Method Article

基于刺激拉曼散射的非线性显微镜的实现

DOI:

10.3791/59614

⸱

July 6th, 2019

 ,  ,  , 
1National Research Council, Institute for Microelectronics and Microsystems, Naples Unit, Italy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这份手稿中,描述了通过SRS实验设置与激光扫描显微镜集成而获得的刺激拉曼散射(SRS)显微镜的实现。SRS 显微镜基于两个飞秒 (fs) 激光源,一个 Ti-Sa (Ti:Sa) 和同步光学参数振荡器 (OPO)。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

刺激拉曼散射(SRS)显微镜使用近红外激发光;因此,它具有许多多光子显微成像特性。SRS 成像模式可以通过配备带适当的带通滤波器和锁定放大器 (LIA) 检测方案的非扫描正向检测器,使用商业激光扫描显微镜获得。典型的 SRS 显微镜的示意图布局包括:两个脉冲激光束(即扫描显微镜中的泵和探头),必须在图像平面的空间和时间上重叠,然后通过显微镜目标聚焦到通过两个扫描镜(SMs)对样品进行光栅,从而在x-y平面上栅格焦点。与样品相互作用后,通过上部目标收集传输的输出脉冲,并通过插入倒置显微镜的正向检测系统进行测量。泵脉冲由一堆光学滤波器去除,而样品焦量中发生的 SRS 过程产生的探头脉冲则由光电二极管 (PD) 测量。PD 的读出由 LIA 解调为调制深度。通过将正向检测单元与显微镜扫描单元同步,获得二维(2D)图像。本文介绍了SRS显微镜的实现并成功地演示了SRS显微镜的实现,并报告了直径为3μm的聚苯乙烯珠子的无标签图像。值得注意的是,SRS显微镜没有商业上,所以为了利用这些特点,自制结构是唯一的选择。由于SRS显微镜在许多领域越来越受欢迎,相信SRS显微镜实现的这种仔细的描述对科学界非常有用。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在生命科学应用中,SRS 显微镜已成为无标签成像的强大工具。SRS 显微镜的基本理念是结合振动对比度的强度和在几秒钟内获取图像的能力。

SRS 是两个激光束频率(泵信号和不同频率的斯托克斯信号)与被调查样品的分子振动相匹配的过程,导致刺激拉曼散射和显著的斯托克斯信号的增加。与线性拉曼光谱不同,SRS 表现出对进入光场的非线性依赖,并产生相干辐射。SRS 具有两个基本优势:1) 速度,使图像对样品移动或退化产生的伪影的敏感度降低;2) 出色的信噪比 (SNR)。此外,SRS的光谱与自发拉曼相同,SRS 信号与激发 1、2、3、4 的化学键浓度成线性成正比。 5.

在我们的显微镜中,一个飞秒(fs)SRS实验装置与一个倒置光学显微镜集成,配有快速镜扫描单元(图1)6,7,8。使用两个脉冲激光源来实现此显微镜。第一种是fs-Ti:Sa,脉冲持续时间约为140 fs,重复率为80 MHz,发射波长范围为680-1080 nm。第二种,用作探针束,由Ti:Sa泵送,是一个飞秒同步光学参数振荡器(SOPO),脉冲持续时间约为200fs,重复率为80 MHz,发射波长范围为1000-1600nm。需要注意的是,Ti:Sa 和 SOPO 光束之间的最小光子能量差为 2500cm-1。因此,使用这种激光系统的组合,只有拉曼光谱的高频C-H区域(2800-3200厘米-1)可以探索6,7,8。

为了设置 SRS 显微镜,需要考虑三个关键问题,这些问题在后续段落中介绍。第一种是高频调制传输方法的实现(有关描述,请参阅协议图 2和步骤 2.1)。在SRS实验研究中,一个关键参数是系统的灵敏度。SRS 信号被检测为激励光束强度的微小变化;因此,它可以通过激光强度噪声和拍摄噪声损坏。通过将该系统与高频调制传输方法集成,可以解决此问题(有关详细信息,请参阅协议图 2和步骤 2.1)。在此方法中,使用光电调制器 (EOM) 来调制泵。在用一堆光学滤波器阻挡泵束后,PD 可以检测到传输到探头光束的调制[刺激拉曼增益(SRG)检测模式]。PD 输出通过低通滤波器连接到锁定放大器 (LIA),该放大器可解调测量信号。通过将光束的调制频率提高到1MHz以上,可以得到PD的内在限制。

