本实验方案采用基于探针的实时聚合酶链式反应（PCR）、磺酰罗丹明B（SRB）检测、3’非翻译区（3’ UTR）克隆以及荧光素酶检测，以验证特定miRNA的靶基因并研究miRNA的功能。
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摘要
摘要
微小RNA（miRNA）是一类小分子调控性RNA，已被证实可在多种疾病（包括癌症）中调节众多细胞内信号通路。这些小分子调控性RNA主要与其靶标信使RNA（mRNA）的3’非翻译区（3’ UTR）相互作用，最终导致mRNA翻译过程受抑以及靶标mRNA降解增强。根据其表达水平和细胞内功能，miRNA可作为癌基因或抑癌基因mRNA的调控因子。在数百甚至数千个通过计算预测出的潜在靶基因中，鉴定出某个miRNA的真实靶基因，是阐明该miRNA功能及其基本分子机制的关键步骤。目前已有多种miRNA靶基因预测程序可用于搜索可能的miRNA-mRNA相互作用。然而，最具挑战性的问题是如何验证某个miRNA的直接靶基因。本实验方案描述了一套可重复的关键方法策略，用于鉴定与miRNA功能相关的靶基因。本方案提供了一个实用的操作指南，逐步介绍如何利用基于探针的实时聚合酶链式反应（PCR）、转染miRNA模拟物后的磺酰罗丹明B（SRB）检测、剂量-反应曲线绘制、荧光素酶报告基因检测，以及目的基因3’ UTR的克隆等技术，揭示miRNA的表达水平、功能及其相关靶mRNA，从而全面理解特定miRNA的生物学作用。
引言
microRNA（miRNA）是一类小型调控性RNA，主要通过与靶基因的3’非翻译区（3’ UTR）相互作用，调节信使RNA（mRNA）的翻译过程及其降解1。miRNA的表达可受到转录水平和转录后水平机制的调控。此类调控机制的失衡会导致多种疾病（包括癌症）中miRNA表达水平的异常和特异性改变2。单个miRNA可与多种不同的mRNA发生相互作用，相应地，单个mRNA也可受到多种miRNA的共同调控。因此，细胞内信号网络受到特异性表达的miRNA的复杂影响，从而可能引发并加剧生理紊乱和疾病进程2,3,4,5,6。尽管已在多种癌症中观察到miRNA表达的改变，但调控癌细胞行为并与miRNA相互关联的分子机制在很大程度上仍不清楚。
越来越多的证据表明，miRNA 的致癌或抑瘤作用取决于癌症的类型。例如，miR-155 通过靶向叉头框 O3（FOXO3）促进结直肠癌的细胞增殖、转移和化疗耐药性7,<....
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方案
1. 成熟微小RNA（miRNA）表达分析
- 成熟 miRNA 互补 DNA (cDNA) 的合成
- 取 254 ng 总 RNA 和 4.5 µL 脱氧核糖核酸酶 I (DNase I) 混合液，然后加入超纯水至 PCR 条形管中，总体积为 18 µL（图 2A）。根据反应总数，使用足量的 DNase I 混合液，为从多个细胞系中提取的每种总 RNA 样品准备反应体系。
注意： DNase I 混合液由 DNase I (1.8 µL)、核糖核酸酶抑制剂 (0.3 µL) 和 25 mM MgCl2 (2.4 µL) 组成。为可重复地获取总 RNA，采用基于柱的提取方法，而非酚-氯仿提取方法。已有报道指出，当使用酚-氯仿提取方法时，某些 miRNA 的提取得率可能因细胞数量不同而有所变化11,12。 - 将管子置于热循环仪中孵育。在 37 °C 下孵育 10 分钟，然后在 90 °C 下孵育 5 分钟以热失活 DNase I。孵育后立即将管子置于冰上。
- 将 7.1 µL 经 DNase I 处理的总 RNA 转移至两组新管中，然后每管加入 1.5 µL 针对甘油醛-3-磷....
- 取 254 ng 总 RNA 和 4.5 µL 脱氧核糖核酸酶 I (DNase I) 混合液，然后加入超纯水至 PCR 条形管中，总体积为 18 µL（图 2A）。根据反应总数，使用足量的 DNase I 混合液，为从多个细胞系中提取的每种总 RNA 样品准备反应体系。
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结果
成功且准确地验证miRNA水平对于数据解读至关重要，这使得能够根据miRNA在疾病发生和发展中预期发挥的作用对其进行分类。采用基于探针的定量PCR法，在三种胰腺细胞系中检测了miRNA-107和miRNA-301的表达水平。在同一反应中同步合成特定miRNA和参考基因的cDNA，可提高数据的可重复性。PANC-1和CAPAN-1为人源胰腺导管腺癌细胞系，而HPNE是通过携带人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的逆转录病毒表达载体转导而获得的永生化胰腺导管细胞系。与HPNE细胞相比，PANC-1和CAPAN-1细胞中miRNA-107显著降低（图2C）。与HPNE细胞相比，PANC-1和CAPAN-1细胞中miRNA-301的表达水平显著上调。这些结果与先前报道一致：miRNA-107在胰腺癌细胞中存在表观遗传学失活，而miRNA-301在胰腺导管腺癌细胞中的表达水平高于正常胰腺导管细胞16,17。
3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-.......
