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方法文章

从小鼠多个器官中分离与定量寨卡病毒

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DOI：

10.3791/59632

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2019年8月15日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Saint Louis University, 2School of Veterinary Medicine University of California Davis

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验方案的目的是通过从感染小鼠的多个器官中分离和定量寨卡病毒，展示研究病毒性疾病的常用技术。

摘要

本文介绍的方法展示了从寨卡病毒感染动物中分离器官并定量病毒载量的实验操作流程。该实验的目的是在感染后不同时间点或不同实验条件下，定量小鼠外周组织和中枢神经系统（CNS）区域的病毒滴度，以鉴定调控寨卡病毒感染的病毒学和免疫学因素。所展示的器官分离方法可用于焦点形成实验（focus forming assay）定量和定量PCR检测病毒滴度。快速器官分离技术旨在保持病毒滴度的稳定性。通过焦点形成实验进行病毒滴度定量，可实现对寨卡病毒的高通量快速评估。该方法的优势在于能够检测具有感染性的病毒，其局限性在于器官毒性可能影响检测下限。病毒滴度的评估结合了定量PCR技术，并利用重组RNA拷贝数对照，可在器官内以较低的检测下限测定病毒基因组拷贝数。总体而言，这些技术为分析寨卡病毒感染动物外周组织和中枢神经系统中的病毒滴度提供了准确、快速且高通量的方法，也可应用于大多数病原体（包括登革病毒）感染动物器官中病毒滴度的评估。

引言

寨卡病毒（ZIKV）是一种属于黄病毒科（flaviviridae）的虫媒病毒，该科还包括波瓦森病毒（Powassan virus, POWV）、日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）和西尼罗河病毒（West Nile virus, WNV）等重要的人类神经侵袭性病原体1。自该病毒被分离和鉴定以来，非洲和亚洲地区已陆续有零星的人类ZIKV感染病例报道2,3,4,5，以及在中美洲和南美洲暴发的流行疫情（详见参考文献6）。然而，直到最近人们才认为ZIKV可导致严重疾病7。目前已有成千上万例神经系统疾病和先天性出生缺陷病例被证实与ZIKV感染相关。ZIKV的迅速出现引发了许多亟待解答的问题：为何疾病严重程度有所增加？机体对ZIKV感染的免疫应答如何？是否存在病毒本身或免疫介导的病理机制，导致神经系统症状和出生缺陷的增加？在此背景下，人们迫切需要深入了解ZIKV相关的中枢神经系统（CNS）疾病，并快速评估抗病毒药物和疫苗对ZIKV的有效性。为此，我们建立了利用ZIKV特异性焦点形成实验（focus forming assay, FFA）快速分析外周和中枢神经系统中ZIKV滴度的方法。

小型动物模型对于理解疾病进展以及疫苗、治疗药物和抗病毒药物的早期评估具有重要意义。我们已建立用于研究虫媒病毒感染的小型动物模型，通过使用多种小鼠品系来模拟人类感染及对病毒病原体的免疫保护作用8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22。基于这些前期经验，我们开始改进以往用于西尼罗病毒（WNV）和登革病毒（一种相关的黄病毒）滴度检测的技术，以适用于寨卡病毒（ZIKV）在外周器官及中枢神经系统（CNS）中的病毒滴度评估21,23,24。这些方法相较于其他检测手段的优势在于：1）能够同时采集外周组织和中枢神经系统器官进行分析；2）该方法可适用于流式细胞术，可在同一只动物的同一器官中同时检测先天性和适应性免疫应答以及病毒滴度；3）组织采集技术可适配于组织学分析；4）ZIKV FFA 是一种快速、高通量的病毒滴度分析方法；5）这些方法可广泛应用于大多数病原体感染动物各器官中病毒滴度的评估25。

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方案

本研究的所有操作均遵循圣路易斯大学动物护理与使用委员会制定的指南。圣路易斯大学已获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）的全面认证。

