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方法文章

中性粒细胞谱系细胞的全骨髓样本制备用于质谱流式分析

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DOI：

10.3791/59617

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2019年6月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Inflammation Biology, La Jolla Institute for Immunology, 2Flow Cytometry Core Facility, La Jolla Institute for Immunology

本文内容

摘要

本文介绍了一种处理从小鼠或人新鲜骨髓（BM）中分离的中性粒细胞谱系细胞的实验方案，用于高维质谱流式细胞术（飞行时间质谱流式细胞术，CyTOF）分析。

摘要

本文介绍了一种优化的实验方案，旨在保存新鲜骨髓（BM）中的中性粒细胞谱系细胞，以用于全骨髓质谱流式细胞术（CyTOF）分析。我们采用了一个偏向髓系细胞的39抗体CyTOF检测组合，结合该方案对造血系统进行评估，重点关注中性粒细胞谱系细胞。通过开放资源的降维算法viSNE分析CyTOF结果，并展示该方案所获得的数据。基于此方案，我们发现了新的中性粒细胞谱系细胞群体。该新鲜全骨髓制备方案可用于：1）通过CyTOF分析从全骨髓中发现尚未鉴定的细胞群体；2）研究血液疾病（如白血病）患者全骨髓的异常缺陷；3）辅助优化使用新鲜全骨髓样本的荧光激活流式细胞术实验方案。

引言

在过去几十年中，细胞计数技术已成为研究骨髓（BM）造血系统的一种强大工具。这些技术包括荧光激活流式细胞术以及使用重金属标记抗体的新型CyTOF技术。它们通过识别不同细胞独特的表面标志物表达谱，实现了在异质性生物样本中发现多种细胞类型。然而，荧光激活流式细胞术中通道数量增加会导致光谱重叠加剧，从而引起更高的数据误差。因此，通常需要去除不需要的细胞，以富集目标细胞群体，便于进行荧光激活流式细胞术分析。例如，Ly6G（或Gr-1）和CD11b被视为成熟髓系细胞的标志物，在对造血干细胞和祖细胞（HSPCs）进行流式细胞术分析前，通常会使用磁珠富集试剂盒从骨髓样本中去除Ly6G+（或Gr-1+）和CD11b+细胞，或者将这些标志物组合在一个弃除通道（dump cocktail channel）中加以排除1,2,3。另一个例子是，在免疫学研究中，通常会从人外周血样本中去除中性粒细胞，以富集外周血单个核细胞（PBMC）。然而，从小鼠或人分离得到的全骨髓样本却很少被完整地用于细胞计数分析。

近年来，CyTOF 已成为研究造血系统的一种革命性工具4,5,6。在 CyTOF 技术中，荧光素标记的抗体被重金属元素标记的抗体所取代。该方法可同时检测超过 40 种标志物，且无需担心光谱重叠问题。它使得在无需预先耗竭步骤或“倾倒通道”（dump channel）的情况下，对完整的生物样本进行分析成为可能。因此，我们能够以高维度的信息内容，全面地观察造血系统，超越传统二维流式细胞术图谱的局限。过去在耗竭或设门过程中被忽略的细胞群体，如今可通过 CyTOF 产生的高维数据得以揭示4,5。我们设计了一套抗体组合，可同时检测造血系统中的 39 个参数，重点关注髓系细胞谱系7。与传统的流式细胞术数据相比，对 CyTOF 产生的前所未有的单细胞高维数据进行解读和可视化具有挑战性。计算科学家已开发出多种降维技术，用于高维数据集的可视化。本文中我们采用了 viSNE 算法，该算法基于 t-分布随机邻域嵌入（t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding, t-SNE）技术，用于分析 CyTOF 数据，并将高维结果呈现在二维图谱上，同时保留数据的高维结构8,9,10。在 tSNE 图中，相似的细胞被聚类为亚群，颜色用于突出细胞的特征。例如，在图 1中，髓系细胞根据其在 CyTOF 检测中 33 种表面标志物的表达模式相似性，被分布到多个细胞亚群中（图 1）4。本文中，我们利用先前报道的 39 参数小鼠 CyTOF 抗体组合，结合 viSNE 分析方法，对小鼠骨髓进行了研究7。viSNE 对 CyTOF 数据的分析揭示了一个此前未被识别的细胞群体，该群体同时表现出造血干细胞/祖细胞（HSPC，CD117+）和中性粒细胞（Ly6G+）的特征（图 2）7。

综上所述，我们提出了一种用于质谱流式细胞术（CyTOF）分析的新鲜全骨髓样本处理方案。本文以小鼠骨髓为例进行说明，但该方案同样适用于人骨髓样本的处理。针对人骨髓样本的具体操作细节也在方案中予以注明。本方案的优势在于包含了孵育时间、温度等经过优化的关键参数，旨在保护全骨髓中的中性粒细胞谱系细胞，从而实现对完整全骨髓样本的分析。此外，该方案也可便捷地修改后用于荧光激活流式细胞术（fluorescence-activated flow cytometry）的应用。

