本方案详细描述了小鼠带血管异位脾脏移植模型的手术步骤。该模型技术难度较高，可作为研究脾细胞命运与存活时间、不同脾细胞群体在疾病进展中的作用机制以及移植免疫的有力工具。
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方法文章
用于研究脾细胞生物学与移植免疫的带血管异位脾移植小鼠模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
脾脏是一种独特的淋巴器官，在免疫系统和造血系统的稳态中发挥关键作用。无论原因为何，接受脾切除术的患者均易发生严重的术后感染，并面临深静脉血栓形成及恶性肿瘤风险升高的问题。近期流行病学研究表明，脾切除术可能与心血管疾病的发生相关，提示脾脏的生理功能尚未被充分认识。本文介绍一种带血管的异位脾脏移植小鼠模型，该模型不仅可用于研究不同生物学过程中脾脏免疫细胞亚群的功能与行为特征，还可作为评估脾脏移植在特定疾病中治疗潜力的有力工具。该模型的主要手术步骤包括供体脾脏的切取、受体自身脾脏的切除以及脾移植物的血管重建。利用同源近交系小鼠（例如具有 CD45.1/CD45.2 背景的小鼠），我们观察到，在同基因移植后，供体来源的脾淋巴细胞和髓系细胞早在术后第1天即开始从移植物中迁移出来，同时伴随多种受体来源细胞的流入，从而形成一种独特的嵌合体。 尽管该技术操作相对复杂，但手术成功率可超过>90%。该模型允许在稳态条件下以及脾脏移植后的疾病状态下，追踪脾细胞的命运、存续时间及其功能，为揭示脾源性免疫细胞在不同疾病过程中的独特作用提供了重要研究机会。
引言
脾脏是人体最大的继发性淋巴器官，在免疫系统和造血系统中具有关键作用。其功能主要由两个形态上不同的区域执行，即红髓和白髓1。红髓由静脉窦和脾索构成，形成一个三维网状结构，其中包含网状纤维、网状细胞以及相关的巨噬细胞。这种独特的结构使红髓能够有效地过滤血液，清除外来物质以及衰老或受损的红细胞。白髓包括淋巴滤泡、边缘区和动脉周围淋巴鞘（PALS），是抗原捕获与处理、淋巴细胞归巢、转化、增殖和成熟的重要场所2。尽管如此，脾脏通常被认为是一个可有可无的器官，因为其他淋巴器官（如淋巴结）也能部分执行其功能，且脾脏缺失通常不会导致死亡。因此，脾切除术已被广泛用于治疗脾损伤或良性血液系统疾病的患者3。然而，脾切除患者面临多种长期并发症。细菌感染是脾切除术后最广为人知的并发症4,5。近年来，暴发性脾切除后脓毒症被确认为一种严重的术后并发症，具有较高的死亡率6。此外，近期的流行病学研究表明，脾切除可能与心血管疾病的发生相关，提示脾脏的其他生理功能仍有待进一步探索7,8。
自体....
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方案
本研究中的所有操作和动物使用均按照美国西北大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。在本研究中，使用8至10周龄的雄性CD45.2和CD45.1小鼠（均来自Jackson实验室，BALB/c背景）分别作为脾脏供体和受体，以建立同基因型脾脏移植模型。所有动物均饲养于西北大学动物设施的无菌环境中。所有小鼠在麻醉后均使用眼用润滑剂以防止角膜干燥。
1. 手术准备、麻醉与镇痛方案
- 将无菌一次性手术单（45.7 cm × 66 cm）铺在手术台上。轻轻抓取小鼠，腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉，并皮下注射0.05 mg/kg丁丙诺啡以镇痛。
- 通过夹捏脚趾法确认麻醉深度，用剃刀剃除整个腹部区域的毛发，并将小鼠置于手术显微镜下（放大倍数为6–10倍）的无菌手术台上。
2. 供体脾脏采集
- 用酒精消毒棉片对腹部进行消毒，用手术胶带固定四肢，然后用剪刀从耻骨至剑突处沿中线做一条3-4 cm的纵向皮肤切口。
- 使用回形针制成的无菌拉钩牵开腹壁，用无菌棉签将肠管移至腹部右侧（术者左侧）以暴露脾脏。使用无菌低温电凝器凝固附着于脾脏的胃短静脉（图1A）。将一块浸有37 °C生理盐水的无菌纱布覆盖在脾脏上以保持其湿润（
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结果
经验丰富的显微外科医生可在90分钟内完成小鼠脾脏移植的全部操作。本实验室已成功开展超过100例小鼠脾脏移植手术，手术成功率超过90%，以受体小鼠及移植脾脏在术后第1天（POD 1）或术后第7天（POD 7，本研究终点）均存活为判定标准。移植脾脏的存活状态通过大体形态观察及脾细胞的流式细胞术分析加以确认。根据我们的经验，流式细胞术分析（活/死细胞活力检测）对判断移植脾脏是否存活极为敏感，因为一旦移植脾脏发生坏死，其中绝大多数脾细胞将死亡。表1总结了该手术的技术难点、常见并发症及其处理方法。
为检测移植后移植物的形态，对BALB/c小鼠脾脏同基因移植片在术后第1天（POD 1）和术后第7天（POD 7）进行了苏木精-伊红（H&E）染色。代表性图像见图3。脾脏同基因移植片在术后第一周内结构保持完整，红髓、白髓及边缘区仍清晰可辨。为研究脾脏移植后的细胞迁移情况，于POD 1和POD 7.......
