从小鼠多个器官分离和定量寨卡病毒

Summary

该协议的目的是通过分离和量化寨卡病毒,从感染后小鼠的多个器官中分离和量化,来展示用于调查病毒性疾病的技术。

Abstract

提出的方法展示了从寨卡病毒感染动物中分离器官和定量病毒载量的实验室程序。该程序的目的是量化小鼠在感染后不同时间点或不同实验条件下的周围和中枢神经系统区域的病毒性色度,以确定调节寨卡病毒感染的病毒学和免疫学因素。所演示的器官分离程序允许对病毒性定位剂进行焦点形成测定定量和定量PCR评估。快速器官分离技术是为保存病毒性皮炎而设计的。通过聚焦形成测定对病毒进行量度定量,可快速评估寨卡病毒的通量。重点形成测定的好处是评估传染性病毒,这种测定的局限性是降低检测极限的器官毒性的潜力。病毒性排名评估与定量PCR相结合,使用重组RNA拷贝控制病毒基因组拷贝数在器官内评估检测限值低。总体而言,这些技术为分析寨卡病毒感染动物的外围寨卡病毒分子和中枢神经系统提供了准确的快速高通量方法,并可用于评估大多数感染动物器官中的病毒性定子病原体,包括登革热病毒。

Introduction

寨卡病毒(ZIKV)是一种属于浮病毒家族的病毒,包括重要的神经侵入性人类病原体,如波瓦桑病毒(POWV)、日本脑炎病毒(JEV)和西尼罗病毒(WNV)1。在隔离和鉴定后,^{非洲和亚洲定期}报告人类ZIKV感染2、3、4、5和中美洲和南美洲的流行病(在参考⁶。然而,直到最近,ZIKV才被认为会导致严重的疾病7。现在有成千上万的神经系统疾病和出生缺陷与ZIKV感染有关。ZIKV的迅速出现引发了许多问题:为什么疾病严重程度增加,对ZIKV感染的免疫反应是什么,以及是否有病毒和/或免疫介导的病理与神经学的增加有关表现和先天缺陷。现在人们急于了解与ZIKV相关的中枢神经系统(CNS)相关疾病,以及快速测试抗病毒药物和疫苗对ZIKV的疗效的必要性。正是在这种背景下,我们开发了使用ZIKV特定焦点形成测定(FFA)对外围和CNS中ZIKV定子进行快速分析的方法。

小型动物模型对于了解疾病进展和早期评估疫苗、治疗和抗病毒药物非常重要。我们已经建立了研究阿尔博病毒病的小动物模型,利用各种小鼠菌株来模拟人类感染,并保护病毒病原体8,9,10,11, ^{12,13,14,15,16,17,18,19,20 21,22}.利用这个以往的经验,我们开始修改用于评估WNV和登革热病毒的技术,这是一种相关的黄病毒,用于评估两个外围器官的ZIKV丁打剂以及CNS^21、2324.这些方法比其他测定的优点是:1) 它们结合收集外周和CNS器官进行分析的能力;2) 该方法适用于流式细胞测定,用于测量先天和适应性免疫反应,以及同一器官中同一动物的病毒定子;3)收获技术适用于组织学分析;4)ZIKV FFA是一种快速的高通量方法,用于病毒性皮底分析;5)这些方法可用于评估感染大多数病原体的动物器官中的病毒性定^子25。