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方案

所有实验均遵循拉霍亚过敏与免疫学研究所动物护理和使用委员会批准的指南，并根据美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中规定的要求，获得了拉霍亚过敏与免疫学研究所关于啮齿类动物使用的批准。

1. 收集小鼠骨髓（BM）

  1. 从商业供应商处购买 C57BL/6J 小鼠。给予标准啮齿类动物饲料，并将小鼠饲养于无病原体设施中的微隔离笼内。
  2. 实验使用 6 至 10 周龄的雄性小鼠。通过吸入 CO2 实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
  3. 将小鼠仰卧置于无菌手术垫上。用 70% 乙醇喷洒腹部及后肢区域以消毒皮肤。使用解剖手术剪剪开腹腔。
  4. 去除皮肤以暴露后肢。使用一对钝头敷料镊夹住小鼠胫骨踝关节稍上方位置。用另一对弯头敷料镊在钝头敷料镊下方固定胫骨。用钝头敷料镊撕开附着的肌肉，折断胫骨并暴露骨组织。
    注意：胫骨与膝关节连接较松，可用钝头敷料镊轻易取出。
  5. 将胫骨放入冷的 1x PBS 中。
  6. 随后，将用于固定的弯头敷料镊向下移动至股骨。将钝头敷料镊滑至膝关节下方并夹住髌骨。轻柔向上牵拉使髌骨脱位。撕开附着于髌骨的肌肉以暴露股骨。用弯头敷料镊夹住暴露的股骨，并使用解剖手术剪从骨底部剪下股骨。
  7. 将股骨放入冷的 1x PBS 中。
  8. 用 18 G 针头在 0.5 mL 微离心管上打孔。
  9. 将胫骨和股骨均放入同一个 0.5 mL 微离心管中，使骨的开口端朝下对准孔洞。
  10. 将装有胫骨和股骨的 0.5 mL 管放入一个 1.7 mL 微离心管中。
  11. 在微量离心机中以 5,510 x g 离心 30 秒，使双层管中的胫骨和股骨共同离心。
  12. 确保骨髓（BM）已从骨组织中被冲出，并在管底形成沉淀。弃去含有空骨的 0.5 mL 管。小鼠骨髓现已准备好用于后续步骤。
    注意：人骨髓按先前所述方法从临床资源中获取11。

2. 对骨髓细胞进行CyTOF染色

  1. 用 1 mL 1× 红细胞（RBC）裂解缓冲液重悬骨髓细胞。对于人骨髓样本，将全部骨髓组织重悬于 10 倍体积的 1× 红细胞（RBC）裂解缓冲液中，在室温（RT）孵育 10 分钟。
  2. 在 4 °C 条件下以 350 x g 离心 5 分钟。对于人骨髓样本，在进行步骤 2.3 前需重复步骤 2.1 和 2.2。
  3. 小心吸除上清液，保留沉淀不受扰动。用 1 mL 冷的 1× PBS 重悬沉淀，并通过 70 μm 细胞滤网将细胞滤入 15 mL 圆锥管中。此时骨髓细胞已完全从肌肉和骨碎片中分离出来。向管中加入 9 mL 冷的 1× PBS 洗涤细胞。
  4. 在 4 °C 条件下以 350 x g 将 15 mL 管离心 5 分钟。
  5. 小心吸除上清液，用 10 mL 冷 PBS 重悬骨髓细胞。取部分细胞用于计数，使用血细胞计数板进行细胞计数。
  6. 将 5 × 106 个骨髓细胞分装至新的 15 mL 管中，用于质谱流式（CyTOF）染色。
  7. 在 4 °C 条件下以 350 x g 将 15 mL 管中的细胞分装物离心 5 分钟。
  8. 小心吸除上清液，用含 125 nM 顺铂的 1 mL CyTOF 染色缓冲液重悬骨髓细胞，作为样本的活率指示剂。在室温孵育 5 分钟。
  9. 孵育后，向管中加入 4 mL CyTOF 染色缓冲液，在 4 °C 条件下以 350 x g 离心 5 分钟。对于人骨髓样本，需在 CyTOF 染色缓冲液中加入 10% 人 AB 血清。
  10. 用 50 µL Fc 受体阻断液重悬细胞沉淀，小心吸除上清液后进行重悬。在 4 °C 孵育 10 分钟。人骨髓样本可跳过此步骤。
  11. 向样本中加入 50 µL 自制的 CyTOF 抗体混合液5，使总染色体积达到 100 μL。轻轻吹打混匀。在 4 °C 孵育 30 分钟。小鼠骨髓和人骨髓样本的抗体混合液体积最终均为 100 μL。
  12. 孵育结束后，每管加入 2 mL CyTOF 染色缓冲液洗涤细胞，在 4 °C 条件下以 350 x g 离心 5 分钟。
  13. 重复步骤 2.12，共进行两次洗涤。
  14. 从 16% 储存安瓿中新鲜配制 1.6% 甲醛溶液。将 1 份甲醛原液与 9 份 1× PBS 混合稀释。
  15. 小心吸除上清液，用 1 mL 新鲜配制的 1.6% 甲醛（FA）溶液重悬沉淀。在室温孵育 15 分钟。
  16. 在 4 °C 条件下以 800 x g 离心 5 分钟。
  17. 小心吸除上清液，用含 125 nM 插入剂溶液的 1 mL 固定/透化缓冲液重悬细胞沉淀。
  18. 将样本在插入剂溶液中于 4 °C 过夜孵育。

