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基于受激拉曼散射的非线性显微镜的实现

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DOI：

10.3791/59614

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2019年7月6日

 ,  ,  , 
1National Research Council, Institute for Microelectronics and Microsystems, Naples Unit, Italy

本文内容

摘要

本文描述了一种通过将受激拉曼散射（SRS）实验装置与激光扫描显微镜集成而实现的受激拉曼散射显微镜。该SRS显微镜基于两束飞秒（fs）激光光源，分别为钛宝石（Ti:Sa）激光器和同步的光学参量振荡器（OPO）。

摘要

受激拉曼散射（SRS）显微术采用近红外激发光，因此具备许多多光子显微成像的特性。通过为商用激光扫描显微镜配备带有合适带通滤光片的非共焦前向探测器以及锁相放大器（LIA）检测系统，即可实现SRS成像模式。典型的SRS显微镜系统示意图包括以下组成部分：两束脉冲激光（即泵浦光和探测光），需在空间和时间上于成像平面完全重叠，随后经由两个扫描镜（SMs）引导，通过显微物镜聚焦进入样品，并在x-y平面内逐点扫描焦斑。激光与样品相互作用后，透射的输出脉冲由上方的物镜收集，并通过插入倒置显微镜中的前向探测系统进行测量。泵浦光脉冲被一组光学滤光片滤除，而由样品焦区发生的SRS过程所产生的探测光脉冲则由光电二极管（PD）检测。PD的输出信号通过LIA解调，以提取调制深度。通过将前向探测单元与显微镜扫描单元同步，即可获得二维（2D）图像。本文详细描述并成功实现了SRS显微镜的构建，同时报道了对直径为3 µm的聚苯乙烯微球进行无标记成像的结果。值得注意的是，目前SRS显微镜尚无商业产品，因此若要利用此类技术特性，自行搭建是唯一选择。鉴于SRS显微技术正日益广泛应用于多个研究领域，本文对SRS显微镜构建过程的细致描述有望为科学界提供重要参考。

引言

在生命科学应用中，受激拉曼散射（SRS）显微技术已成为一种强大的无标记成像工具。SRS显微技术的基本原理是结合振动对比度的优势及其能够在数秒内获取图像的能力。

受激拉曼散射（SRS）是一种非线性光谱过程，当两束激光（泵浦光和斯托克斯光，频率不同）之间的频率差与被测样品的分子振动频率相匹配时，会引发受激拉曼散射，导致斯托克斯信号显著增强。与线性拉曼光谱不同，SRS 对入射光场具有非线性依赖性，并产生相干辐射。SRS 具有两个基本优势：1）速度快，使成像对样品移动或降解引起的伪影不敏感；2）具有优异的信噪比（SNR）。此外，SRS 的光谱与自发拉曼光谱完全相同，且 SRS 信号强度与被激发化学键的浓度呈线性正比关系1,2,3,4,5。

在我们的显微镜系统中，飞秒（fs）受激拉曼散射（SRS）实验装置集成于一台倒置光学显微镜，该显微镜配备有快速振镜扫描单元（图1）6,7,8。该显微镜采用两束脉冲激光源实现。第一束为飞秒钛宝石激光器（fs-Ti:Sa），脉冲持续时间约为140 fs，重复频率为80 MHz，发射波长范围为680–1080 nm。第二束作为探测光束，由Ti:Sa激光器泵浦，为一台飞秒同步光学参量振荡器（SOPO），其脉冲持续时间约为200 fs，重复频率为80 MHz，发射波长范围为1000–1600 nm。需要注意的是，Ti:Sa与SOPO两束光之间的最小光子能量差为2500 cm-1。因此，使用该组合激光系统仅能探测拉曼光谱中的高频C-H区域（2800–3200 cm-1）6,7,8。

为了搭建一台 SRS 显微镜，需要考虑三个关键问题，这些问题将在接下来的段落中逐一说明。第一个问题是高频调制转移方法的实现（详见图2及实验方案的第2.1步）。在 SRS 实验研究中，一个关键参数是系统的灵敏度。 SRS 信号表现为激发光束强度的微小变化，因此容易受到激光强度噪声和散粒噪声的干扰。通过将系统与高频调制转移方法相结合，可以克服这一问题（详见图2及实验方案第2.1步的详细说明）。该方法中，使用电光调制器（EOM）对泵浦光进行调制，调制信号会转移至探测光束，随后在用一组光学滤光片阻断泵浦光后，由光电探测器（PD）检测该信号［即受激拉曼增益（SRG）检测模式］。PD 的输出信号经低通滤波器连接至锁相放大器（LIA），由后者对测量信号进行解调。通过将光束的调制频率提高至1 MHz以上，可达到PD的本征性能极限。

