本文介绍了一种处理从小鼠或人新鲜骨髓（BM）中分离的中性粒细胞谱系细胞的实验方案，用于高维质谱流式细胞术（飞行时间质谱流式细胞术，CyTOF）分析。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种优化的实验方案，旨在保存新鲜骨髓（BM）中的中性粒细胞谱系细胞，以用于全骨髓质谱流式细胞术（CyTOF）分析。我们采用了一个偏向髓系细胞的39抗体CyTOF检测组合，结合该方案对造血系统进行评估，重点关注中性粒细胞谱系细胞。通过开放资源的降维算法viSNE分析CyTOF结果，并展示该方案所获得的数据。基于此方案，我们发现了新的中性粒细胞谱系细胞群体。该新鲜全骨髓制备方案可用于：1）通过CyTOF分析从全骨髓中发现尚未鉴定的细胞群体；2）研究血液疾病（如白血病）患者全骨髓的异常缺陷；3）辅助优化使用新鲜全骨髓样本的荧光激活流式细胞术实验方案。
引言
在过去几十年中，细胞计数技术已成为研究骨髓（BM）造血系统的一种强大工具。这些技术包括荧光激活流式细胞术以及使用重金属标记抗体的新型CyTOF技术。它们通过识别不同细胞独特的表面标志物表达谱，实现了在异质性生物样本中发现多种细胞类型。然而，荧光激活流式细胞术中通道数量增加会导致光谱重叠加剧，从而引起更高的数据误差。因此，通常需要去除不需要的细胞，以富集目标细胞群体，便于进行荧光激活流式细胞术分析。例如，Ly6G（或Gr-1）和CD11b被视为成熟髓系细胞的标志物，在对造血干细胞和祖细胞（HSPCs）进行流式细胞术分析前，通常会使用磁珠富集试剂盒从骨髓样本中去除Ly6G+（或Gr-1+）和CD11b+细胞，或者将这些标志物组合在一个弃除通道（dump cocktail channel）中加以排除1,2,3。另一个例子是，在免疫学研究中，通常会从人外周血样本中去除中性粒细胞，以富集外周血单个核细胞（PBMC）。然而，从小鼠或人分离得到的全骨髓样本却很少被完整地用于细胞计数分析。
近年来，CyTOF 已成为研究造血系统的一种革命性工具4,
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方案
所有实验均遵循拉霍亚过敏与免疫学研究所动物护理和使用委员会批准的指南，并根据美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中规定的要求，获得了拉霍亚过敏与免疫学研究所关于啮齿类动物使用的批准。
1. 收集小鼠骨髓（BM）
- 从商业供应商处购买 C57BL/6J 小鼠。给予标准啮齿类动物饲料，并将小鼠饲养于无病原体设施中的微隔离笼内。
- 实验使用 6 至 10 周龄的雄性小鼠。通过吸入 CO2 实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
- 将小鼠仰卧置于无菌手术垫上。用 70% 乙醇喷洒腹部及后肢区域以消毒皮肤。使用解剖手术剪剪开腹腔。
- 去除皮肤以暴露后肢。使用一对钝头敷料镊夹住小鼠胫骨踝关节稍上方位置。用另一对弯头敷料镊在钝头敷料镊下方固定胫骨。用钝头敷料镊撕开附着的肌肉，折断胫骨并暴露骨组织。
注意：胫骨与膝关节连接较松，可用钝头敷料镊轻易取出。 - 将胫骨放入冷的 1x PBS 中。
- 随后，将用于固定的弯头敷料镊向下移动至股骨。将钝头敷料镊滑至膝关节下方并夹住髌骨。轻柔向上牵拉使髌骨脱位。撕开附着于髌骨的肌肉以暴露股骨。用弯头敷料镊夹住暴露的股骨，并使用解剖手术剪从骨底部剪下股骨。
- 将股骨放入冷的 1x PBS 中。
- 用 18 G 针头在 0.5 mL 微离心管上打....