要考虑的第二个问题是安装一个机械安装,允许进行前向检测,同时在明场保持显微镜观察。此外,它还必须降低图像生成过程中机械振动引起的噪声,并允许检测系统的精确重新定位(参见协议图 3和步骤 2.2)。

第三是相位敏感检测方案获取的信号的同步,光束被放置在显微镜扫描头监测的样品上。为了实现图像,SM 需要三个 TTL 信号,这些信号由连接到扫描头单元的显微镜控制器提供:像素时钟、线路同步和帧同步。同步是通过使用PCI卡、三个TTL信号以及LIA6、7、8的输出通道的电压信号采集来实现的。一个自制的软件已经开发和描述之前6,7,8,而同步系统的硬件报告在图4。

进行 SRS 成像的一个基本步骤是显微镜对准。它通过四个步骤实现,在后续段落中进行了描述。第一个是两个光束的空间重叠(参见协议的步骤3.1)。在这个实验设置中,两束在空间上由二色镜组合而成。初步步骤是 OPO 和 Ti:Sa 的对齐,以便每个步骤都到达显微镜。然后,将 OPO 视为参考光束,并利用位置敏感检测器,Ti:Sa 在空间上与 OPO 重叠。

第二个关键方面是两个光束的时间重叠(参见协议的步骤3.2)。即使泵和OPO光束完全同步9,因为它们遵循OPO外壳内的光束路径略有不同,在OPO出口时,它们的时间延迟约为5 ns,空间差为5厘米。因此,Ti:Sa 和 OPO 需要以光学方式重新定时,以确保样品的时间重叠。这通常通过精细可调的光延时线完成,在这种情况下,该线位于 Ti:Sa 和显微镜之间(参见图 1)。为了获得两束的时态重叠,使用了两种技术。第一种是使用快速PD和示波器进行的,第二个是基于自动和交叉光学相关性。使用第一种技术,获得两个光束的粗略重叠(不确定度为10 ps),而使用交叉相关器(分辨率为1 fs)获得两个光束的精确时间重叠。

第三个关键方面是显微镜内两个光束的对齐(参见协议步骤3.3)。对样品进行初步的白光观测,可以个性化所需的视场 (FOV)。之后,激光束通过显微镜的侧端口进入显微镜,对齐,以到达安装在上部的PD(图3)。但是,要获得正确的图像,需要设置多个参数(例如,像素尺寸和像素放置时间)。采样频率必须尊重奈奎斯特定理施加的约束,以便保留图像中的所有信息,而要在像素的空间坐标和在每个像素中测量的 SRS 值之间保持正确的对应关系,则积分时间的 LIA 应等于或与像素的均衡时间相当。

在显微镜对准的最后一步中,进行了大量测试以优化空间和时间对齐(参见协议步骤 3.4)。为了获得 Ti:Sa 和 OPO 的多个传输图像 (TI),以优化空间重叠。在 TI 中,使用单个光束,并通过 PD 测量来自样品的透射光束强度。在 OPO 实现的 TI 的情况下,PD 输出信号直接连接到 PCI 卡,而在 Ti:Sa 实现的 TI 中,PD 输出信号连接到 LIA,LIA 的模拟输出连接到 PCI 卡。传输图像对于优化FOV、照明、显微镜目标的焦距以及检查两束在空间上是否重叠6、7、8非常有用。

通过扫描与 3.3 fs 时移对应的 0.001 mm 的延迟线,并在直径为 3 μm 的聚苯乙烯珠样品的单点进行 SRS 测量,可以优化泵和探针梁的时间重叠。SRS信号的振幅测量LIA的值,作为探针泵延迟的函数,并提供与两束6、7、8的精确时间重叠对应的最大值。在结束发言之前,应当指出,所有讨论的步骤都是为了获得高质量图像而必须的。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 启动激光系统

  1. 检查冷水机组的温度是否保持在20°C以下。
  2. 检查湿度控制单元是否正常工作,湿度保持在 40% 左右。
  3. 打开 Ti:Sa 激光,严格按照手册中的说明操作。
  4. 将波长设置为 810 nm。
  5. 打开 OPO 和连接的微型计算机。运行控制 OPO 激光的应用程序。
  6. 如果 OPO 盒出口处需要 100% 的 Ti:Sa 激光输出,请选择旁路。
  7. 如果 OPO 盒出口处需要 20% 的 Ti:Sa 激光输出和 OPO 激光输出,则取消选择旁路。
  8. 打开Ti:Sa 的快门,将 Ti:Sa 光束释放到 OPO 输入。
  9. 通过单击信号出和泵出,在 OPO 出口释放两个激光束。
  10. 等待两个激光 Ti:Sa 和 OPO 稳定(约 45-60 分钟)。
  11. 使用纸检测卡验证 Ti:Sa 和 OPO OPO 在 OPO 箱出口的光束点,并使用功率计检查电源。
  12. 将 OPO 激光波长调整到 1076 nm。
  13. 将每束激光束的功率降低到 ±10 mW,以便进行对准。