需要考虑的第二个问题是安装一个机械支架，该支架能够实现前向检测，同时保持明场显微镜观察。此外，它还应减少成像过程中因机械振动引起的噪声，并允许检测系统进行精确定位（参见图3和实验方案的步骤2.2）。

第三是将相敏检测方案获取的信号与显微镜扫描头监控下聚焦于样品上的光束进行同步。为了实现成像，扫描显微镜（SMs）需要三个由连接至扫描头单元的显微镜控制器提供的TTL信号：像素时钟、行同步和帧同步。该同步通过使用PCI卡控制这三个TTL信号以及锁相放大器（LIA）输出通道的电压信号采集来实现6,7,8。相关同步系统的硬件结构如图4所示，而所用的自研软件此前已有描述6,7,8。

进行受激拉曼散射（SRS）成像时的一个基本步骤是显微镜的光路校准。该过程分为四个步骤，将在后续段落中逐一描述。第一步是实现两束激光在空间上的重叠（参见实验方案的第3.1步）。在本实验装置中，两束光通过二向色镜实现空间共线合束。初步步骤是校准OPO和Ti:Sa激光器，使二者均能进入显微镜系统。随后，以OPO光束作为参考光，利用位置敏感探测器对Ti:Sa光束进行空间调整，使其与OPO光束精确重叠。

第二个关键方面是两束光在时间上的重叠（见实验方案步骤3.2）。即使泵浦光和OPO光束已实现完美同步9，但由于它们在OPO腔内经过的光路略有不同，因此在OPO输出端会产生约5 ns的时间延迟和5 cm的空间偏移。因此，需要对Ti:Sa激光和OPO激光进行光学重定时，以确保在样品处实现时间上的重叠。这通常通过一个可精细调节的光学延迟线来实现，本实验中该延迟线被插入在Ti:Sa激光器与显微镜之间（见图1）。为实现两束光的时间重叠，采用两种技术。第一种方法使用快速光电探测器（PD）和示波器，第二种方法则基于自相关和互相关光学测量。利用第一种方法可获得两束光的粗略时间重叠（不确定度为10 ps），而利用互相关仪可实现精确的时间重叠（分辨率达1 fs）。

第三个关键方面是显微镜内两束光的准直（参见实验方案的步骤3.3）。通过初步的白光观察样品，可以确定所需的视野（FOV）。随后，激光束通过显微镜的侧端口进入，并进行准直，使其到达安装在上部的光电探测器（PD）（图3）。然而，为了正确地进行图像采集，需要设置多个参数（例如像素尺寸和像素驻留时间）。采样频率必须满足奈奎斯特定理所规定的约束条件，以确保保留图像中的全部信息；同时，为了实现像素空间坐标与每个像素测得的受激拉曼散射（SRS）值之间的准确对应，锁相放大器（LIA）的积分时间应等于或接近像素驻留时间。

在显微镜校准的最后一步中，需进行多项测试以优化空间和时间上的对准（参见实验方案的步骤3.4）。为了优化两束光（Ti:Sa和OPO）的空间重叠，需采集多幅透射图像（TI）。在透射图像中，使用单束光照射样品，并通过光电探测器（PD）测量透射光的强度。当OPO产生TI时，PD的输出信号直接连接至PCI卡；而当Ti:Sa产生TI时，PD的输出信号则连接至锁相放大器（LIA），LIA的模拟输出再连接至PCI卡。透射图像对于优化视场（FOV）、照明条件、显微物镜的焦平面位置，以及验证两束光是否实现空间重叠具有重要作用6,7,8。

通过以0.001 mm的步长扫描延迟线（对应3.3 fs的时间偏移），并在直径为3 µm的聚苯乙烯微球样品的单一点位上进行受激拉曼散射（SRS）测量，可实现泵浦光与探测光在时间上的最佳重叠。锁相放大器（LIA）测得的SRS信号幅度随探测光与泵浦光之间的延迟变化而变化，其最大值对应于两束光精确的时间重合6,7,8。需要指出的是，在最终确定前，上述所有步骤均为获得高质量图像所必需。

