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方法文章

基于体外转录RNA的荧光素酶报告基因检测法研究痘病毒感染细胞中的翻译调控

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DOI：

10.3791/59626

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2019年5月1日

 ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University

本文内容

摘要

我们介绍一种利用体外转录RNA为基础的荧光素酶报告基因检测方法，用于研究痘病毒感​​染细胞中mRNA翻译的调控。该检测方法可用于研究mRNA的顺式作用元件（cis-elements）对翻译的调控，包括5’-非翻译区（UTR）和3’-UTR。此外，该方法也可用于分析不同的翻译起始模式。

摘要

所有在痘病毒DNA复制后转录的mRNA，其5'-UTR区域均含有一个进化上保守的、非模板来源的5'-多聚腺苷酸（5'-poly(A)）前导序列。为了剖析5'-poly(A)前导序列在痘病毒感染过程中对mRNA翻译的作用，我们开发了一种基于体外转录RNA的荧光素酶报告基因检测方法。该报告基因检测包含四个核心步骤：（1）通过PCR扩增用于体外转录的DNA模板；（2）利用T7 RNA聚合酶进行体外转录以生成mRNA；（3）转染将体外转录的mRNA导入细胞；（4）检测荧光素酶活性作为翻译水平的指标。此处描述的基于RNA的荧光素酶报告基因检测方法避免了质粒在痘病毒感染细胞中复制以及质粒上隐秘启动子转录所带来的问题。本方案也可用于研究除痘病毒感染细胞体系之外，mRNA中顺式作用元件（cis-elements）对翻译的调控作用，包括5'-UTR和3'-UTR的功能。此外，该方法还可用于探究不同的翻译起始模式，如帽依赖性翻译、非帽依赖性翻译、重新起始翻译以及内部起始翻译等。

引言

根据中心法则，遗传信息从 DNA 流向 RNA，最终传递至蛋白质1,2。这一遗传信息流在多个层面受到严格调控，包括 mRNA 的翻译过程3,4。开发用于检测基因表达调控的报告基因检测方法，将有助于深入理解该过程中涉及的调控机制。本文中，我们描述了一种利用体外转录的基于 RNA 的荧光素酶报告基因检测法，在痘病毒感染细胞中研究 mRNA 翻译的实验方案。

痘病毒包含许多对人类和动物具有高度危险性的病原体5。与其他所有病毒一样，痘病毒完全依赖宿主细胞的机制进行蛋白质合成6,7,8。为了高效合成病毒蛋白，病毒进化出多种策略，以劫持细胞的翻译机制，并将其重定向用于病毒mRNA的翻译7,8。病毒常用的一种机制是在其转录本中利用cis-作用元件。典型的例子包括内部核糖体进入位点（Internal Ribosome Entry Site, IRES）和帽非依赖性翻译增强子（cap-independent translation enhancer, CITE）9,10,11。这些cis-作用元件通过多种机制吸引翻译机器，从而使病毒转录本获得翻译优势12,13,14。已有超过100种痘病毒mRNA在其5’-非翻译区（5’-UTR）含有一个进化上保守的cis-作用元件：即位于这些mRNA最5’端的5’-poly(A)前导序列15,16。这些5’-poly(A)前导序列的长度具有异质性，是在转录过程中由痘病毒编码的RNA聚合酶滑动产生17,18。我们及其他研究者最近发现，在感染痘苗病毒（vaccinia virus, VACV）的细胞中，5’-poly(A)前导序列可赋予mRNA翻译优势，而痘苗病毒是痘病毒科的典型代表19,20。

基于体外转录RNA的荧光素酶报告基因检测最初被开发用于研究痘病毒（poxvirus）感染期间mRNA翻译过程中5’端poly(A)前导序列的作用19,21。尽管基于质粒DNA的荧光素酶报告基因检测已被广泛使用，但在痘病毒感染细胞中，该方法存在若干缺陷，会使结果解释变得复杂。首先，质粒可在VACV感染的细胞中复制22。其次，质粒DNA常发生隐匿性转录18,23,24。第三，由VACV启动子驱动的转录会产生长度不均一的poly(A)前导序列，从而在某些实验中难以控制poly(A)前导序列的长度18。基于体外转录RNA的荧光素酶报告基因检测可规避这些问题，且数据解释更为直接。