2. 设置显微镜

  1. 高频调制传输方法的实现
    1. 执行调制器的光学对准程序,使 Ti:Sa 光束进入和退出而不会产生任何失真。
    2. 打开功能发生器并生成 TTL 信号(振幅 = 5 V 的方波,偏移 = 2.5 V,频率 = 5 MHz)。
    3. 使用 T 接线将 TTL 信号分为两部分;一个用于 EOM,另一个用于锁定放大器 (LIA)(参见图 2)。
    4. 使用示波器检查所有信号电平。
    5. 打开 LIA 并将发电机输出通道连接到 LIA 的参考通道。
    6. 将发电机输出通道连接到 EOM 的高压功率放大器。
    7. 打开放大器,将电压设置为几乎最大电平。监控 EOM 出口处的光束功率。
  2. 集成机械安装以修复 PD 并分配 x 和 y 相对运动
    注:使用显微镜,引入外部安装,配备具有 x 和 y 方向运动控制的千分尺。
    1. 安装两个行驶平移阶段,允许沿 x 和 y 方向移动(参见图 3)。
    2. 将舞台固定在适当高度的 ±1.5" 柱上。
    3. 将 PD 安装到外部安装件上。
    4. 最大化 PD 处的光束功率,使用连接到支座的微米调整 PD 位置(x 和 y 坐标)(参见图 3)。

