Method Article

全骨髓的制备,用于中性粒系细胞的大规模细胞测定分析

DOI:

10.3791/59617

⸱

June 19th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Inflammation Biology, La Jolla Institute for Immunology, 2Flow Cytometry Core Facility, La Jolla Institute for Immunology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里,我们提出一个协议,处理从小鼠或人类分离的新鲜骨髓(BM),用于对中性粒细胞的超维质量细胞测定(飞行时间,CyTOF)的细胞测定。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在本文中,我们提出了一个协议,经过优化,以保存新BM中的中性粒细胞,用于整个BM CyTOF分析。我们使用骨髓偏置的39抗体CyTOF面板,利用该协议对造血系统进行评价,重点是中性粒细胞系细胞。利用开放资源维还原算法viSNE对CyTOF结果进行了分析,并给出了数据,以证明该协议的结果。我们根据这个协议发现了新的嗜中性粒细胞群。这种新鲜全BM制剂的协议可用于1),CyTOF分析,发现来自整个BM的不明细胞群,2),调查整个BM缺陷的血液疾病患者,如白血病,3,协助优化荧光激活流式细胞仪协议,利用新鲜的全BM。

Introduction

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在过去的几十年中,细胞学方法一直是研究BM造血系统的有力工具。这些方法包括荧光活化流细胞测定法和采用重金属标记抗体的CyTOF新方法。通过鉴定其独特的表面标记表达特征,它们在异质生物标本中发现了许多细胞类型。增加的频谱重叠与更多的通道相关,导致荧光激活流细胞学应用中的数据误差更高。因此,为了丰富荧光激活流细胞学分析感兴趣的细胞群,通常会去除不需要的细胞。例如,Ly6G(或Gr-1)和CD11b被视为成熟的骨髓细胞标记,Ly6G= (或Gr-1+) 和CD11b+细胞在流式细胞测定分析之前,通常使用磁性浓缩试剂盒从BM样品中取出。造血干细胞和祖细胞(HSPCs)或将这些标记物组合在一个转储鸡尾酒通道1,2,3。另一个例子是,中性粒细胞经常从人类血液标本中取出,以丰富外周血单核细胞(PBMC),用于免疫学研究。然而,从小鼠或人类分离出的整个骨髓很少被完整地研究为细胞学分析。

最近,CyTOF已成为研究造血系统4,5,6的革命性工具。使用CyTOF....

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Protocol

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所有实验均遵循拉霍亚过敏和免疫学研究所动物护理和使用委员会批准的准则,并根据国家卫生研究院的《实验室动物护理和使用指南》。

1. 收获小鼠骨髓 (BM)

  1. 从商业供应商处购买 C57BL/6J 鼠标。在无病原体的设施中,在微型隔离器笼中喂养标准的啮齿动物食物,并饲养房屋。
  2. 使用6-10周大的雄性小鼠进行实验。通过CO2吸入安乐死,然后是宫颈脱位。
  3. 将鼠标放在腹部向上的无菌手术垫上。通过喷洒70%乙醇对腹部和后肢的皮肤进行消毒。用一把解剖手术剪刀切开腹腔。
  4. 去除皮肤以暴露后肢。使用一对钝尖敷料钳将鼠标尖头保持在脚踝正下方。使用另一对弯曲的修整钳将钝尖修整钳下方的尖头稳定。打破骨质,并通过用钝尖敷料钳撕裂肌肉暴露骨头。
    注:骨裂是松散地连接到膝关节,可以很容易地挑选出来使用钝尖敷料钳。
  5. 将 tibia 置于冷 1x PBS 中。
  6. 接下来,将稳定弯曲的修整钳向下移到股骨上。将钝尖敷料滑到膝盖关节下方,并按住膝盖。轻轻地拉起膝盖。通过撕开附着在膝盖上的肌肉来暴露股骨。用弯曲的敷料钳抓住裸露的股骨,并用解剖手术剪刀将股骨从骨底切开。
  7. 将股骨置于冷 1x PBS 中。
  8. 用 18 G 针在 0.5 mL 微离心管中打孔。
  9. 将头骨和股骨放入同一 0.5 m....