1. 器官分离

注意：病毒在室温（RT）下不稳定，因此必须谨慎规划单次收获动物的数量，以保持病毒滴度。

  1. 根据所需表型，选择适当的剂量和途径感染小鼠。本方案中，使用8-10周龄的雄性和雌性I型干扰素受体缺陷（Ifnar1-/-）C57BL/6小鼠进行感染。
    1. 使用氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物对Ifnar1-/-小鼠进行麻醉。通过用力捏脚趾测试足底反射，以确认麻醉效果。通过足垫皮下（SC）注射50 μL含1 × 105个感染灶形成单位（FFU）的寨卡病毒（ZIKV）。
  2. 在收获前一天准备好所有所需材料：2把剪刀、镊子，以及装有20 mL 70%乙醇（EtOH）的50 mL锥形管，用于工具消毒。
    1. 准备注射器和针头：用于灌注的20 mL注射器、23 G针头（约每笼1个），以及带25 G针头的1 mL注射器（每3-5只小鼠1个）。在称重前，在生物安全柜中向1.5 mL带O型圈的螺口管中加入钢珠（每种器官各一个）。这些管子需适用于组织匀浆。
  3. 在收获当天，准备好灌注和器官冷冻所需的材料。
    1. 用干冰和70%乙醇填充冰桶，制成冰浴。准备无菌磷酸盐缓冲液（PBS），预计每只小鼠灌注需25-30 mL PBS（脊髓需5-10 mL）。准备麻醉剂（氯胺酮和赛拉嗪混合物），每只小鼠约需300 μL。将所有材料以及流式细胞术等所需的额外试管放入次级容器中，以便运输至动物设施。
  4. 进入和离开动物设施时，遵循所有必要的操作程序，包括穿戴和脱卸个人防护装备。
    注意：所有操作必须在生物安全二级实验室（BSL-2）内的认证生物安全柜中进行。
  5. 根据动物的大小和体重，经腹腔注射200-500 μL麻醉剂。若单独操作，应逐只麻醉，以避免在器官收获前导致动物死亡。
    1. 用镊子捏脚趾以检测足底反射，确认麻醉效果。若动物仍有反应，则不得继续操作。使用图钉将小鼠固定在蜡板上。此时，用70%乙醇浸湿小鼠体表，以防止在器官收获过程中毛发污染。
  6. 通过心脏穿刺进行终末放血。
    1. 使用剪刀和镊子切开胸腔暴露心脏，通过心脏穿刺采集血液（约800 µL）。该血液可用于多种检测，包括临床化学、血液学、流式细胞术检测抗原特异性反应，以及实时定量PCR（qRT-PCR）分析病毒拷贝数。
    2. 若需通过qRT-PCR分析病毒RNA，提取全血RNA时应将血液收集至EDTA管中，提取血清RNA时则收集至微量离心管中（对于血清，将管子在室温下以最大转速离心20分钟，然后将血清转移至另一管中）。完成血清样本处理后，加入线性聚丙烯酰胺作为载体。RNA可立即分析，或储存于-80 °C以备后续处理。
  7. 用室温（或37 °C）的PBS填充20 mL注射器，通过将蝴蝶针插入左心室对小鼠进行灌注。穿刺右心房以使血液和PBS流出。缓慢注入PBS，同时观察肝脏颜色变化，以确认小鼠已完全灌注。肝脏颜色应由深红色变为粉红色鲑鱼色。
    1. 若器官用于组织学制备，保持蝴蝶针原位，随后用20 mL冰冻的4%多聚甲醛进行灌注。此时，可将注射器连接至三通阀，两个注射器均连接于其上，交替使用PBS和PFA时切换阀门开关。
  8. 将器官收获至已标记并称重的试管中。对于外周器官，按既定顺序收获：肝脏、脾脏、肾脏和肺脏。
    1. 仅取肝脏的一个叶，具体哪一叶不限，但在所有实验中应尽量取相同大小的同一叶。同样，对于肾脏和肺脏，也应始终取相同的肾脏和肺叶。若还需进行流式细胞术，可将任一器官切成两半。将用于细胞术的一半组织置于室温的罗斯韦尔帕克纪念研究所培养基（RPMI）中，直至收获完成。
    2. 收获后立即把每个器官放入已标记的试管中，并置于干冰浴中。病毒滴度在室温下会随时间下降，因此器官收获所需时间极为重要。各小鼠之间必须保持一致，因此在确保安全的前提下，速度是第二优先事项。
      注意：若收获器官用于测定病毒滴度，此时由第二人同时收获脑组织将非常有助于保持病毒滴度。
  9. 从小鼠体腔中移除其余器官，以暴露脊柱和颅骨。
    1. 将小鼠从蜡板上取下，去除毛皮，随后剪除四肢。
      ​使用钝头或手术剪进行断头，再用锯齿状LaGrange剪从枕骨大孔处剪开颅骨以收获脑组织。然后用镊子剥离颅骨，用刮勺取出脑组织。
    2. 使用坚固的钝头剪刀去除肋骨及其他环绕脊柱的骨骼。随后横向剪断骨盆，暴露腰段椎管。此时应可见脊髓末端的小突起。
    3. 使用装有PBS的10 mL注射器和18 G针头，在培养皿上方从腰段向颈段“冲洗”脊髓，将其推出。
    4. 小心将针头斜面插入椎管内，避免施加过大压力，以防针头穿透椎体。牢固握住以对椎体和针头施加压力，推动注射器活塞以推出脊髓。立即转移脊髓至已标记的试管中，并放入干冰浴中。
  10. 对所有动物重复上述操作直至收获完成。在每只动物之间，将使用过的工具放入70%乙醇中消毒。操作中应注重一致性和速度。各器官收获间隔时间应保持一致，以避免对病毒滴度结果造成偏差。
  11. 操作结束后，在将材料移出动物设施前，对生物安全柜及所有物品进行消毒。
  12. 从冰浴中取出每支试管，称重以确定器官重量。器官重量通过从含器官试管的总重量中减去空管重量获得。
    注意：此时器官可直接于-80 °C冷冻以备后续处理，或立即匀浆后分装冷冻。反复冻融会降低病毒滴度。因此，在同一项目的所有实验中，必须采用相同的操作流程。