3. 显微镜对准

  1. 光束的空间重叠
    注:考虑到OPO光束作为参考,并利用位置敏感检测器,Ti:Sa应按照以下程序与OPO重叠:
    1. 对齐 OPO 和 Ti:Sa 激光束,以便它们都到达显微镜。
    2. 将激光束位置传感器探测器放置在双色镜 1 和后视镜 6 之间的两个位置,第一个位置靠近二色镜 1,第二个位置靠近镜 6。对于每个位置,使用传感器检测 OPO 光束的 x 和 y 坐标(请参见图 1)。
    3. 验证 Ti:Sa 激光束的 x 和 y 坐标在传感器探测器的两个位置是否相同。如果在某些位置的 Ti:Sa 和 OPO 的坐标不重合,请调整相邻镜像的倾斜以补偿差值(如图1所示)。
    4. 按照相同的步骤,将 M6-M7 之间路径的 Ti:Sa 光束位置与 OPO 对齐(请参见图 1)。
  2. 光束的时态同步
    1. 使用快速光电二极管加示波器:
      1. 停止 Ti:Sa 和 OPO 光束的传播,并在 OPO 光束前面放置一个快速探测器(位于 M6 和 M7 之间)。
      2. 将 Ti:Sa 激光盒提供的触发信号与通道 2 中的示波器连接。
      3. 将探测器电缆与通道 1 中的示波器连接,并可视化 OPO 时态轮廓。
      4. 记录示波器测量的时间(abscissa),其对应于其最大值,即t1。
      5. 停止 OPO 光束并释放 Ti:Sa 光束。
      6. 可视化 Ti:Sa 时态剖面图并记录与其最大值(t2)对应的时间(abscissa)。
      7. 使用延迟线将两条梁重叠,将 t1-t2 之间的差异降至最低。在我们的例子中,最小可测量的差值是 10 ps。
      8. 拆下 M6 和 M7 之间的快速探测器。
    2. 使用自动腐蚀器:
      注:在图1所示的原理图中,安装自动腐蚀器时不会干扰光束的光学路径。此外,在 M6 和 M7 之间的触发器安装(称为 FFM/AM)上引入并安装一个附加的后视镜,以将光束分流到自动腐蚀器中。
      1. 翻转 AM 以将光束定向到自动腐蚀器中。
      2. 停止 Ti:Sa 并释放 OPO。
      3. 将自动腐蚀器的光束距离调节螺钉千分尺设置为正常位置(8.35 mm)。
      4. 打开自动腐蚀器控制器电源,并在控制它的个人计算机上启动软件应用程序。
      5. 将 OPO 光束从实况调查/AM 投影到输入镜像到自动关联器中。
      6. 控制自动腐蚀器校准窗口中光束的反射点(使用纸张检测卡)。
      7. 在无束或低光束强度的情况下,将 FFM/AM 的位置和方向调整到最佳程度,并尝试调整输入镜(安装在自动腐蚀器上),以最大化激光脉冲信号。自动腐蚀器信号得到,如图5a所示。
      8. 停止从 FFM/AM 向自动腐蚀器输入镜像的 Ti:Sa 光束的 OPO 和项目。重复步骤 3.2.2.6 和 3.2.2.7。自动腐蚀器信号得到,如图5b所示。
      9. 将光束距离调整螺钉千分尺设置为交叉位置(7.30 mm)。
      10. 释放两个光束。
      11. 扫描延迟线以获得两个梁 OPO 和 Ti:Sa 重叠。获得交叉相关信号,如图6所示。
      12. 翻转镜面,使光束能够到达 M7 并扫描显微镜的头部。
  3. 显微镜对准
    1. 执行白光显微镜观察:
      注:在进行微观观察之前,确保显微镜正确对齐。
      1. 准备测试样品,该样品由磷酸盐缓冲液组成,其中分散直径为 3 μm 的聚苯乙烯珠子。溶液被放置在两个玻璃滑梯的三明治内。
      2. 打开白光的显微镜和电源。按照手册在白光下观察。
      3. 使用冷凝器照亮样品。使用 60x 的目标来收集光。将样品放在舞台上。优化 60x 显微镜物镜的焦距位置。
      4. 选择感兴趣的 FOV。以样品的CCD图像为例(图7)。
      5. 关闭白灯电源。
    2. 显微镜与飞秒激光束的对齐:OPO 和 Ti:Sa
      1. 使用转出按钮拆下冷凝器,以暂时缩回 60x 显微镜物镜。将 60x 显微镜物镜移离光学路径,旋转鼻塞。
      2. 使用外部机械安装将探测器安装到显微镜的上部。通过 50Ω 的低通滤波器将探测器输出连接到示波器并监控 OPO 信号。
      3. 打开控制扫描仪头的处理器。将 OPO 光束投影到显微镜的扫描仪头。
      4. 检查光束在显微镜内的位置,确保光束的位置位于中心或靠近中心。
      5. 检查 PD 头部内的梁位置是否位于中心。
      6. 使用 x-y 转换器最大化探测器测量的功率。
      7. 将光束从 OPO 切换到 Ti:Sa,并验证是否也获得了钛蓝宝石激光的最大信号。THis 表示两个光束都对齐良好。
      8. 完成光束对齐,引入 60x 显微镜物镜并旋转鼻塞。
      9. 使用显微镜上的重新聚焦按钮,重新确定对焦到 60x 显微镜物镜。
      10. 将放大倍数为 40 倍的物镜放在冷凝器的位置,而不会接触或干扰样品。
  4. 光束空间和时间同步的优化
    1. 时态同步
      1. 将显微镜前测量的 Ti:Sa 和 OPO 功率设置为 30 mW, 以用于两个光束。将 OPO 的波长设置为与前一个波长不同的值,以便泵和探头不与磁珠的振动频率产生共振。
      2. 释放两束光束(Ti:Sa 和 OPO),以便它们进入显微镜。
      3. 运行扫描延迟线计算机化转换器,并记录LIA对延迟线每个位置的测量强度。等待延迟线路扫描完成。获得的时间轮廓如图8a所示。
      4. 再次将 OPO 的波长设置为 1076 nm,以便泵和探头与珠子的振动频率产生共振。重复步骤 3.4.1.3 (获得的时间轮廓如图8b所示 )。
      5. 在延迟线中设置获取的重叠光束位置以获取 SRS 图像。
    2. 光束的空间同步
      注:传输图像可用于优化显微镜目标的 FOV、照明和焦距位置,以及检查两个光束在空间上是否重叠。
      1. OPO的传输图像采集
        1. 停止 Ti:Sa 光束,并将 OPO 功率降至 8 mW。
        2. 将探测器读出连接到数据采集卡。
        3. 与显微镜扫描控制台一起运行数据采集程序。
        4. 保存文件并处理数据以获取图像。原始图像如图9a所示。
      2. Ti:Sa 的传输图像采集
        1. 停止 OPO 光束,将 Ti:Sa 功率降至 2.5~4.5 mW。
        2. 使用数据采集卡连接具有 LIA 和 LIA 读出器的探测器。
        3. 重复步骤 3.4.2.1.3 和 3.4.2.1.4。原始图像如图9b所示。

4. SRS 图像采集

注: 已实现专用算法以存储数据。它支持以下图像格式:512 px x 512 px 和 256 px x 256 px,采集时间为 16 s、8 s、4 s 和 2 s。