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结果
图1 展示了质谱流式细胞术（CyTOF）实验的一个示例结果。在此tSNE图中，来自多个小鼠组织的细胞根据质谱流式33参数检测面板所测量的表面标志物表达谱的相似性，被聚类为不同的细胞亚群。根据每个细胞上33个标志物的表达情况，性质更为相似的细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞或树突状细胞）被自动聚集成簇。
图2 作为本研究中所述小鼠骨髓CyTOF实验方案的一个示例结果展示。该方案保持了骨髓完整性的前提下，成功发现了一个此前未知的共表达中性粒细胞（Ly6G）的细胞群体+, 图 2A）和 HSPC（CD117+, 图2B）表面标志物的同时检测。该细胞群体在我们采用的CyTOF检测面板所测定的表面标志物表达上呈现出独特的表达模式（图2C）并且由于Ly6G的存在.......
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讨论
在过去几十年中，基于荧光的流式细胞术被用作研究细胞谱系和异质性的主要方法1,2,3。尽管流式细胞术能够提供多维数据，但该方法受限于参数选择以及光谱重叠问题。为了克服流式细胞术的局限性，我们采用了CyTOF技术，该技术使用重金属同位素而非荧光染料来标记抗体，从而消除了检测通道之间的串扰或细胞自身的自发荧光，因此能够在单细胞水平上同时检测更多参数，并对细胞多样性进行更深入的评估12。过去在去除非目标细胞或设门过程中被忽略的细胞群体，尤其是长期以来被认为具有同质性的重要免疫细胞（如中性粒细胞谱系细胞）13,14，现可通过CyTOF得到更精确的表征2,3,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢LJI流式细胞术核心团队在质谱流式细胞术实验操作中提供的协助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为R01HL134236、P01HL136275和R01CA202987（均授予C.C.H.），以及ADA7-12-MN-31（04）（授予C.C.H.和Y.P.Z.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>CyTOF 抗体（小鼠） | |||
| 抗小鼠 CD45（克隆 30-F11）-89Y | Fluidigm | 货号 3089005B | |
| 抗人/小鼠 CD45R/B220（克隆 RA36B2）-176Yb | Fluidigm | 货号 3176002B | |
| 抗小鼠 CD105（克隆 MJ7/18）- 纯化 | Biolegend | 货号：120402；RRID:AB_961070 | |
| 抗小鼠 CD115（CSF-1R）（克隆 AFS98）- 纯化 | Biolegend | 货号：135502；RRID:AB_1937293 | |
| 抗小鼠 CD117/c-kit（克隆 2B8）-166Er | Fluidigm | 货号 3166004B | |
| 抗小鼠 CD11a（克隆 M17/4）- 纯化 | Biolegend | 货号：101101；RRID:AB_312774 | |
| 抗小鼠 CD11b（克隆 M1/70）-148Nd | Fluidigm | 货号 3148003B | |
| 抗小鼠 CD11c（克隆 N418）-142Nd | Fluidigm | 货号 3142003B | |
| 抗小鼠 CD127（IL-7R）α)（克隆 A7R34）-MaxPar 就绪 | Biolegend | 货号 133919；RRID:AB_2565433 | |
| 抗小鼠 CD150（克隆 TC1512F12.2）-167Er | Fluidigm | 货号 3167004B | |
| 抗小鼠 CD16.2 (FcγRIV（克隆9E9）-纯化 | Biolegend | 货号：149502；RRID:AB_2565302 | |
| 抗小鼠 CD162（克隆 4RA10 (RUO)）- 纯化 | BD 生物科学 | 货号：557787；RRID:AB_647340 | |
| 抗小鼠 CD169（Siglec-1）（克隆 3D6.112）- 纯化 | Biolegend | 货号：142402；RRID:AB_10916523 | |
| 抗小鼠 CD182（CXCR2）（克隆 SA044G4）- 纯化 | Biolegend | 货号：149302；RRID:AB_2565277 | |
| 抗小鼠 CD183（克隆 CXCR3-173）- 纯化 | Biolegend | 货号 126502；RRID:AB_1027635 | |
| 抗小鼠 CD335 (NKp46)（克隆 29A1.4）-MaxPar 就绪 | Biolegend | 货号# 137625；RRID:AB_2563744 | |
| 抗小鼠 CD34（克隆 MEC14.7）- 纯化 | Biolegend | 货号 119302；RRID:AB_345280 | |
| 抗小鼠 CD41（克隆 MWReg30）-MaxPar 就绪 | Biolegend | 货号 133919；RRID:AB_2565433 | |
| 抗小鼠 CD43（克隆 S11）-146Nd | Fluidigm | 货号 3146009B | |