2. 器官匀浆

  1. 为每个待匀浆的器官准备3个带标签的1.5 mL螺口管。
  2. 若样品在收获后不能立即进行匀浆处理，需将离心管从 -80 °C 取出。样品无需解冻即可进行匀浆。
  3. 将样品置于冰上以保持低温，尽量减少病毒滴度损失。然后，向每个含有器官的离心管中加入1 mL含5% FBS的冷DMEM。
  4. 立即按照制造商说明在珠磨机中振荡离心管。使用钢珠在珠磨匀浆仪中对所有器官组织进行匀浆。检查以确保每个器官组织均已完全匀浆。
  5. 在微型离心机中以12,000 x g离心，沉淀组织碎片 g 在已预冷至 8 °C 的微量离心机中离心 5 分钟。然后将离心管放回冰桶中。在生物安全柜内，将样品分装至用于必要检测的离心管中。随后将离心管再次放回冰桶中。
  6. 进行焦点形成实验时，将500 µL分装至已标记的离心管中，然后将离心管置于装有冰块的试管架上。另取50 µL分装至用于RNA提取的离心管中，以进行荧光定量反转录PCR（qRT-PCR）检测病毒基因组拷贝数。
  7. 使用商业RNA提取试剂盒从感染动物的器官中分离总RNA。采用针对寨卡病毒（ZIKV）的特异性引物和探针组检测黄病毒属病毒RNA，该引物探针组可识别每种黄病毒基因组中的特有序列。使用含有已知拷贝数的阳性单链RNA的拷贝数对照质粒来确定病毒拷贝数，该RNA通过含有ZIKV靶序列的T7聚合酶体外转录生成。
  8. 将剩余的约 300 µL 样品分装至第三根试管中，必要时于 -80 °C 保存。
    注意： 若样本此前未经过冷冻，请在 -80 °C 下冷冻。若样本此前已冷冻，则直接进行焦点形成实验和/或RNA提取。 在停止之前.

