加热的电烙铁在海绵塞中心打孔。
   2. 取两个1 mL移液器吸头，用锋利的刀片横向将其中一个切成两半，并丢弃尖端部分；然后从第二个移液器吸头上切下1.5 cm长的尖端部分。使用通用胶水将两个吸头的剩余部分粘合在一起，制成一个延长的移液器吸头（图1A）。
   3. 将漏斗和延长的移液器吸头插入海绵塞中，制成吸头塞和漏斗塞（下文分别简称为T-塞和F-塞），并用100 μL微量离心管盖住移液器吸头末端（图1A）。
      注意： 漏斗茎部的长度必须大于海绵塞的高度。如果其长度小于或等于海绵塞的高度，则果蝇会从茎部开口逃逸。漏斗茎末端应至少高于培养基表面或空瓶底部2 cm。优选小型漏斗（例如，圆盘直径 <60 mm），且其内部茎部开口直径较小（<5 mm）。可使用玻璃或塑料漏斗制作F-塞。然而，在生物学课程中建议使用塑料漏斗，因其比玻璃漏斗更不易破碎。
2. 显微解剖针
   1. 准备握持舒适的手动铅笔，以及与其铅芯直径相匹配的昆虫针（例如，0.5 mm、0.7 mm）。
   2. 使用钳子剪去昆虫针的宽端，并将切口处打磨平整。用昆虫针替换铅笔中的铅芯（图1B）。按下按钮，推出0.5–1 cm长的针头以进行解剖操作。解剖完成后，清洁针头并将其完全推回铅笔杆内，以确保安全操作。
      注意： 显微解剖针不仅适用于幼虫唾液腺等器官的解剖，也适用于计数和分类已死亡的成虫果蝇。
3. 硬质冰盒
   1. 准备多个可重复冷冻的硬质冰盒（建议使用大尺寸冰盒）。图1C展示了一个效果良好的冰盒，尺寸为26.5 cm × 14.5 cm × 2.5 cm，上下表面完全平整。
   2. 将医用纱布（非无菌）裁剪成略小于冰盒冷表面的尺寸。例如，略小于26.5 cm × 14.5 cm的纱布片更适合覆盖如图1C所示的冰盒。
      注意： 这些冷却工具所需的辅助配件包括：一个冰盒（我们为单人使用25 cm × 15 cm × 15 cm的泡沫箱，多人使用37 cm × 28 cm × 20 cm的箱子），用于储存碎冰；一对尖头镊子，用于夹取冷却后的果蝇翅膀并将其转移至小瓶中；一副防护工作手套，用于从-20 °C冰箱中取出冷却的冰盒；以及塑料薄膜，用于覆盖体视显微镜的载物台。
4. 果蝇产卵收集笼
   注意： 市售的Drosophila产卵收集笼可从多家生物技术公司获得¹¹。此处描述的是适用于60 mm培养皿的小型亚克力瓶状产卵收集笼（图1D左侧；中间为笼子设计图）。该设计可适配其他尺寸的培养皿（例如100 mm、35 mm），便于果蝇轻松进出。简易收集笼的制备方法如下：
   1. 使用旋切刀将一个软质塑料饮料瓶（500 mL，内径约65 mm）按约2:1的比例（尖端：钝端）切割，并丢弃钝端部分。
   2. 用胶带将一条卡纸缠绕在苹果汁碟（内径60 mm）周围［该苹果汁碟用于收集卵（图1E，右侧）］。
5. 无线试管刷驱动器
   1. 准备一个无线电钻（最大转速 = 500 rpm）。
   2. 准备一个侧面和前端均有刷毛的试管刷。理想情况下，刷子的直径应略大于需要清洗的培养管的直径。剪去刷柄末端，使其可插入电钻夹头中（图1D）。
      注意： 这些清洁工具所需的辅助配件包括不锈钢海绵和长袖橡胶手套。

2. 将成年果蝇从A瓶转移至B瓶

注意： 将成年果蝇从一个试管转移到另一个试管是实验中最常见的操作 果蝇 实验（例如将果蝇从旧培养管（A）转移到新鲜培养管（B），或从杂交小管（A）转移到空管（B））中的麻醉操作。此处描述的方案适用于所有成年果蝇的转移操作。除非另有说明，本文中均采用该方案将果蝇从A管转移至B管。