3. 准备用于CyTOF检测的细胞

  1. 轻轻涡旋并在 4 °C 下以 800 x g 离心 5 分钟。
  2. 加入 2 mL CyTOF 染色缓冲液洗涤细胞，在 4 °C 下以 800 x g 离心 5 分钟，然后通过抽吸去除上清液。
  3. 将细胞重悬于 1 mL 二重蒸馏水（diH2O）中。从每管中保留少量体积（约 10 µL）用于细胞计数。
  4. 在 4 °C 下以 800 x g 离心 5 分钟。
  5. 重复步骤 3.3 和 3.4。
  6. 小心抽吸上清液，保留细胞沉淀。骨髓（BM）细胞现在可重悬至 1 × 106 个细胞/mL 的浓度，用于 CyTOF 检测。

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结果

图1 展示了质谱流式细胞术（CyTOF）实验的一个示例结果。在此tSNE图中，来自多个小鼠组织的细胞根据质谱流式33参数检测面板所测量的表面标志物表达谱的相似性，被聚类为不同的细胞亚群。根据每个细胞上33个标志物的表达情况，性质更为相似的细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞或树突状细胞）被自动聚集成簇。

图2 作为本研究中所述小鼠骨髓CyTOF实验方案的一个示例结果展示。该方案保持了骨髓完整性的前提下，成功发现了一个此前未知的共表达中性粒细胞（Ly6G）的细胞群体+, 图 2A）和 HSPC（CD117+, 图2B）表面标志物的同时检测。该细胞群体在我们采用的CyTOF检测面板所测定的表面标志物表达上呈现出独特的表达模式（图2C）并且由于Ly6G的存在...