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讨论
确定具有特定miRNA功能的真实靶基因的策略对于理解miRNA的多种作用至关重要。鉴定miRNA的靶基因有助于解读miRNA在细胞内调控的细胞信号事件。揭示miRNA功能上重要的靶基因可为开发基于miRNA的癌症治疗方案提供基础性知识。
多种方法可用于检测细胞系和组织中分离的总RNA的miRNA表达水平，例如微阵列、小RNA文库测序、深度测序、逆转录酶原位PCR以及Northern印迹法24,25,26。对miRNA进行高通量表达谱分析，有助于深入理解癌症发生背后的遗传机制。基于探针的miRNA检测方法常用于验证表达谱数据，也适用于对少数感兴趣的miRNA进行筛选。然而，利用基于探针的实时PCR检测成熟miRNA水平时，其应用受限于无法判断成熟miRNA的调控是发生在转录阶段，还是通过成熟过程的调控实现的。基于染料的实时PCR和Northern印迹法已被用于检测miRNA前体的水平
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由韩国国家研究基金会（NRF）通过教育部门资助的基础科学研究中心项目（2017R1D1A3B03035662）以及2017年汉阳大学研究基金（HRF-201703-003）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 锥形管 | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24 孔板 | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL 锥形管 | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6 孔板 | Falcon | 353046 | |
| 6x DNA 上样染料 | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8 孔联排管盖 | Applied Biosystems | N8010535 | 用于 cDNA 合成 |
| 8 孔联排管 | Applied Biosystems | N8010580 | 用于 cDNA 合成 |
| 96 孔板 | Falcon | 353072 | |
| 乙酸 | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| 琼脂糖 A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| 碱性磷酸酶 | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| 氨苄青霉素 | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 孔联排管 | Agilent Technologies | 401493 | 用于实时 PCR |
| AriaMx 实时 PCR 系统 | Agilent Technologies | G8830A | qPCR 扩增、检测和数据分析 |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 单位/mL |
| CAPAN-1 细胞 | ATCC | HTB-79 | |
| 细胞培养罩 | Labtech | 型号：LCB-1203B-A2 | |
| 带 V 型槽的计数室 | Paul Marienfeld | 650010 | 细胞计数器 |
| CutSmart 缓冲液 | New England Biolabs | B7204S | 10X 浓度 |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA 凝胶回收试剂盒 | Bionics | DN30200 | 200 次制备 |
| DNA Marker | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb DNA Marker |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 单位 |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 | 100 次检测 |
| 胎牛血清 | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT 感受态细胞 | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | 感受态细胞 |
| HPNE 细胞 | ATCC | CRL-4023 | |
| LB 琼脂培养基 | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| 荧光检测仪 | Promega | 型号：E5311 | |
| 微量离心管 | Eppendorf | 22431021 | |
| 酶标仪 | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA 阴性对照模拟物 | Ambion | 4464058 | 5 nmol |
| miRNA-107 模拟物 | Ambion | 4464066 | 5 nmol |
| miRNeasy Mini 试剂盒 | Qiagen | 217004 | 50 次制备 |
| Mupid-2plus（电泳系统） | TaKaRa | 型号：AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 单位/mL |
| Oligo explorer 程序 | GeneLink | 用于引物设计 | |
| 光学管条盖（8 孔联排） | Agilent Technologies | 401425 | 用于实时 PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 mL |
| PANC-1 细胞 | ATCC | CRL-1469 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| 质粒 DNA 小量提取 S&V 试剂盒 | Bionics | DN10200 | 200 次制备 |
| PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶 | TaKaRa | R050A | 250 单位 |
| 摇床 | TECAN | 振荡平台 | |
| 摇床培养箱 | Labtech | 型号：LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 软件 | Systat Software Inc | 用于剂量-反应曲线生成 | |
| 磺基罗丹明 B 粉末 | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR Green 预混液 | Smobio | TQ12001805401-3 | 双链 DNA 结合荧光染料 |
| T4 DNA 连接酶 | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan 预混液 | Applied Biosystems | 4324018 | 200 次反应，不含 AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-107） | Applied Biosystems | 4427975 | 检测编号：000443（50 次 RT，150 次 PCR 反应） |
| TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-301） | Applied Biosystems | 4427975 | 检测编号：000528（50 次 RT，150 次 PCR 反应） |
| TaqMan miR RT 试剂盒 | Applied Biosystems | 4366597 | 1,000 次反应 |
| Thermo CO2 培养箱（BB15） | ThermoFisher Scientific | 37 °C 和 5% CO2 培养 | |
| 三氯乙酸 | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma 碱 | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| 超纯水 | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 孔梯度 PCR 仪 | Applied Biosystems | 用于 DNA（或 cDNA）扩增 | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 单位/mL |
参考文献
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Mole....
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