1. 仔细检查 F 型塞的漏斗管部和 T 型塞的移液管尖端，然后用橡胶吹气球清除残留在塞子中的果蝇。此步骤至关重要，尤其是在使用同一套 T 型和 F 型塞连续转移不同 Drosophila 品系时。
2. 轻敲试剂瓶 A 以使果蝇沉降至底部，取下瓶塞并换上 T 型塞，同时用 F 型塞塞住试剂瓶 B。
3. 将试剂瓶 A 倒置在试剂瓶 B 上方，将 T 型塞的移液管尖端插入 F 型塞的漏斗开口中，轻敲倒置的试剂瓶 A 边缘，使果蝇从移液管尖端滑出，经漏斗管部落入试剂瓶 B 中。若试剂瓶 A 中残留的旧培养基变得松散，在倒置并敲击时可能掉落。若发生此情况，可将试剂瓶 B 倒置于试剂瓶 A 上方，使果蝇自行爬入试剂瓶 B。
4. 将 T 型塞与 F 型塞分离。若需立即将试剂瓶 A 中剩余的果蝇转移至其他试剂瓶，请用一个 200 μL 微离心管盖住 T 型塞的移液管尖端；否则，取下 T 型塞并重新塞上试剂瓶 A 的原瓶塞。随后取下 F 型塞并重新塞上试剂瓶 B 的瓶塞。

3. 通过低温使果蝇固定

1. 使用前，将可重复冷冻的硬质冰袋置于 -20 °C 冰箱中至少 24 小时。
2. 将一个已预冷的硬质冰袋在室温（RT）下放置 20 分钟。用少量流动水略微润湿一块非无菌医用纱布，使其紧贴冰袋表面。该医用纱布可在下次冷冻果蝇时重复使用。同时，将一个空离心管置于碎冰中预冷。
3. 将需要固定的成年果蝇转移至已预冷的空离心管（CEV）中。当两个转移用离心管分离后，立即用培养皿或塞子盖住 CEV，并将 CEV 在碎冰上轻敲数次，使所有果蝇沉降至管底。重复此操作数次，直至所有果蝇均被固定。果蝇通常在 30 秒内被固定。随后，将 CEV 放入碎冰中静置 1 分钟。不建议一次性转移过多果蝇进行麻醉处理。
4. 将已冷却的果蝇倒在覆盖于冰袋表面的医用纱布上。用画笔将重叠的果蝇摊开，确保每只果蝇均能接触到冰袋的冷表面而持续冷却。若预冷的硬质冰袋轻微膨胀，可将其放置于毛巾上，并在其较平整的一面进行操作。
5. 取下体视显微镜的载物台夹具，用一层塑料薄膜覆盖载物台，然后将冰袋放置于其上。打开顶部光源（建议使用冷光源），调节体视显微镜焦距，并移动冰袋位置，直至能清晰观察到已冷却的果蝇。

4. 处死成年果蝇以进行计数、分选或丢弃

1. 将成年果蝇转移至一个空的试剂瓶中，并用培养皿盖住瓶口。
2. 将试剂瓶倒置，在微波炉中加热1分20秒，使死亡的果蝇落入培养皿中。
3. 戴上防护手套，从微波炉中取出试剂瓶。将死亡的果蝇倒在白色纸卡上，在体视显微镜下用显微解剖针进行计数或观察，观察完毕后将果蝇尸体丢入垃圾桶。
4. 如需杀死不需要的果蝇，可在微波炉中加热2–3分钟，然后轻敲使尸体落入垃圾桶。
   注意：不建议通过加热杀死某些翅突变品系（例如翅长突变体）进行观察，因为从尸体上难以判断其翅是否延伸至腹部末端之外，而这一特征在野生型果蝇中可见。

5. 将果蝇转移进出瓶状卵收集笼

注意：如上所述，T型和F型塞子用于将果蝇转移进和移出卵收集笼。此过程无需麻醉果蝇。其他细节，例如制备苹果汁培养基、卵的收集以及去壳处理，可参见相关文献¹²。

1. 将产卵收集笼插入苹果汁培养基平板中，或将苹果汁培养基平板安装到由饮料瓶制成的笼子上。用一条石蜡膜密封两个部件之间的连接处。
2. 尽可能多地将果蝇放入笼中，在转移果蝇后用泡沫塞重新封住笼口。
3. 如需更换笼中果蝇的食物，先将笼内的果蝇转移到一个空的试剂管中。
4. 更换新的苹果汁培养基平板并重新密封，然后将试剂管中的果蝇重新转移回笼中。
5. 当产卵收集结束后，将果蝇转移到一个空的试剂管中，再将其转移至培养管中。

