我们介绍一种利用体外转录RNA为基础的荧光素酶报告基因检测方法，用于研究痘病毒感染细胞中mRNA翻译的调控。该检测方法可用于研究mRNA的顺式作用元件（cis-elements）对翻译的调控，包括5’-非翻译区（UTR）和3’-UTR。此外，该方法也可用于分析不同的翻译起始模式。
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摘要
摘要
所有在痘病毒DNA复制后转录的mRNA，其5'-UTR区域均含有一个进化上保守的、非模板来源的5'-多聚腺苷酸（5'-poly(A)）前导序列。为了剖析5'-poly(A)前导序列在痘病毒感染过程中对mRNA翻译的作用，我们开发了一种基于体外转录RNA的荧光素酶报告基因检测方法。该报告基因检测包含四个核心步骤：（1）通过PCR扩增用于体外转录的DNA模板；（2）利用T7 RNA聚合酶进行体外转录以生成mRNA；（3）转染将体外转录的mRNA导入细胞；（4）检测荧光素酶活性作为翻译水平的指标。此处描述的基于RNA的荧光素酶报告基因检测方法避免了质粒在痘病毒感染细胞中复制以及质粒上隐秘启动子转录所带来的问题。本方案也可用于研究除痘病毒感染细胞体系之外，mRNA中顺式作用元件（cis-elements）对翻译的调控作用，包括5'-UTR和3'-UTR的功能。此外，该方法还可用于探究不同的翻译起始模式，如帽依赖性翻译、非帽依赖性翻译、重新起始翻译以及内部起始翻译等。
引言
根据中心法则，遗传信息从 DNA 流向 RNA，最终传递至蛋白质1,2。这一遗传信息流在多个层面受到严格调控，包括 mRNA 的翻译过程3,4。开发用于检测基因表达调控的报告基因检测方法，将有助于深入理解该过程中涉及的调控机制。本文中，我们描述了一种利用体外转录的基于 RNA 的荧光素酶报告基因检测法，在痘病毒感染细胞中研究 mRNA 翻译的实验方案。
痘病毒包含许多对人类和动物具有高度危险性的病原体5。与其他所有病毒一样，痘病毒完全依赖宿主细胞的机制进行蛋白质合成6,7,8。为了高效合成病毒蛋白，病毒进化出多种策略，以劫持细胞的翻译机制，并将其重定向用于病毒mRNA的翻译7,8。病毒常用的一种机制是在其转录本中利用cis-作用元件。典型的例子包括内部核糖体进入位点（Intern....
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方案
1. 通过PCR制备体外转录用DNA模板
- 通过PCR制备DNA模板时，需设计引物。设计引物时应考虑关键特性，如引物长度、退火温度（Tm）、GC含量、3’端以G或C结尾等。
注意：相关细节详见以下文献25,26,27。 - 设计引物以扩增包含以下元件的PCR产物，方向为5’至3’：T7启动子、poly(A)前导序列、萤火虫荧光素酶开放阅读框（ORF）以及poly(A)尾，后续统称为T7_12A-Fluc。设计正向和反向引物时，应涵盖模板DNA中不存在的所有额外元件（图2A）。
注意：所有元件的序列见表1。 - 在正向引物（5’-3’）中加入若干额外核苷酸28，随后依次为T7启动子、poly(A)前导序列或所需的5’-非翻译区（5’-UTR）序列，以及约20个核苷酸（根据Tm调整），对应报告基因ORF的5’端。确保引物中该区域序列与基因的正义链（+链）完全一致。
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结果
基于体外转录RNA的荧光素酶报告基因检测包含四个步骤：PCR扩增生成用于体外转录的DNA模板、体外转录生成mRNA、mRNA转染细胞以及荧光素酶活性检测，这些步骤如示意图（图1）所示。两种DNA模板（Fluc和Rluc）的引物设计及通用的末端延伸PCR方案如示意图（图2A）所示。PCR完成后，通过TAE琼脂糖凝胶电泳检测获得正确大小的PCR产物（图2B）。随后，将PCR产物作为模板用于体外合成RNA（图3A），RNA经纯化后通过TBE凝胶电泳验证其大小（图3B）。经纯化和验证的mRNA使用阳离子脂质转染试剂转染入细胞（图3C）。本实验方案所用引物列于表6中。
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讨论
体外转录RNA依赖的荧光素酶报告基因检测的全部四个核心步骤均对实验成功至关重要。引物设计需特别注意，尤其是T7启动子序列。T7 RNA聚合酶从位于5'-UTR序列上游的T7启动子中的第一个G（GGG-5'-UTR-AUG-）开始转录。尽管转录起始位点（TSS）位于5'端的第一个G，但若T7启动子区域中G的数量少于三个，则会导致体外转录产生的RNA产量下降。实验过程中我们观察到，经凝胶纯化的DNA产物并不适合用于体外转录，因其所得RNA的产量和质量均较低。我们仅将5-10%的PCR反应产物用于1%琼脂糖凝胶电泳以确认片段大小，其余90-95%则使用PCR纯化试剂盒进行纯化后用于体外转录。若PCR扩增出现非特异性条带，建议从凝胶中切取目标大小的条带，并使用凝胶纯化的DNA片段。由于此时DNA得率可能较低，我们建议增加体外转录反应体系的体积。与其他基于转染的方法类似，外源DNA/RNA可能激活细胞内的DNA/RNA感应通路，从而全局性或选择性地抑制翻译过程。因此，结果解读时应谨慎，尽管在我们的实验中未观察到由此类问题引发的明显干扰。
该方法适用于不同的模型系统，但需进行一些.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
该项目由美国国立卫生研究院（AI128406，www.nih.gov）资助给ZY，部分由约翰逊癌症研究中心（http://cancer.k-state.edu）以研究生暑期助学金的形式资助给PD。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2X-Q5 预混液 | New England Biolabs | M0492 | PCR 中使用的高保真 DNA 聚合酶 |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA 加帽结构类似物 | New England Biolabs | S1411L | 抗反向加帽类似物（ARCA） |
| Corning 96 孔半面积白色平底聚苯乙烯微孔板 | Corning | 3693 | 不透明白色壁 96 孔微孔板，带实底 |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1960 | 双荧光素酶检测试剂盒（DLAK） |
| E.Z.N.A. Cycle Pure 试剂盒 | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR 纯化试剂盒 |
| GloMax Navigator 微孔板荧光计 | Promega | GM2010 | 又称多功能微孔板读板仪荧光计 |
| HiScribe T7 快速高效 RNA 合成试剂盒 | New England Biolabs | E2050S | 体外转录试剂盒 |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | 阳离子脂质转染试剂 |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | 用于测定 DNA 和 RNA 浓度 |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | 低血清培养基 |
| Purelink RNA Mini 试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA 纯化试剂盒 |
| 痘苗病毒加帽系统 | New England Biolabs | M2080 | 加帽系统 |
参考文献
- Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
- Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G.
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重印与许可
