Method Article

基于刺激拉曼散射的非线性显微镜的实现

DOI:

10.3791/59614

⸱

July 6th, 2019

 ,  ,  , 
1National Research Council, Institute for Microelectronics and Microsystems, Naples Unit, Italy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这份手稿中,描述了通过SRS实验设置与激光扫描显微镜集成而获得的刺激拉曼散射(SRS)显微镜的实现。SRS 显微镜基于两个飞秒 (fs) 激光源,一个 Ti-Sa (Ti:Sa) 和同步光学参数振荡器 (OPO)。

Abstract

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刺激拉曼散射(SRS)显微镜使用近红外激发光;因此,它具有许多多光子显微成像特性。SRS 成像模式可以通过配备带适当的带通滤波器和锁定放大器 (LIA) 检测方案的非扫描正向检测器,使用商业激光扫描显微镜获得。典型的 SRS 显微镜的示意图布局包括:两个脉冲激光束(即扫描显微镜中的泵和探头),必须在图像平面的空间和时间上重叠,然后通过显微镜目标聚焦到通过两个扫描镜(SMs)对样品进行光栅,从而在x-y平面上栅格焦点。与样品相互作用后,通过上部目标收集传输的输出脉冲,并通过插入倒置显微镜的正向检测系统进行测量。泵脉冲由一堆光学滤波器去除,而样品焦量中发生的 SRS 过程产生的探头脉冲则由光电二极管 (PD) 测量。PD 的读出由 LIA 解调为调制深度。通过将正向检测单元与显微镜扫描单元同步,获得二维(2D)图像。本文介绍了SRS显微镜的实现并成功地演示了SRS显微镜的实现,并报告了直径为3μm的聚苯乙烯珠子的无标签图像。值得注意的是,SRS显微镜没有商业上,所以为了利用这些特点,自制结构是唯一的选择。由于SRS显微镜在许多领域越来越受欢迎,相信SRS显微镜实现的这种仔细的描述对科学界非常有用。

Introduction

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在生命科学应用中,SRS 显微镜已成为无标签成像的强大工具。SRS 显微镜的基本理念是结合振动对比度的强度和在几秒钟内获取图像的能力。

SRS 是两个激光束频率(泵信号和不同频率的斯托克斯信号)与被调查样品的分子振动相匹配的过程,导致刺激拉曼散射和显著的斯托克斯信号的增加。与线性拉曼光谱不同,SRS 表现出对进入光场的非线性依赖,并产生相干辐射。SRS 具有两个基本优势:1) 速度,使图像对样品移动或退化产生的伪影的敏感度降低;2) 出色的信噪比 (SNR)。此外,SRS的光谱与自发拉曼相同,SRS 信号与激发 1、2、3、4 的化学键浓度成线性成正比。 5.

在我们的显微镜中,一个飞秒(fs)SRS实验装置与一个倒置光学显微镜集成,配有快速镜扫描单元(图1)6,7,8。<....

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Protocol

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1. 启动激光系统

  1. 检查冷水机组的温度是否保持在20°C以下。
  2. 检查湿度控制单元是否正常工作,湿度保持在 40% 左右。
  3. 打开 Ti:Sa 激光,严格按照手册中的说明操作。
  4. 将波长设置为 810 nm。
  5. 打开 OPO 和连接的微型计算机。运行控制 OPO 激光的应用程序。
  6. 如果 OPO 盒出口处需要 100% 的 Ti:Sa 激光输出,请选择旁路。
  7. 如果 OPO 盒出口处需要 20% 的 Ti:Sa 激光输出和 OPO 激光输出,则取消选择旁路。
  8. 打开Ti:Sa 的快门,将 Ti:Sa 光束释放到 OPO 输入。
  9. 通过单击信号出和泵出,在 OPO 出口释放两个激光束。
  10. 等待两个激光 Ti:Sa 和 OPO 稳定(约 45-60 分钟)。
  11. 使用纸检测卡验证 Ti:Sa 和 OPO OPO 在 OPO 箱出口的光束点,并使用功率计检查电源。
  12. 将 OPO 激光波长调整到 1076 nm。
  13. 将每束激光束的功率降低到 ±10 mW,以便进行对准。

2. ....