6. 清洗玻璃培养瓶

注意：通常情况下，旧的培养管中仍含有活体果蝇。在本方案中，除非是转基因果蝇，否则这些果蝇在清洗前无需处死。

1. 使用沾水的不锈钢海绵擦除玻璃培养瓶上的永久性记号笔墨迹。
2. 将培养瓶浸泡在流动水中。
   1. 在实验水槽中注满水，加入液体洗洁精并混合均匀。
   2. 将培养瓶浸入水中，然后取下瓶塞，使水流入瓶内。水中的洗洁精会使残留的成虫沉入水底并溺亡。
   3. 将旧的培养瓶在水中至少浸泡 30 分钟。
3. 松开电钻的夹头，插入试管刷，然后重新拧紧夹头。检查旋转方向选择开关，确保电钻顺时针旋转。调节速度开关，确保最高转速低于 500 rpm。
4. 清洗培养瓶。
   1. 初步清洗培养瓶。
      1. 在非惯用手戴上长袖橡胶手套，将培养瓶置于水中握住。
      2. 用裸露的惯用手握住无线试管刷驱动器，将刷头挤入培养瓶内，并扣动开关。
         注意：切勿将电池部分浸入水中。旋转的刷头会打碎残留的食物、蛹等物质，清除超过 95% 的废弃物。
      3. 将废弃物倒入专用垃圾桶中。重复此操作，直至每个培养瓶中的大部分废弃物被清除。
   2. 彻底清洗培养瓶。
      1. 清洗试管刷，排空并清洁水槽，重新注入清水。
      2. 按照第 6.4.1 节所述方法，清除每个培养瓶中残留的废弃物。

结果

T型塞和F型塞是一组简单工具，可被调整并用于任何果蝇转移操作中。将果蝇从旧培养管转移到多个新鲜培养管时，需先取下新鲜管的塞子，换上F型塞；然后轻敲旧管使果蝇落入管底，迅速取下旧管的塞子并换上T型塞。如果旧培养基较为紧密，则应将旧管倒置，将T型塞的尖端插入F型塞的开口中，再轻敲使果蝇落入新鲜管内。随后，取下T型塞和F型塞，并重新为各管塞上原塞。如果旧培养基变得松散，则建议将新鲜管倒置，将F型塞与T型塞对接，让果蝇自行爬入新鲜管中。

若需向已准备好的杂交管中添加额外的果蝇，首先应轻敲杂交管使果蝇沉降至管底，并将管塞更换为F型塞子。随后，实验者需在体视显微镜下检查经冷藏麻醉的果蝇，使用尖头镊子夹住目标果蝇的翅膀，将其通过漏斗茎部滑入杂交管中。若果蝇卡在漏斗茎部，建议使用吹气球轻轻吹气，使其滑入管内。当收集到足够数量的果蝇用于杂交后，需更换F型塞子并将杂交管重新塞好。T型和F型塞子于2010年被引入实验操作¹³<...

讨论

本文介绍了一些用于处理果蝇（Drosophila）饲养和实验基本操作的自制工具。这些工具结构简单但非常有效。几乎所有实验室都可以轻松制作这些工具，因此科研或教学实验室无需寻找可能在当地无法获得的现成替代品。

果蝇转移是最常见的操作，也是极具挑战性的任务 果蝇 实验。遗憾的是，迄今为止，尚未有文献描述过相关的转移工具^3,4,12,17 此处介绍了T型和F型塞子。这些简单的工具使果蝇转移更加便捷且易于控制，转移过程中逃逸的果蝇更少，近年来遗传学课程中几乎未发现逸出的果蝇即为此提供了证据。由于海绵塞具有弹性，因此无需试管开口具有完全相同的内径。此外，移液器吸头开口一次仅允许一只果蝇通过，因此T型塞子可防止果蝇大量涌入试管中，实验者可轻松中止操作并精确控制转移的果蝇数量。T型塞子还可防止旧培养基落入新...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
一把钳子
无线电钻			最大转速：500 rpm
电烙铁
锉刀
漏斗			圆盘直径<60 mm
冰盒
昆虫针
红外测温仪			HCIYET HT-830
长袖橡胶手套
自动铅笔
医用纱布
微量离心管			100 µl
微波炉
封口膜（Parafilm）
培养皿			内径 60 mm
移液器吸头			1 ml
塑料薄膜
塑料培养皿			Φ36 mm，用于覆盖空瓶
尖头镊子
防护工作手套
可重复冷冻的硬质冰袋			26.5×14.5×2.5 cm 或更大
橡胶吹气球
压接钳
饮料瓶			500 ml，内径约 65 mm
海绵塞
不锈钢清洁球
试管刷
小玻璃瓶			Φ34 mm × 90 mm