| 抗小鼠 CD48（克隆 HM48.1）-156Gd | Fluidigm | 货号 3156012B | |
| 抗小鼠 CD62L（克隆 MEL-14）-MaxPar 就绪 | ThermoFisher | 货号# 14-1351-82；RRID:AB_467481 | |
| 抗小鼠CD71（克隆RI7217）-纯化 | Biolegend | 货号 113802；RRID:AB_313563 | |
| 抗小鼠 CD90（克隆 G7）- 纯化 | Biolegend | 货号：105202；RRID:AB_313169 | |
| 抗小鼠 F4/80（克隆 BM8）-159Tb | Fluidigm | 货号 3159009B | |
| 抗小鼠 FcεRIα （克隆 MAR-1）-MaxPar 就绪 | Biolegend | 货号：134321；RRID:AB_2563768 | |
| 抗小鼠 GM-CSF（MP1-22E9（仅供研究使用））- 纯化 | BD 生物科学 | 货号：554404；RRID:AB_395370 | |
| 抗小鼠 I-A/I-E（克隆 M5/114.15.2）-174Yb | Fluidigm | 货号 3174003B | |
| 抗小鼠 Ki67（克隆 B56 (RUO)）- 纯化抗体 | BD 生物科学 | 货号：556003；RRID:AB_396287 | |
| 抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1)（克隆 D7）-169Tm | Fluidigm | 货号 3169015B | |
| 抗小鼠 Ly6B（克隆 7/4）- 纯化 | abcam | 货号：ab53457；RRID:AB_881409 | |
| 抗小鼠 Ly-6G（克隆 1A8）-MaxPar 就绪 | Biolegend | 货号 127637；RRID:AB_2563784 | |
| 抗小鼠 NK1.1（克隆 PK136）-165Ho | Fluidigm | 货号 3165018B | |
| 抗小鼠 Siglec-F（克隆 E50-2440 (RUO)）- 纯化 | BD 生物科学 | 货号：552125；RRID:AB_394340 | |
| 抗小鼠 TCRβ （克隆 H57-597）-143Nd | Fluidigm | （克隆 H57-597）-143Nd | |
| 抗小鼠 TER-119/红系细胞（克隆 TER-119）-MaxPar 就绪 | Biolegend | 货号：116241；RRID:AB_2563789 | |
| <强>化学品、多肽与重组蛋白 | |||
| 抗体稳定剂 | CANDOR Bioscience | 货号 130050 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | 货号 A4503 | |
| 顺铂-194Pt | Fluidigm | 货号 201194 | |
| eBioscience 1x 红细胞裂解缓冲液 | ThermoFisher | 货号# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装 | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ四元素校准微球 | Fluidigm | 货号 201078 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | 赛默飞世尔科技 | 货号 AM9260G | |
| 胎牛血清 | Omega Scientific | 货号# FB-02 | |
| HyClone 磷酸盐缓冲液溶液 | GE 生命科学 | 货号#SH30256.01 | |
| 嵌入剂-Ir | Fluidigm | 货号 201192B | |
| MAXPAR 抗体标记试剂盒 | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 货号 158127 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | 货号 S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 货号 X100 | |
| 胰蛋白酶EDTA 1x | 康宁 | 货号 25-053-Cl | |
| <强>实验模型：生物体/菌株 | |||
| 小鼠：C57BL/6J | 杰克逊实验室 | 货号：000664 | |
| <强>软件算法 | |||
| 基于微珠的标准化试剂 | Finck 等，2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | 陈等，2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten 和 Hinton，2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
参考文献
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26....
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