该方法包含四个关键步骤：（1）通过聚合酶链式反应（PCR）生成体外转录所需的DNA模板；（2）体外转录生成mRNA；（3）转染将mRNA递送至细胞内；（4）检测荧光素酶活性以指示翻译情况（图1）。所得PCR扩增产物从5’到3’方向依次包含以下元件：T7启动子、poly(A)前导序列或所需的5’-非翻译区（UTR）序列、编码萤火虫荧光素酶的开放阅读框（ORF），以及一段poly(A)尾。该PCR扩增产物作为模板，在T7 RNA聚合酶作用下进行体外转录以合成mRNA。在体外转录过程中，m7G帽结构或其他帽类似物会被引入新合成的mRNA中。带有帽结构的转录产物被转染至未感染或痘苗病毒（VACV）感染的细胞中。在转染后特定时间点收集细胞裂解液，用于检测荧光素酶活性，从而反映转染mRNA的蛋白质表达水平。该报告基因检测可用于研究由mRNA的5’-UTR、3’-UTR或其他区域中存在的顺式作用元件（cis-element）所介导的翻译调控。此外，基于体外转录RNA的检测方法还可用于研究多种翻译起始机制，包括帽依赖性起始、非帽依赖性起始、重新起始以及类似IRES的内部起始。

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方案

1. 通过PCR制备体外转录用DNA模板

  1. 通过PCR制备DNA模板时，需设计引物。设计引物时应考虑关键特性，如引物长度、退火温度（Tm）、GC含量、3’端以G或C结尾等。
    注意：相关细节详见以下文献25,26,27。
  2. 设计引物以扩增包含以下元件的PCR产物，方向为5’至3’：T7启动子、poly(A)前导序列、萤火虫荧光素酶开放阅读框（ORF）以及poly(A)尾，后续统称为T7_12A-Fluc。设计正向和反向引物时，应涵盖模板DNA中不存在的所有额外元件（图2A）。
    注意：所有元件的序列见表1。
  3. 在正向引物（5’-3’）中加入若干额外核苷酸28，随后依次为T7启动子、poly(A)前导序列或所需的5’-非翻译区（5’-UTR）序列，以及约20个核苷酸（根据Tm调整），对应报告基因ORF的5’端。确保引物中该区域序列与基因的正义链（+链）完全一致。
    注意：对于较长的5’-UTR，可合成两个DNA片段：一个包含T7启动子后接长片段5’-UTR，另一个包含报告基因的ORF。使用重叠延伸PCR将这两个片段连接29。
  4. 设计反向引物（5’-3’）时，应包含poly(A)尾和约20个核苷酸（根据Tm调整），对应报告基因ORF的3’端。确保引物中该区域序列与基因的反义链（-链）完全一致，并且在poly(A)尾之前存在同框的终止密码子。
    注意：可在引物中自定义poly(A)前导序列或poly(A)尾中A的数量。例如，若要在poly(A)尾中加入50个A，则反向引物应包含50个T；同理，若要在poly(A)前导序列中加入20个A，则正向引物应包含20个A。
  5. 作为内参对照，设计另一对引物，其扩增产物在5’至3’方向上包含以下元件：T7启动子、含Kozak序列的随机5’-UTR编码序列、Renilla荧光素酶ORF及poly(A)尾，后续统称为T7_Kozak-Rluc。
  6. 在PCR管中按以下顺序加入试剂：无DNA酶水、2×高保真DNA聚合酶、引物及经序列验证的荧光素酶模板DNA（表2）。
    注意：反应体系中各组分的用量应根据总体积进行相应调整。
  7. 采用标准的三步法PCR循环（变性、退火、延伸）扩增DNA模板，具体参数见表3。
    注意：退火温度X°C取决于所用引物对，延伸时间T分钟则取决于PCR扩增片段的大小及所用DNA聚合酶。
  8. 取PCR反应产物的5–10%，在含0.1 µg/mL溴化乙锭的1%琼脂糖Tris-乙酸-EDTA（TAE）凝胶上进行电泳，同时使用市售的分子量标准品作为参照。在紫外灯下观察凝胶，确定PCR产物的大小。
  9. 确认PCR产物大小正确后（T7_12A-Fluc约为1.7 kb，T7_Kozak-Rluc约为1.0 kb），使用市售的PCR产物纯化试剂盒进行纯化。用100 µL无核酸酶水洗脱DNA（图2B）。
  10. 纯化后，使用分光光度计检测DNA浓度，并测定A260/A280比值（比值在~1.8–2.0范围内可接受）。
  11. 将纯化的DNA储存于-20 °C，或立即用于体外转录。