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方案

1. 启动激光系统

  1. 检查冷却器的温度是否维持在 20 °C 或更低。
  2. 检查湿度控制单元是否正常工作，且湿度是否维持在约 40%。
  3. 严格按照说明书中的指示打开钛宝石激光器（Ti:Sa 激光器）。
  4. 将波长设置为 810 nm。
  5. 打开 OPO 及其连接的微型计算机，运行控制 OPO 激光器的应用程序。
  6. 若需要在 OPO 模块出口处获得 100% 的 Ti:Sa 激光输出，请选择 旁路（bypass） 模式。
  7. 若需要在 OPO 模块出口处获得 20% 的 Ti:Sa 激光输出以及 OPO 激光输出，请取消选择 旁路（bypass） 模式。
  8. 打开 Ti:Sa 激光器的快门，将 Ti:Sa 激光束导入 OPO 输入端。
  9. 通过点击 signal-out 和 pump-out，释放 OPO 输出端的两束激光。
  10. 等待 Ti:Sa 激光器和 OPO 激光器均稳定（约需 45–60 分钟）。
  11. 使用纸基探测卡检查 OPO 模块出口处 Ti:Sa 和 OPO 激光束的光斑，并使用功率计检测其功率。
  12. 将 OPO 激光器的波长调至 1076 nm。
  13. 将每束激光的功率降低至约 10 mW，以进行光路准直调整。

2. 显微镜的设置

  1. 高频调制传递方法的实施
    1. 对调制器进行光路准直，确保钛宝石（Ti:Sa）激光束进入和出射时无任何畸变。
    2. 打开函数发生器，生成一个TTL信号（幅值为5 V、偏移为2.5 V、频率为5 MHz的方波）。
    3. 使用T型接头将TTL信号分为两路，一路连接电光调制器（EOM），另一路连接锁相放大器（LIA）（见图2）。
    4. 使用示波器检查所有信号电平。
    5. 打开锁相放大器（LIA），并将信号发生器的输出通道连接至LIA的参考输入通道。
    6. 将信号发生器的输出通道连接至EOM的高压功率放大器。
    7. 开启放大器，并将电压调至接近最大值。监测EOM出口处的光束功率。
  2. 集成机械安装装置以固定光电探测器（PD）并实现x和y方向的相对运动
    注：在显微镜系统中引入一个外部安装装置，该装置配备有可在x和y方向进行运动控制的千分尺。
    1. 安装两个可移动的平移台，以实现沿x和y方向的运动（见图3）。
    2. 将平移台固定在适当高度的Ø1.5"支架上。
    3. 将光电探测器（PD）安装到外部安装装置上。
    4. 通过调节安装装置上的千分尺来调整PD的位置（x和y坐标），使PD处的光束功率达到最大 （见图3）。