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Results

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图1作为CyTOF实验的一个示例。在此 tSNE 图中,跨多个小鼠组织的细胞根据 33 参数 CyTOF 面板测量的表面标记表达式配置文件的相似性聚集到子中。具有更多相似属性的细胞根据每个细胞上的 33 个标记的表达式自动聚集在一起,如嗜中性粒细胞、巨噬细胞或 DC。

图2是使用本研究提出的协议进行的小鼠BM CyTOF实验的一个示例结果。该协议保留了整个BM的完整性,导致发现一个以前未知的细胞群,共同表达中性粒细胞(Ly6G+,图2A)和HSPC(CD117+,图2B)特征表面标记同时。此细胞群显示了由我们的 CyTOF 面板测量的表面标记表达式(图 2C)的独特模式,由于 Ly6G=细胞耗竭

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Discussion

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在过去的几十年里,荧光流细胞学被用作研究细胞谱系和异质性1、2、3的主要方法。虽然流式细胞学提供了多维数据,但这种方法受到参数选择和光谱重叠的限制。为了克服流式细胞学的弱点,我们利用了CyTOF,它使用重金属同位素代替荧光水,来标记抗体,消除检测通道之间的串扰或细胞的自荧光,因此,可以测量许多在单细胞水平上同时有更多的参数,并生成对细胞多样性的更深入的评估12。过去在消耗或浇注过程中省略的细胞群,特别是重要的免疫细胞,如中性粒细胞系状细胞,长期被认为是同质的13,14,可以更好地用CyTOF 2来描述 ,3,7