2. 通过体外转录生成 mRNA

  1. 从PCR产物合成RNA 体外，使用体外转录试剂盒（图3A).
    注意：     T7_12A-Fluc 和 T7_Kozak-Rluc DNA 模板分别用于合成 12A-Fluc 和 Kozak-Rluc mRNA。
    1. 为此，请取一支微量离心管，并按以下顺序加入试剂：无 DNase-RNase 水、NTP 缓冲液混合物、帽类似物、模板 PCR 产物、T7-RNA 聚合酶混合物（表4).
      注意： 其他加帽系统也可用于体外转录后，按照制造商说明书对RNA进行连续加帽。
    2. 充分混匀，37 °C孵育2小时。
    3. 使用RNA纯化试剂盒对合成的RNA进行纯化。
  2. 在含0.5 µg/mL溴化乙锭的1.5%琼脂糖Tris-硼酸-EDTA（TBE）凝胶中电泳纯化的RNA以检测RNA质量。在紫外成像仪下观察凝胶图3B).
  3. 使用分光光度计检测RNA浓度，并测定A260/A280比值（可接受范围约为1.8–2.0）。
  4. 分装纯化的RNA，并于-80 °C保存。

3. 将 mRNA 转染至细胞

  1. 将HeLa细胞接种于24孔板中（次日细胞融合度约为80–90%），在37 °C、5% CO2条件下培养过夜。
  2. 用痘苗病毒（VACV）以感染复数（MOI）为5的条件感染HeLa细胞，或保留未感染的HeLa细胞作为对照。
    注意：MOI是指每个细胞所对应的感染性病毒颗粒数量。
  3. MOI为X时，每1 mL培养基中加入的病毒体积为：X = {[(细胞数量 × X) / 病毒滴度] × 1000} µl。
  4. 在预期的感染后时间点（hpi）（本实验为感染后10–12小时），使用阳离子脂质转染试剂将mRNA（每孔24孔板转染总mRNA 500 ng）转染入细胞，如图3C所示。
    1. 对于一个24孔板孔，取一个微量离心管，加入480 ng携带12A序列的萤火虫荧光素酶（12A-Fluc）mRNA和20 ng携带Kozak序列的Renilla荧光素酶（Kozak-Rluc）mRNA；另取一个微量离心管，加入1.1 µL阳离子脂质转染试剂。
    2. 向两个管中各加入55 µL低血清培养基，混匀后室温孵育5分钟。
    3. 孵育5分钟后，将含低血清培养基的55 µL阳离子脂质转染试剂加入含有mRNA的管中。
    4. 轻轻但充分混匀，室温孵育15分钟。
    5. 孵育期间，吸除细胞培养孔中的培养基，每孔24孔板加入400 µL低血清培养基。
    6. 孵育结束后，将100 µL转染混合物逐滴均匀加入一个24孔板孔中。

4. 测定荧光素酶活性

  1. 共转染12A-Fluc和Kozak-Rluc mRNA后5小时，使用能够进行双报告基因检测的荧光素酶检测试剂盒（例如双荧光素酶报告基因检测试剂盒）测定荧光素酶活性。
  2. 去除低血清培养基，并加入150 µL 1x裂解缓冲液（荧光素酶检测试剂盒的组分）裂解细胞。
  3. 室温孵育10分钟后，刮取细胞收集裂解液，转移至微量离心管中。
  4. 在4 °C条件下，以12,000 × g 离心10分钟，沉淀细胞碎片。
  5. 取30 µL上清液加入不透光的96孔白色酶标板（平底）中。
  6. 使用荧光素酶检测试剂盒和多功能酶标仪的化学发光模块测定双荧光信号。
  7. 按照表5中描述的设置，使用动力学模式（按单孔）进行检测。
    注意：也可使用手动型化学发光仪进行读数。在比色皿中加入等体积的裂解液和Fluc底物，等待2秒后，用化学发光仪测定10秒。完成Fluc检测后，迅速将比色皿从仪器中取出，手动加入等体积的Rluc底物，再次等待2秒后测定10秒。
  8. 将化学发光读数数据导出为所需的文件格式。
  9. 通过将Fluc值除以内参对照Rluc值，计算未感染和VACV感染HeLa细胞中12A-Fluc mRNA的相对翻译速率。
    注意：补充图1展示了从原始数据逐步分析获得相对Fluc活性的过程。