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Results

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图7中报告了SRS测量(即样品单点中的SRS测量)的例子。当梁在时间或空间上没有重叠时,所得结果如图8a中报告。在离谐振中,LIA测量的信号振幅为零,而LIA测量的信号相位在负值和正值之间跳跃。而当光束在太空中重叠,在适当的范围内移动延迟线时,所得结果在图8b中报告。当光束在时间上完全重叠时,LIA 测量的信号增加并达到最大值,而相位在光束在时间重叠时开始达到固定值。

使用同一聚苯乙烯珠子的单光束(Ti:Sa或OPO)获得的吸收图像在图9a,b中表示,刻度条为6μm。为了获取 SRS 图像,延迟线设置为图 7b中实现的位置,图 10显示了典型的 SRG 图像,比例条为 6 μm。

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Discussion

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SRS显微镜将无标签成像带到了新的高度,特别是在复杂的生物结构(如脂质)的研究中,而脂质是细胞和细胞结构的基础。脂质参与多种生理途径,如生物膜的产生,它们作为生物合成前体和信号传感器10。脂质被包装成专门的细胞内细胞器,也称为脂液滴(LDs)。它们的直径从几十纳米到几十微米11,12不等。LD 不仅大量参与脂肪和类固醇生成细胞,而且存在于其他细胞系中。LD在多种生理过程中合作,如脂质储存。它们在常见病理(例如,胆固醇代谢改变)13、14 中占据显著位置。

传统上,脂质的可视化是使用荧光显微镜和中性脂质特异性染料标记固定细胞10。应该指出的是,由于脂质比蛋白质和DNA更小,在添加荧光脂15,16时,可能会出现结构和功能变化和不需要的伪影。

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Disclosures

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提交人声明没有利益冲突。

Acknowledgements

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我们感谢IMM CNR的V.Tufano提供的宝贵技术支持,并感谢尼康仪器产品专家贾科莫·科齐(Giacomo Cozzi)提供有益的讨论和持续的支持。这项工作得到了意大利国家运营方案PONa3 00025(BIOforIU)和欧洲生物成像大型泛欧研究基础设施项目的部分支持。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
采集工具尼康尼康 C2Tool采集支持工具
APE 脉冲链路控制软件APE-APE脉冲链路控制软件软件控制
自相关器APEAPE PulseCheck USB 50自相关
探测器ThorlabsThorlabs DET10A光电二极管
探测器卡ThorlabsThorlabs VRC红外探测器卡
二向色镜SemrockFF875-Di01-25X36二向色镜
二向色镜SemrockFF875-Di01-25x36二向色镜
EOMConoptics（EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P）。普克尔斯电池片
快速探测器Thorlabs Thorlabs DET025AL/M光电二极管
快速镜面扫描单元尼康C2Microscpe 扫描头
飞秒激光器 Ti：SA相干相干 变色龙 Ultra II色龙 Ultra II
函数发生器TTiTG5011 AIM –TTi函数发生器
倒置光学显微镜尼康Eclipse TE-2000-E， 尼康Eclipse TE-2000-E， 尼康
锁相放大器斯坦福研究系统SR844-200 MHz双相A锁相放大器 斯坦福研究系统
公司陷波滤波器，SemrockNF03-808E-25陷波滤波器
延迟线纽波特纽波特M-ILS200CC可调谐光延迟线
光学参量振荡器相干相干紧凑型 OPO相干紧凑型 OPO
示波器WaveRunner640Zi 4GHz OSC/LeCroy数字示波器
PCI 卡国家仪器NI PCIe 6363数据采集卡
位置传感器 探测器Newport Newport Conex PSD9位置检测器传感器
功率计头CoherentPowerMax PM10，激光功率探测器
平移台ThorlabsThorlabs PT1/M带标准千分尺的机械平移台
变 光学

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  2. Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissu....

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Stimulated Raman ScatteringNonlinear MicroscopyLaser AlignmentLock in AmplifierForward DetectionBeam OverlapLabel free ImagingPolystyrene BeadsVibrational ContrastMicroscope Implementation

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