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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我们要感谢LJI流式细胞学核心协助进行大规模细胞测量程序。这项工作得到了NIH授予R01HL134236、P01HL136275和R01CA202987(全部授予C.C.H)和ADA7-12-MN-31(04)(C.C.H.和Y.P.Z)的支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CyTOF 抗体（小鼠）
抗小鼠 CD45（克隆 30-F11）-89YFluidigmCat# 3089005B
抗人/小鼠 CD45R/B220（克隆 RA36B2）-176YbFluidigmCat# 3176002B
抗小鼠 CD105（克隆 MJ7/18）-纯化的BiolegendCat# 120402;RRID：AB_961070
抗小鼠 CD115 （CSF-1R） （克隆 AFS98） 纯化的BiolegendCat# 135502;RRID：AB_1937293
抗小鼠 CD117/c-kit （克隆 2B8）-166ErfluidigmCat# 3166004B
抗小鼠 CD11a （克隆 M17/4）纯化的BiolegendCat# 101101;RRID：AB_312774
抗小鼠 CD11b（克隆 M1/70）-148NdFluidigmCat# 3148003B
抗小鼠 CD11c（克隆 N418）-142NdFluidigmCat# 3142003B
抗小鼠 CD127 （IL-7Rα）（克隆 A7R34）-MaxPar ReadyBiolegendCat# 133919;RRID：AB_2565433
抗小鼠 CD150 （克隆 TC1512F12.2）-167ErfluidigmCat# 3167004B
抗小鼠 CD16.2 （FcγRIV）（克隆 9E9）-纯化的BiolegendCat# 149502;RRID：AB_2565302
抗小鼠 CD162 （克隆 4RA10 （RUO）） 纯化的BD BiosciencesCat# 557787;RRID：AB_647340
抗小鼠 CD169 （Siglec-1） （克隆 3D6.112） 纯化的BiolegendCat# 142402;RRID：AB_10916523
抗小鼠 CD182 （CXCR2） （克隆 SA044G4） 纯化的BiolegendCat# 149302;RRID：AB_2565277
抗小鼠 CD183 （克隆 CXCR3-173） 纯化的BiolegendCat# 126502;RRID：AB_1027635
抗小鼠 CD335 （NKp46）（克隆 29A1.4）-MaxPar ReadyBiolegendCat# 137625;RRID：AB_2563744
抗小鼠 CD34 （克隆 MEC14.7） 纯化的BiolegendCat# 119302;RRID：AB_345280
抗小鼠 CD41 （克隆 MWReg30）-MaxPar ReadyBiolegendCat# 133919;RRID：AB_2565433
抗小鼠 CD43（克隆 S11）-146NdFluidigmCat# 3146009B
抗小鼠 CD48（克隆 HM48.1）-156GdFluidigmCat# 3156012B
抗小鼠 CD62L（克隆 MEL-14）-MaxPar ReadyThermoFisherCat# 14-1351-82;RRID：AB_467481
抗小鼠 CD71 （克隆 RI7217） 纯化的BiolegendCat# 113802;RRID：AB_313563
抗小鼠 CD90 （克隆 G7） 纯化的BiolegendCat# 105202;RRID：AB_313169
抗小鼠 F4/80 （克隆 BM8）-159TbFluidigmCat# 3159009B
抗小鼠 Fc&ε;RIα（克隆 MAR-1）-MaxPar ReadyBiolegendCat# 134321;RRID：AB_2563768
抗小鼠 GM-CSF （MP1-22E9 （RUO）） 纯化的BD BiosciencesCat# 554404;RRID：AB_395370
抗小鼠 I-A/I-E（克隆 M5/114.15.2）-174YbFluidigmCat# 3174003B
抗小鼠 Ki67（克隆 B56 （RUO））-纯化的BD BiosciencesCat# 556003;RRID：AB_396287
抗小鼠 Ly-6A/E （Sca-1） （克隆 D7）-169TmFluidigmCat# 3169015B
抗小鼠 Ly6B （克隆 7/4）纯化的abcamCat# ab53457;RRID：AB_881409
抗小鼠 Ly-6G （克隆 1A8）-MaxPar ReadyBiolegendCat# 127637;RRID：AB_2563784
抗小鼠 NK1.1（克隆 PK136）-165HofluidigmCat# 3165018B
抗小鼠 Siglec-F（克隆 E50-2440 （RUO））纯化的BD BiosciencesCat# 552125;RRID：AB_394340
抗小鼠 TCR&β;（克隆 H57-597）-143NdFluidigm（克隆 H57-597）-143Nd
抗小鼠 TER-119/红细胞（克隆 TER-119）-MaxPar ReadyBiolegendCat# 116241;RRID：AB_2563789
化学品、肽和重组蛋白
抗体稳定剂CANDOR BioscienceCat# 130050
牛血清白蛋白Sigma-AldrichCat# A4503
顺铂-194PtFluidigmCat# 201194
eBioscience 1x RBC 裂解缓冲液ThermoFisherCat# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装ThermoFisherCat# 00-4333-57
EQ 四元素校准珠FluidigmCat# 201078
乙二胺四乙酸 （EDTA）ThermoFisherCat# AM9260G
胎牛血清Omega ScientificCat# FB-02
HyClone 磷酸盐缓冲盐水溶液GE LifesciencesCat#SH30256.01
Intercalator-IrFluidigmCat# 201192B
MAXPAR 抗体标记试剂盒Fluidigmhttp://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
多聚甲醛Sigma-AldrichCat# 158127
氮化钠Sigma-AldrichCat# S2002
Triton X-100Sigma-AldrichCat# X100
胰蛋白酶 EDTA 1x康宁Cat# 25-053-Cl
实验模型：生物体/菌株
小鼠：C57BL/6J杰克逊实验室库存号：000664
Software Alogrithm
基于微珠的Normalizer Finck et al.， 2013https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
CytobankCytobankhttps://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0Chen et al.， 2016https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
t-SNEvan der Maaten 和Hinton， 2008https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html
叠

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  2. Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26....

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