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结果

基于体外转录RNA的荧光素酶报告基因检测包含四个步骤：PCR扩增生成用于体外转录的DNA模板、体外转录生成mRNA、mRNA转染细胞以及荧光素酶活性检测，这些步骤如示意图（图1）所示。两种DNA模板（Fluc和Rluc）的引物设计及通用的末端延伸PCR方案如示意图（图2A）所示。PCR完成后，通过TAE琼脂糖凝胶电泳检测获得正确大小的PCR产物（图2B）。随后，将PCR产物作为模板用于体外合成RNA（图3A），RNA经纯化后通过TBE凝胶电泳验证其大小（图3B）。经纯化和验证的mRNA使用阳离子脂质转染试剂转染入细胞（图3C）。本实验方案所用引物列于表6中。

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讨论

体外转录RNA依赖的荧光素酶报告基因检测的全部四个核心步骤均对实验成功至关重要。引物设计需特别注意，尤其是T7启动子序列。T7 RNA聚合酶从位于5'-UTR序列上游的T7启动子中的第一个G（GGG-5'-UTR-AUG-）开始转录。尽管转录起始位点（TSS）位于5'端的第一个G，但若T7启动子区域中G的数量少于三个，则会导致体外转录产生的RNA产量下降。实验过程中我们观察到，经凝胶纯化的DNA产物并不适合用于体外转录，因其所得RNA的产量和质量均较低。我们仅将5-10%的PCR反应产物用于1%琼脂糖凝胶电泳以确认片段大小，其余90-95%则使用PCR纯化试剂盒进行纯化后用于体外转录。若PCR扩增出现非特异性条带，建议从凝胶中切取目标大小的条带，并使用凝胶纯化的DNA片段。由于此时DNA得率可能较低，我们建议增加体外转录反应体系的体积。与其他基于转染的方法类似，外源DNA/RNA可能激活细胞内的DNA/RNA感应通路，从而全局性或选择性地抑制翻译过程。因此，结果解读时应谨慎，尽管在我们的实验中未观察到由此类问题引发的明显干扰。

该方法适用于不同的模型系统，但需进行一些...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

该项目由美国国立卫生研究院（AI128406，www.nih.gov）资助给ZY，部分由约翰逊癌症研究中心（http://cancer.k-state.edu）以研究生暑期助学金的形式资助给PD。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2X-Q5 预混液New England BiolabsM0492PCR 中使用的高保真 DNA 聚合酶
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA 加帽结构类似物New England BiolabsS1411L抗反向加帽类似物（ARCA）
Corning 96 孔半面积白色平底聚苯乙烯微孔板Corning3693不透明白色壁 96 孔微孔板，带实底
双荧光素酶报告基因检测系统PromegaE1960双荧光素酶检测试剂盒（DLAK）
E.Z.N.A. Cycle Pure 试剂盒OMEGA BIO-TEKD6492PCR 纯化试剂盒
GloMax Navigator 微孔板荧光计PromegaGM2010又称多功能微孔板读板仪荧光计
HiScribe T7 快速高效 RNA 合成试剂盒New England BiolabsE2050S体外转录试剂盒
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019阳离子脂质转染试剂
NanoDrop2000Thermo Fisher ScientificND-2000用于测定 DNA 和 RNA 浓度
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985070低血清培养基
Purelink RNA Mini 试剂盒Thermo Fisher Scientific12183018ARNA 纯化试剂盒
痘苗病毒加帽系统New England BiolabsM2080加帽系统

参考文献

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