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讨论
有力的证据表明，脾脏来源的单核细胞在无菌性炎症过程中发挥着重要作用，例如动脉粥样硬化19、急性缺血性脑损伤20或肺损伤18，以及心肌缺血/再灌注（I/R）损伤和重塑21,22,23。这些研究强调了脾脏在多种慢性疾病中尚未被充分认识的作用，其中心血管疾病尤为重要（尤其是考虑到它是全球首要死因）。脾脏移植小鼠模型为揭示脾脏来源免疫细胞在各种疾病中的作用及其在脾脏内的活化机制提供了重要机会。例如，Swirski 等人利用脾脏移植小鼠模型发现，在心肌缺血损伤发生后，脾脏来源的单核细胞会增强其迁移能力，从脾脏迁移至外周，黏附于受损组织，并参与伤口修复过程17。此外，该模型还有助于研究成熟免疫细胞在脾脏中的存续时间及其潜在机制，并探索脾脏移植的治疗潜力。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢西北大学综合移植中心和范伯格医学院研究核心项目提供的资源和资金支持。 具体而言，流式细胞术服务由西北大学流式细胞术核心设施提供，组织学服务由小鼠组织学与表型分析实验室提供，这两个核心设施均得到授予罗伯特·H·卢里综合癌症中心的美国国家癌症研究所 P30-CA060553 项目的支持。我们感谢 Nate Esparza 先生对本文稿的校对。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯胺酮 | Wyeth | 206205-01 | |
| 赛拉嗪 | Lloyd Laboratories | 139-236 | |
| 肝素溶液 | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
| 注射级生理盐水 | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-20 | |
| 70% 乙醇 | Pharmco Products Inc. | 111000140 | |
| ThermoCare 小动物重症监护系统 | Thermocare, Inc. | ||
| Adson 镊子 | Roboz Surgical Instruments | RS-5230 | |
| Derf 持针器 | Roboz Surgical Instruments | RS-7822 | |
| 超细显微解剖剪 | Roboz Surgical Instruments | RS-5881 | |
| 微型夹 | Roboz Surgical Instruments | RS-5420 | |
| 7-0 丝线 | Braintree Scientific | SUT-S 103 | |
| 11-0 尼龙线，带 4 mm (3/8) 针 | Sharpoint DR4 | AK-2119 | |
| 小鼠 CD45.2 抗体 | BD Bioscience | 553772 | |
| 小鼠 CD45.1 抗体 | BD Bioscience | 553776 | |
| 小鼠 CD11b 抗体 | BD Bioscience | 557657 | |
| 小鼠 B220 抗体 | BD Bioscience | 553089 | |
| 小鼠 Ly6C 抗体 | eBioscience | 48-5932-80 | |
| 小鼠 Ly6G 抗体 | BD Bioscience | 561236 | |
| 小鼠 F4/80 抗体 | BD Bioscience | 565614 | |
| 小鼠 CD11c 抗体 | BD Bioscience | 558079 | |
| 小鼠 CD3 抗体 | eBioscience | 48-0032-82 | |
| 小鼠 CD4 抗体 | BD Bioscience | 552051 | |
| 小鼠 CD8 抗体 | BD Bioscience | 563786 | |
| LIVE/DEAD™ 可固定紫红色死细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher | L34955 |
参考文献
- Cesta, M. F. Normal structure, function, and histology of the spleen. Toxicologic Pathology. 34 (5), 455-465 (2006).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
- Misiakos, E. P., Bagias, G., Li....
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