3. 显微镜的校准

  1. 光束的空间重叠
    注意：以OPO光束为参考，并利用位置敏感探测器，应按照以下步骤将Ti:Sa光束与OPO光束重叠：
    1. 调整OPO和Ti:Sa激光光束，使两者均能到达显微镜。
    2. 将激光光束位置传感器探测器放置在二向色镜1与镜6之间的两个位置，第一个位置靠近二向色镜1，第二个位置靠近镜6。对于每个位置，使用传感器检测OPO光束的x和y坐标（参见图1）。
    3. 验证Ti:Sa激光光束在两个传感器位置处的x和y坐标与OPO光束相同。如果在某些位置Ti:Sa与OPO的坐标不一致，则调节相邻镜片的倾斜角度以补偿差异（参见图1）。
    4. 按照相同程序，对M6-M7路径中的Ti:Sa光束位置相对于OPO进行对准 （参见图1）。
  2. 光束的时间同步
    1. 使用快速光电二极管加示波器：
      1. 停止Ti:Sa和OPO光束的传播，并在OPO光束前方（M6与M7之间）放置一个快速探测器。
      2. 将Ti:Sa激光器箱体提供的触发信号连接至示波器的通道2。
      3. 将探测器电缆连接至示波器的通道1，并观察OPO的时间轮廓。
      4. 记录示波器测得的对应其最大值的时间（横坐标），即t1。
      5. 停止OPO光束，释放Ti:Sa光束。
      6. 观察Ti:Sa的时间轮廓，并记录对应其最大值的时间（横坐标），即t2。
      7. 使用延迟线最小化t1与t2之间的差值，以实现两束光的重叠。在本实验中，可测量的最小差值为10 ps。
      8. 移除M6与M7之间的快速探测器。
    2. 使用自相关仪：
      注意：如图1所示的示意图中，自相关仪的安装不会干扰光束的光路。此外，在M6与M7之间引入并安装了一个附加镜片于翻转支架上（称为FFM/AM），用于将光束导入自相关仪。
      1. 翻转AM，将光束导入自相关仪。
      2. 停止Ti:Sa光束，释放OPO光束。
      3. 将自相关仪的光束距离调节螺钉微调器设置为正常位置（8.35 mm）。
      4. 开启自相关仪控制器电源，并启动个人计算机上控制该设备的软件应用程序。
      5. 将来自FFM/AM的OPO光束投射到自相关仪的输入镜上。
      6. 使用纸制探测卡控制光束在自相关仪对准窗口上的反射光斑位置。
      7. 若无光束或光强较弱，应尽可能优化FFM/AM的位置和取向，并尝试调节安装在自相关仪上的输入镜，以最大化激光脉冲信号。获得的自相关仪信号如图5a所示。
      8. 停止OPO光束，将来自FFM/AM的Ti:Sa光束投射到自相关仪的输入镜上 。重复步骤3.2.2.6和3.2.2.7。获得的自相关仪信号如图5b所示。
      9. 将光束距离调节螺钉微调器设置为交叉位置（7.30 mm）。
      10. 释放两束光。
      11. 扫描延迟线，使OPO和Ti:Sa两束光重叠。获得的互相关信号如图6所示。
      12. 翻转镜片FFM/AM，使光束能够到达M7和显微镜的扫描头。
  3. 显微镜对准
    1. 执行白光显微观察：
      注意：在进行显微观察之前，确保显微镜已正确对准。
      1. 准备测试样品，该样品由磷酸盐缓冲液组成，其中分散有直径为3 μm的聚苯乙烯微球。将溶液置于两片玻璃载玻片之间形成夹层结构。
      2. 打开显微镜及白光电源。按照手册说明进行白光下的观察。
      3. 使用聚光镜照射样品，采用60倍物镜收集光信号。将样品放置于载物台上，优化60倍显微物镜的焦平面位置。
      4. 选择感兴趣的视场（FOV），拍摄样品的CCD图像（图7）。
      5. 关闭白光电源。
    2. 使用飞秒激光光束对准显微镜：OPO与Ti:Sa
      1. 使用escape按钮移除聚光镜，暂时缩回60倍显微物镜。通过旋转物镜转盘，将60倍显微物镜移出光路。
      2. 使用外部机械支架将探测器安装在显微镜上部。将探测器输出通过50Ω低通滤波器连接至示波器，并监测OPO信号。
      3. 开启控制扫描头的处理器。将OPO光束投射入显微镜的扫描头。
      4. 检查光束在显微镜内部的位置，确保其位于中心或接近中心。
      5. 检查光束在PD头部内的位置是否居中。
      6. 使用x-y平移台最大化探测器测得的功率。
      7. 将光束从OPO切换至Ti:Sa，并验证钛蓝宝石激光器也能获得最大信号。这表明两束光均已良好对准。
      8. 完成光束对准后，将60倍显微物镜重新引入光路，并旋转物镜转盘复位。
      9. 使用显微镜上的refocus 按钮重新获得60倍显微物镜的最终焦平面。
      10. 将40倍放大倍率的物镜替换为聚光镜，操作时不得触碰或扰动样品。
  4. 光束空间与时间同步的优化
    1. 时间同步
      1. 将进入显微镜前测得的Ti:Sa和OPO光束功率均设置为30 mW。将OPO的波长设置为与之前不同的值，以确保泵浦光与探测光不与微球的振动频率共振。
      2. 释放两束光（Ti:Sa和OPO），使其进入显微镜。
      3. 运行扫描延迟线的计算机化平移台，并记录锁相放大器（LIA）在延迟线每个位置测得的强度。等待延迟线扫描完成。获得的时间轮廓如图8a所示。
      4. 再次将OPO波长设置为1076 nm，使泵浦光与探测光与微球的振动频率共振。重复步骤3.4.1.3（获得的时间轮廓如图8b所示）。
      5. 将延迟线中获得的光束重叠位置设定为SRS成像的采集位置。
    2. 光束的空间同步
      注意：透射图像有助于优化视场（FOV）、照明条件和显微物镜的焦平面位置，并可用于检查两束光是否在空间上重叠。
      1. OPO透射图像采集
        1. 停止Ti:Sa光束，将OPO功率降低至8 mW。
        2. 将探测器读出端连接至数据采集卡。
        3. 运行数据采集程序以及显微镜扫描控制台。
        4. 保存文件并处理数据以获得图像。原始图像如图9a所示。
      2. Ti:Sa透射图像采集
        1. 停止OPO光束，将Ti:Sa功率降低至2.5–4.5 mW。
        2. 将探测器与锁相放大器（LIA）连接，并将LIA输出端连接至数据采集卡。
        3. 重复步骤3.4.2.1.3和3.4.2.1.4。原始图像如图9b所示。

4. SRS图像采集

注意：已开发专用算法用于存储数据。该算法支持以下图像格式：512 像素 × 512 像素和 256 像素 × 256 像素，采集时间分别为 16 秒、8 秒、4 秒和 2 秒。