  1. 在 40x 目标和 PD 之间引入一堆滤波器,以移除泵脉冲 (Ti:Sa) 并仅获取斯托克斯信号 (OPO)。
  2. 将泵信号设置为 810 nm,聚焦功率为 8 mW,探头信号设置为 1076 nm,聚焦功率为 8 mW,以调查聚苯乙烯的典型 C-H 键(拉曼移位为 3054 cm+1)。
  3. 将探测器与 LIA 和 LIA 读出连接到数据采集卡。
  4. 根据需要设置图像采集像素格式并设置采集时间。
  5. 运行控制显微镜控制器的程序。
  6. 运行充当显微镜控制器、检测系统和 DAQ 之间同步的专用算法程序(参见图 4)。
  7. 采集完成后保存矩阵文件。
  8. 使用 ImageJ 软件导入原始数据文件,以所需的格式保存图像(通常以 .tif 格式保存)。图10显示了该图。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

图7中报告了SRS测量(即样品单点中的SRS测量)的例子。当梁在时间或空间上没有重叠时,所得结果如图8a中报告。在离谐振中,LIA测量的信号振幅为零,而LIA测量的信号相位在负值和正值之间跳跃。而当光束在太空中重叠,在适当的范围内移动延迟线时,所得结果在图8b中报告。当光束在时间上完全重叠时,LIA 测量的信号增加并达到最大值,而相位在光束在时间重叠时开始达到固定值。

使用同一聚苯乙烯珠子的单光束(Ti:Sa或OPO)获得的吸收图像在图9a,b中表示,刻度条为6μm。为了获取 SRS 图像,延迟线设置为图 7b中实现的位置,图 10显示了典型的 SRG 图像,比例条为 6 μm。

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SRS显微镜将无标签成像带到了新的高度,特别是在复杂的生物结构(如脂质)的研究中,而脂质是细胞和细胞结构的基础。脂质参与多种生理途径,如生物膜的产生,它们作为生物合成前体和信号传感器10。脂质被包装成专门的细胞内细胞器,也称为脂液滴(LDs)。它们的直径从几十纳米到几十微米11,12不等。LD 不仅大量参与脂肪和类固醇生成细胞,而且存在于其他细胞系中。LD在多种生理过程中合作,如脂质储存。它们在常见病理(例如,胆固醇代谢改变)13、14 中占据显著位置。

传统上,脂质的可视化是使用荧光显微镜和中性脂质特异性染料标记固定细胞10。应该指出的是,由于脂质比蛋白质和DNA更小,在添加荧光脂15,16时,可能会出现结构和功能变化和不需要的伪影。

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提交人声明没有利益冲突。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢IMM CNR的V.Tufano提供的宝贵技术支持,并感谢尼康仪器产品专家贾科莫·科齐(Giacomo Cozzi)提供有益的讨论和持续的支持。这项工作得到了意大利国家运营方案PONa3 00025(BIOforIU)和欧洲生物成像大型泛欧研究基础设施项目的部分支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
采集工具尼康尼康 C2Tool采集支持工具
APE 脉冲链路控制软件APE-APE脉冲链路控制软件软件控制
自相关器APEAPE PulseCheck USB 50自相关
探测器ThorlabsThorlabs DET10A光电二极管
探测器卡ThorlabsThorlabs VRC红外探测器卡
二向色镜SemrockFF875-Di01-25X36二向色镜
二向色镜SemrockFF875-Di01-25x36二向色镜
EOMConoptics（EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P）。普克尔斯电池片
快速探测器Thorlabs Thorlabs DET025AL/M光电二极管
快速镜面扫描单元尼康C2Microscpe 扫描头
飞秒激光器 Ti：SA相干相干 变色龙 Ultra II色龙 Ultra II
函数发生器TTiTG5011 AIM –TTi函数发生器
倒置光学显微镜尼康Eclipse TE-2000-E， 尼康Eclipse TE-2000-E， 尼康
锁相放大器斯坦福研究系统SR844-200 MHz双相A锁相放大器 斯坦福研究系统
公司陷波滤波器，SemrockNF03-808E-25陷波滤波器
延迟线纽波特纽波特M-ILS200CC可调谐光延迟线
光学参量振荡器相干相干紧凑型 OPO相干紧凑型 OPO
示波器WaveRunner640Zi 4GHz OSC/LeCroy数字示波器
PCI 卡国家仪器NI PCIe 6363数据采集卡
位置传感器 探测器Newport Newport Conex PSD9位置检测器传感器
功率计头CoherentPowerMax PM10，激光功率探测器
平移台ThorlabsThorlabs PT1/M带标准千分尺的机械平移台
变 光学

References

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