3. 寨卡病毒焦点形成实验26

注意：必须设置无病毒对照和阳性对照。阳性对照为已知浓度的病毒原液的系列稀释样本。所有对照不必置于同一块培养板上，但当检测板数超过5块时，应增加对照数量，并将其均匀分布在各板之间。操作时需注意避免移液器吸头或剧烈洗涤对单层细胞造成划伤。多个器官样本可在同一天或不同天进行滴定，但单个器官样本不应跨多天检测，因为不同的检测条件可能影响病毒滴度。强烈建议在同一天内完成单个器官样本的检测。

  1. 在进行检测的前一天，准备好焦点形成检测所需的细胞和试剂。
    1. 准备生长培养基，其中包含500 mL DMEM、5 mL HEPES和25 mL FBS。在检测开始前，将Vero-World Health Organization（WHO）细胞在37 °C、5% CO2条件下于生长培养基中培养。在检测开始前，Vero细胞不应为高代次细胞，且不得曾生长至超过100%汇合度。
    2. 通过高压灭菌制备500 mL 2%甲基纤维素溶液：将10 g甲基纤维素和一个大搅拌子放入1 L玻璃培养瓶中，另取一个1 L玻璃培养瓶加入500 mL H2O，分别进行高压灭菌。若灭菌后的水已冷却，可重新用微波炉加热至瓶壁触手温热但未沸腾。
    3. 在生物安全柜中，将温热/热水轻轻倒入装有甲基纤维素的瓶中。瓶口部分盖紧，在加热板上搅拌直至甲基纤维素完全溶解（1–4小时）。将2%甲基纤维素溶液分装至无菌50 mL锥形管中。2%甲基纤维素溶液可于4 °C保存，直至使用。
    4. 用PBS配制5%多聚甲醛溶液，用于固定培养板，并于4 °C保存备用。通过向PBS中加入0.05% Triton X-100制备1×焦点形成检测洗涤缓冲液，并于室温保存。通过向PBS中加入1 mg/mL皂苷制备1× FFA染色缓冲液，并于4 °C保存备用。这些缓冲液可提前一至两周配制。
  2. 计算检测所需的平底96孔板数量，确保每个器官样本设置三个复孔，并额外预留足够的孔用于阳性和阴性对照。
    1. 在生长培养基中培养足够数量的Vero细胞以完成设计的检测。用胰酶消化Vero细胞，重悬于生长培养基中，调整细胞密度为1.5 × 105 个细胞/mL。向平底96孔板中每孔加入200 µL细胞悬液，使每孔含有3.0 × 104 个Vero-WHO细胞。
    2. 将培养板置于37 °C、5% CO2条件下过夜培养，确保培养板在孵育器中保持水平，使细胞在孔内均匀分布。
      注意：各实验室培养Vero细胞的条件略有不同；目标是在寨卡病毒检测当天，每孔形成90–95%汇合的单层细胞。
  3. 在检测当天稀释寨卡病毒样本。若器官样本此前已均质化，从-80 °C冰箱中取出样本，待其解冻后置于冰上备用。
    1. 在冰上操作，向圆底96孔板的B至H行每孔加入180 µL冷生长培养基，A行留空。向圆底板A行每孔加入150 µL均质化后的器官样本。
    2. 使用多通道移液器对各样本进行10倍系列稀释。在圆底96孔板中，将20 µL样本加入180 µL生长培养基中进行稀释，每次稀释均需更换移液器吸头。