  1. 在40倍物镜和PD之间插入一组滤光片，以滤除泵浦脉冲（Ti:Sa），仅采集斯托克斯信号（OPO）。
  2. 将泵浦光信号设置为810 nm，聚焦功率为8 mW，探测光信号设置为1076 nm，聚焦功率为8 mW，用于研究聚苯乙烯中典型的C-H键（拉曼位移为3054 cm−1）。
  3. 将探测器与锁相放大器（LIA）及LIA读出端连接至数据采集卡。
  4. 根据需要设置图像采集的像素格式，并设定采集时间。
  5. 运行控制显微镜控制器的程序。
  6. 运行专用的算法程序，实现显微镜控制器、探测系统与数据采集系统（DAQ）之间的同步（见图4）。
  7. 采集完成后保存矩阵文件。
  8. 使用ImageJ软件导入原始数据文件，并以所需格式（通常保存为.tif格式）保存图像。图像如图10所示。

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结果

单点样本的受激拉曼散射（SRS）测量示例如图7所示。当两束光在时间和空间上未重叠时，测量结果如图8a所示。在非共振条件下，锁相放大器（LIA）测得的信号幅度为零，而LIA测得的信号相位在负值与正值之间跳变。而当光束在空间上重叠时，通过在适当范围内移动延迟线，所得结果如图8b所示。当光束在时间上完全重叠时，LIA测得的信号强度增加并达到最大值，同时相位在光束时间重叠期间逐渐趋于一个固定值。

使用单束激光（Ti:Sa 或 OPO）获得的相同聚苯乙烯微球的吸收图像如图9a,b所示，比例尺为 6 µm。为了获取受激拉曼散射（SRS）图像，将延迟线设置为图7b中所确定的位置，典型的受激拉曼增益（SRG）图像如图10所示，比例尺为 6 µm。

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讨论

受激拉曼散射（SRS）显微技术已将无标记成像提升到新的高度，尤其在研究脂质等复杂生物结构方面具有重要意义，因为脂质是细胞及其结构的基础组分。脂质参与多种生理通路，例如生物膜的形成，并可作为生物合成前体和信号转导分子10。脂质被包裹在特化的细胞内细胞器中，这类结构也被称为脂滴（LDs）。其直径范围从几十纳米到数微米不等11,12。脂滴不仅在脂肪生成和类固醇生成细胞中广泛存在，也在其他细胞系中出现。脂滴参与多种生理过程，如脂质储存，并在多种常见病理过程中发挥显著作用（例如胆固醇代谢异常）13,14。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢来自意大利国家研究委员会分子医学研究所（IMM CNR）的 V. Tufano 提供宝贵的技术支持，以及来自尼康仪器公司的产品专家 Giacomo Cozzi 提供的有益讨论和持续支持。本工作部分得到了意大利国家操作计划项目 PONa3 00025（BIOforIU）以及欧洲生物成像大型泛欧洲研究基础设施项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
采集工具NikonNikon C2Tool支持采集的工具
APE Pulse link 控制软件APE-APE Pulse link 控制软件软件控制
自相关仪APEAPE PulseCheck USB 50自相关仪
探测器ThorlabsThorlabs DET10A光电二极管
探测器卡ThorlabsThorlabs VRC红外探测器卡
二向色镜SemrockSemrock FF875-Di01-25X36二向色镜
二向色镜SemrockFF875-Di01-25x36二向色镜
EOMConoptics(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P)普克尔斯盒
快速探测器ThorlabsThorlabs DET025AL/M光电二极管
快速镜扫描单元NikonC2显微镜扫描头
飞秒激光器 Ti:SACoherentCoherent Chameleon Ultra IIChameleon Ultra II
函数发生器TTiTG5011 AIM – TTi函数发生器
倒置光学显微镜NikonEclipse TE-2000-E, NikonEclipse TE-2000-E, Nikon
锁相放大器Standford Research SystemSR844-200 MHz 双相位斯坦福研究系统公司的锁相放大器
陷波滤光片SemrockNF03-808E-25陷波滤光片
光学延迟线NewportNewport M-ILS200CC可调谐光学延迟线
光学参量振荡器CoherentCoherent Compact OPOCoherent Compact OPO
示波器WaveRunner640Zi 4GHz OSC/LeCroy数字示波器
PCI 卡National instrumentNI PCIe 6363数据采集卡
位置传感器探测器NewportNewport Conex PSD9位置探测传感器
功率计探头CoherentPowerMax PM10激光功率探测器
平移台ThorlabsThorlabs PT1/M带标准千分尺的机械平移台

参考文献

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