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讨论

在过去几十年中，基于荧光的流式细胞术被用作研究细胞谱系和异质性的主要方法1,2,3。尽管流式细胞术能够提供多维数据，但该方法受限于参数选择以及光谱重叠问题。为了克服流式细胞术的局限性，我们采用了CyTOF技术，该技术使用重金属同位素而非荧光染料来标记抗体，从而消除了检测通道之间的串扰或细胞自身的自发荧光，因此能够在单细胞水平上同时检测更多参数，并对细胞多样性进行更深入的评估12。过去在去除非目标细胞或设门过程中被忽略的细胞群体，尤其是长期以来被认为具有同质性的重要免疫细胞（如中性粒细胞谱系细胞）13,14，现可通过CyTOF得到更精确的表征2,3,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢LJI流式细胞术核心团队在质谱流式细胞术实验操作中提供的协助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为R01HL134236、P01HL136275和R01CA202987（均授予C.C.H.），以及ADA7-12-MN-31（04）（授予C.C.H.和Y.P.Z.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>CyTOF 抗体（小鼠）
抗小鼠 CD45（克隆 30-F11）-89YFluidigm货号 3089005B
抗人/小鼠 CD45R/B220（克隆 RA36B2）-176YbFluidigm货号 3176002B
抗小鼠 CD105（克隆 MJ7/18）- 纯化Biolegend货号：120402；RRID:AB_961070
抗小鼠 CD115（CSF-1R）（克隆 AFS98）- 纯化Biolegend货号：135502；RRID:AB_1937293
抗小鼠 CD117/c-kit（克隆 2B8）-166ErFluidigm货号 3166004B
抗小鼠 CD11a（克隆 M17/4）- 纯化Biolegend货号：101101；RRID:AB_312774
抗小鼠 CD11b（克隆 M1/70）-148NdFluidigm货号 3148003B
抗小鼠 CD11c（克隆 N418）-142NdFluidigm货号 3142003B
抗小鼠 CD127（IL-7R）α)（克隆 A7R34）-MaxPar 就绪Biolegend货号 133919；RRID:AB_2565433
抗小鼠 CD150（克隆 TC1512F12.2）-167ErFluidigm货号 3167004B
抗小鼠 CD16.2 (FcγRIV（克隆9E9）-纯化Biolegend货号：149502；RRID:AB_2565302
抗小鼠 CD162（克隆 4RA10 (RUO)）- 纯化BD 生物科学货号：557787；RRID:AB_647340
抗小鼠 CD169（Siglec-1）（克隆 3D6.112）- 纯化Biolegend货号：142402；RRID:AB_10916523
抗小鼠 CD182（CXCR2）（克隆 SA044G4）- 纯化Biolegend货号：149302；RRID:AB_2565277
抗小鼠 CD183（克隆 CXCR3-173）- 纯化Biolegend货号 126502；RRID:AB_1027635
抗小鼠 CD335 (NKp46)（克隆 29A1.4）-MaxPar 就绪Biolegend货号# 137625；RRID:AB_2563744
抗小鼠 CD34（克隆 MEC14.7）- 纯化Biolegend货号 119302；RRID:AB_345280
抗小鼠 CD41（克隆 MWReg30）-MaxPar 就绪Biolegend货号 133919；RRID:AB_2565433
抗小鼠 CD43（克隆 S11）-146NdFluidigm货号 3146009B
抗小鼠 CD48（克隆 HM48.1）-156GdFluidigm货号 3156012B
抗小鼠 CD62L（克隆 MEL-14）-MaxPar 就绪ThermoFisher货号# 14-1351-82；RRID:AB_467481
抗小鼠CD71（克隆RI7217）-纯化Biolegend货号 113802；RRID:AB_313563
抗小鼠 CD90（克隆 G7）- 纯化Biolegend货号：105202；RRID:AB_313169
抗小鼠 F4/80（克隆 BM8）-159TbFluidigm货号 3159009B
抗小鼠 FcεRIα （克隆 MAR-1）-MaxPar 就绪Biolegend货号：134321；RRID:AB_2563768
抗小鼠 GM-CSF（MP1-22E9（仅供研究使用））- 纯化BD 生物科学货号：554404；RRID:AB_395370
抗小鼠 I-A/I-E（克隆 M5/114.15.2）-174YbFluidigm货号 3174003B
抗小鼠 Ki67（克隆 B56 (RUO)）- 纯化抗体BD 生物科学货号：556003；RRID:AB_396287
抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1)（克隆 D7）-169TmFluidigm货号 3169015B
抗小鼠 Ly6B（克隆 7/4）- 纯化abcam货号：ab53457；RRID:AB_881409
抗小鼠 Ly-6G（克隆 1A8）-MaxPar 就绪Biolegend货号 127637；RRID:AB_2563784
抗小鼠 NK1.1（克隆 PK136）-165HoFluidigm货号 3165018B
抗小鼠 Siglec-F（克隆 E50-2440 (RUO)）- 纯化BD 生物科学货号：552125；RRID:AB_394340
抗小鼠 TCRβ （克隆 H57-597）-143NdFluidigm（克隆 H57-597）-143Nd
抗小鼠 TER-119/红系细胞（克隆 TER-119）-MaxPar 就绪Biolegend货号：116241；RRID:AB_2563789
<强>化学品、多肽与重组蛋白
抗体稳定剂CANDOR Bioscience货号 130050
牛血清白蛋白Sigma-Aldrich货号 A4503
顺铂-194PtFluidigm货号 201194
eBioscience 1x 红细胞裂解缓冲液ThermoFisher货号# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装ThermoFisherCat# 00-4333-57
EQ四元素校准微球Fluidigm货号 201078
乙二胺四乙酸（EDTA）赛默飞世尔科技货号 AM9260G
胎牛血清Omega Scientific货号# FB-02
HyClone 磷酸盐缓冲液溶液GE 生命科学货号#SH30256.01
嵌入剂-IrFluidigm货号 201192B
MAXPAR 抗体标记试剂盒Fluidigmhttp://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
多聚甲醛Sigma-Aldrich货号 158127
叠氮化钠Sigma-Aldrich货号 S2002
Triton X-100Sigma-Aldrich货号 X100
胰蛋白酶EDTA 1x康宁货号 25-053-Cl
<强>实验模型：生物体/菌株
小鼠：C57BL/6J杰克逊实验室货号：000664
<强>软件算法
基于微珠的标准化试剂Finck 等，2013https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
CytobankCytobankhttps://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0陈等，2016https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
t-SNEvan der Maaten 和 Hinton，2008https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html

参考文献

  1. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  2. Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
  3. Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
  4. Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
  5. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
  6. Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
  7. Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
  8. Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
  9. Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
  10. van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).
  11. Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386(2018).
  12. Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
  13. Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579(2018).
  14. Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nature Reviews in Immunology. , (2019).

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