  4. 通过移除覆盖Vero细胞的平底96孔板中的培养基来准备焦点形成板。此操作应紧接在加病毒样本前进行，以防止单层细胞干燥。
    1. 向Vero细胞板的每孔加入100 µL病毒稀释液。使用同一组吸头，从最低浓度向最高浓度依次加样。轻轻左右摇动培养板2–4次，注意避免产生涡流。
    2. 在37 °C、5% CO2条件下孵育1–2小时。确保培养板在孵育器中保持水平。孵育期间将2%甲基纤维素溶液升温至室温。
    3. 用生长培养基稀释2%甲基纤维素溶液，稀释比例约为2份2%甲基纤维素与1份生长培养基。保持室温直至使用。向96孔板每孔加入1–2滴（设定移液器为125 µL）甲基纤维素-生长培养基混合液。
    4. 在37 °C、5% CO2条件下孵育32–40小时。由于不同实验室的Vero细胞生长速度存在差异，且细胞汇合度和寨卡病毒毒株等因素可能影响孵育时间，需根据实际情况调整。
  5. 使用预先配制的5%多聚甲醛溶液固定Vero细胞。
    1. 在生物安全柜中，向每孔甲基纤维素层上方加入50 µL 5%多聚甲醛溶液，在室温下孵育60分钟。固定过程也可在4 °C过夜进行，但需用封口膜覆盖培养板以减少蒸发。
    2. 在生物安全柜内将覆盖层和培养基倾倒至废液容器中。用PBS轻柔洗涤，每孔150 µL。吸除PBS后，将培养板移出BSL-2实验室。
    3. 重复PBS洗涤两次，每次每孔加入150 µL。吸除PBS后，每孔加入150 µL 1× FFA洗涤缓冲液，在室温下孵育5–10分钟以通透固定后的细胞。
  6. 使用一抗检测感染。将一抗4G2（D1-4G2-4-15）用FFA染色缓冲液稀释至1 μg/mL。为整个检测准备足量抗体。
    注意：避免使用实验室用纸尿裤或其他易掉纤维的吸水材料，因其纤维会影响焦点成像。
    1. 从培养板中移除FFA洗涤缓冲液。每孔加入50 µL用FFA染色缓冲液稀释的一抗。用封口膜密封培养板，在4 °C摇床上过夜孵育。也可在室温下孵育2小时完成检测。
  7. 通过加入HRP标记的二抗可视化感染。将二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体）用FFA染色缓冲液按1:5,000比例稀释。为整个检测准备足量抗体。
    1. 用FFA洗涤缓冲液洗涤细胞3次，每次轻弹至水槽中弃去洗涤液。每孔加入50 µL用FFA染色缓冲液稀释的二抗，在室温下孵育1–2小时。
    2. 用FFA洗涤缓冲液洗涤细胞3次，每次轻弹至水槽中弃去洗涤液。每孔加入50 µL TrueBlue底物溶液。
    3. 密切观察培养板，等待2–15分钟，直至斑点清晰且背景最低。斑点显现后，用清水轻柔冲洗，用手遮挡单层细胞以避免水流冲击。用纸巾轻拍干燥（切勿使用纸尿裤），并尽快成像。
    4. 斑点可手动计数或使用自动斑点计数器进行计数。若手动计数，可使用解剖显微镜辅助观察。
    5. 对每个样本，选择焦点清晰可辨（例如每孔20至200个）的稀释度，根据双复孔的平均值计算每毫升焦点形成单位（FFU/mL）的滴度：FFU/mL =（每孔平均焦点数）×（稀释倍数）÷（接种体积，mL）。

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结果

为了使用上述方案评估寨卡病毒（ZIKV）滴度，通过皮下（SC）注射足垫的方式使 Ifnar1-/- 小鼠感染 ZIKV（PRVABC59）。在此，对 8 至 12 周龄的 Ifnar1-/- 小鼠皮下注射 1 × 105 FFU 的 ZIKV 不会导致死亡，但病毒可在外周和中枢神经系统（CNS）中复制。该剂量和给药途径常用于研究宿主与病原体之间的免疫应答及致病性。对 8 至 12 周龄的 Ifnar1-/- 小鼠进行静脉（IV）注射 1 × 105 FFU 的 ZIKV，则致死率为 80% 至 100%，动物通常在病毒感染后 8 至 14 天内死亡。我们常规使用该给药途径来评估抗病毒药物和治疗手段的有效性，以及进行临床前疫苗候选物的测试。

取四只10至12周龄的Ifnar1...

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讨论

寨卡病毒（ZIKV）感染可导致神经系统疾病，因此目前用于研究其致病机制、免疫反应以及疫苗和抗病毒药物保护效果的动物模型，需要重点关注中枢神经系统（CNS）内的病毒控制。聚焦于CNS疾病的一个挑战在于，这往往以牺牲对外周感染的研究为代价。本文提出的器官分离方法旨在满足快速评估ZIKV在外周和中枢神经系统中感染状况的需求，以评估由CNS介导的ZIKV相关疾病，并建立用于抗病毒药物、治疗手段和疫苗临床前测试的模型。该技术的另一优势在于具有高度灵活性，可同时用于研究针对ZIKV的免疫学反应或感染的组织病理学分析。此技术不仅限于ZIKV研究，还可广泛应用于多种宿主-病原体相互作用的研究，包括登革病毒等黄病毒属病毒21、猴痘病毒和鼠痘病毒等正痘病毒属病毒。该器官采集技术的主要注意事项和局限性主要取决于实验操作者的技能水平。由于ZIKV在室温下长时间不稳定，灌注后器官采集所花费的时间会显著影响实验结果的质量。在我们开展的大多数实验中，通常比较两种处理条件下小鼠的病毒滴度，因此我们更注重各器官采集之间时间的一致性，而非操作速度。为此，整个实验由同一人完成相同操作，以确保一致性。该操作的另一项重要考虑因素是...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

Pinto博士的研究资金来自圣路易斯大学医学院的种子基金和圣路易斯大学医学院的启动资金。Brien博士的研究资金来自美国国立卫生研究院国家过敏与传染病研究所（NIH NIAID）的K22AI104794早期研究者奖，以及圣路易斯大学的种子基金。对于所有获得资助的个人，资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-溴-3-氯丙烷（BCP）MRC geneBP151
10 cc 注射器Thermo Fisher ScientificBD 309642
18 G 针头Thermo Fisher Scientific22-557-145
1 cc TB 注射器Thermo Fisher Scientific14-823-16H
20 cc 注射器Thermo Fisher Scientific05-561-66
24 孔珠磨机Thermo Fisher Scientific15 340 163
3.2 mm 不锈钢珠Thermo Fisher ScientificNC9084634
37 °C 组织培养孵育箱Nuair5800
4G2 抗体in house
96 孔平底板MidsciTP92696
96 孔圆底板MidsciTP92697
Basix 1.5 mL 离心管Thermo Fisher Scientific02-682-002
浓缩杀菌漂白剂Staples30966CT
CTL S6 分析仪CTLCTL S6 Universal Analyzer
弯头剪刀Fine Science Tools14061-11
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 - 高糖，含 4,500 mg/L 葡萄糖MilliporeSigmaD5671
乙醇（分子生物学级）MilliporeSigmae7023
胎牛血清MilliporeSigmaF0926-500ML
镊子Fine Science Tools11036-20
冰醋酸MilliporeSigma537020
山羊抗小鼠 HRP 标记抗体MilliporeSigma8924
HEPES 1 MMilliporeSigmaH3537-100ML
异丙醇（分子生物学级）MilliporeSigmaI9516
氯胺酮/赛拉嗪混合液Comparative Medicine
L-谷氨酰胺MilliporeSigmag7513
Magmax RNA 纯化试剂盒Thermo Fisher ScientificAM1830
甲基纤维素MilliporeSigmaM0512
微量离心机Ependorf5424R
MiniCollect 0.5 mL EDTA 管Bio-one450480
O型圈管Thermo Fisher Scientific21-403-195
一步法 q RT-PCR 混合液Thermo Fisher Scientific4392938
多聚甲醛Thermo Fisher ScientificEMS- 15713-S
磷酸盐缓冲液MilliporeSigmad8537-500ml
Proline 多通道移液器Sartorius72230/72240
Proline 单通道移液器Sartorius728230
无RNA酶水Thermo Fisher Scientific10-977-023
RNAzol BDMRC geneRB192
摇床平台Thermo Fisher Scientific11-676-333
RPMI 1640FisherMT10040CV
皂苷MilliporeSigmas7900
药匙/刮勺Fine Science Tools10090-17
直头剪刀Fine Science Tools14060-11
Triton X-100MilliporeSigmat8787
True Blue 底物VWR95059-168
胰蛋白酶MilliporeSigmaT3924-100ML

参考文献

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