Protocol

本研究的所有程序均符合圣路易斯大学动物护理和使用委员会制定的指导方针。SLU 获得国际实验室动物护理评估与认证协会 (AAALAC) 的完全认可。

1. 器官隔离

注:病毒在室温 (RT) 下不稳定,因此必须仔细规划一次收获的动物数量,以保存病毒性定位剂。

1. 根据所需的表型,使用所选剂量和路线感染小鼠。对于此方案,感染8-10周大的雄性与雌性I型干扰素受体缺陷(Ifnar1-/-)C57BL/6小鼠。
   1. 麻醉Ifnar1^-/-小鼠与氯胺酮(90毫克/千克)和西拉津(10毫克/千克)的鸡尾酒。测试踏板反射由坚定的脚趾捏,以确认麻醉。通过脚垫在 50 μL 皮下 (SC) 中管理 ZIKV 的 1 x 10⁵聚焦成形单元 (FFU)。
2. 准备前一天收获所需的所有材料:2把剪刀、钳子和20 mL 70%乙醇(EtOH),用50 mL圆锥形进行工具消毒。
   1. 准备注射器和针头:20 mL 灌注注射器、23 G 针头(约每个笼 1 个)和 1 mL 注射器,带 25 G 针头(每 3-5 只鼠标 1 个)。在称重管之前,将钢珠(在发动机罩中)添加到 1.5 mL O 型环形螺钉盖管(每个器官一个)。管需要适合同质化。
3. 准备收获日,准备灌注和器官冷冻所需的材料。
   1. 用干冰和70%EtOH填充冰桶,做冰浴。制备无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS),假设脊髓每只灌注需要25-30 mL的PBS。获得麻醉,氯胺酮和西拉津的鸡尾酒,并假设每只小鼠300μL。将流式细胞测量所需的所有材料和任何附加管放入二级容器中,以运输至动物设施。
4. 在进入和进入动物设施期间,请遵循所有必要的入境程序,包括穿上和脱光个人防护设备。
   警告:所有程序均应在生物安全 2 级实验室 (BSL-2) 设施内经认证的生物安全柜中进行。
5. 施用麻醉,200-500 μL,腹内根据动物的大小和重量。如果单独工作,一次给一只动物麻醉,以避免在器官收获前杀死动物。
   1. 确认麻醉剂量,用钳子捏脚趾,以评估踏板反射。除非完全无响应,否则不要继续。使用针脚将鼠标固定在蜡板上。此时,在器官采集过程中,将小鼠加入 70% 乙醇,以避免头发污染
6. 心脏穿刺导致最终出血。
   1. 使用剪刀和钳子,打开动物通过胸腔暴露心脏。通过心脏穿刺(+800 μL)采集血液,可用于多种检测,包括临床化学、血液学、流式细胞测定检测抗原特异性反应,以及实时定量PCR(qRT-PCR)分析病毒拷贝数。
   2. 对于qRT-PCR的病毒RNA分析,从全血中提取或从血清中提取的微离心管中采集EDTA管中的血液。(对于血清,旋转管在离心机,室温度的最大速度,20分钟,并删除血清到一个单独的管)。精加工后,将线性聚丙烯酰胺作为载体添加到血清样本中。然后,RNA可以在-80°C下进行分析或储存,以便以后进行进一步处理。
7. 在室温(或37°C)下,将20 mL注射器填充PBS,并将蝴蝶针插入左心室,将小鼠注入。刺穿右中庭,让血液和PBS退出。缓慢地管理PBS,同时检查肝脏的颜色,以确认动物是完全渗透。肝脏应该从深红色变为粉红色鲑鱼颜色。
   1. 如果准备组织学的器官,将蝴蝶针留在原位,然后注入20 mL的冰冷4%甲醛。如果是这样,将注射器连接到三向止动器,同时连接两个注射器,将阀门打开和关闭作为 PBS 和 PFA 之间的一个备用阀,这很方便。
8. 收获器官成标记,称重管。对于周围器官,遵循既定的收获顺序:肝脏、脾脏、肾脏和肺。
   1. 只从肝脏中取一瓣;哪个并不重要,但对于所有实验,总是尝试用同样大小的片断取相同的叶。同样,对于肾脏和肺,采取相同的肾脏和肺。如果流动细胞学也要完成,任何器官都可以切成两半。将一半用于细胞测定在罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI)室温下储存,直到收获完成。
   2. 收获后,立即将每个器官放入标记的管子中,放入干冰浴中。病毒定度在室温下会随着时间而减少,因此收获器官所需的时间非常重要。小鼠之间必须保持一致,因此在安全之后,下一个优先事项是速度。
      注:如果收获病毒性定子的器官,此时有第二个人收获大脑是非常有帮助的,以保存病毒性定子。
9. 从小鼠体腔中取出剩余的器官,以进入脊柱和头骨。
   1. 将鼠标从板上取出并取出毛皮,然后拆下手臂和腿。
      用斩首、钝器或手术剪刀去除老鼠的头部,用锯齿状的拉格朗日剪刀切割头骨,以收获大脑。然后,用钳子剥掉头骨,用铲子挖出大脑。
   2. 使用强力钝剪刀,去除肋骨和脊柱周围的其他骨骼。然后,穿过骨盆骨,露出腰部水平的椎骨前臂。此时,脊髓的小尖端应可见。
   3. 使用装有PBS的10 mL注射器和18G针头,通过培养皿将脊髓从腰椎"冲洗"到颈椎,从而排出脊髓。
   4. 小心地将针的刀尖放在椎前针内,避免过度压力,防止针头侵入椎体。按住要对椎体和针头施加压力,然后按注射器柱塞以排出电源线。立即将脊髓转移到标记的管中,并放置在干冰浴中。
10. 对所有动物重复此过程,直到收获完成。将收获工具放在动物之间70%乙醇中。注重一致性和速度。每个器官收获之间的时间长度应保持一致,以便不偏袒病毒性度起结果。
11. 完成后,在将生物安全柜和所有材料从动物设施中取出之前,先对其进行消毒。
12. 从冰浴中取出每个管子,并称量管以确定器官重量。要确定器官重量,请从含管器官的重量中减去空管的重量。
    注:此时,器官可在-80°C冷冻,以在以后的进一步处理,或器官在冷冻单个等分物之前立即进行均质化。冷冻解冻样品多次减少病毒性小炎。因此,对于单个项目中的所有实验执行相同的过程非常重要。

2. 器官均质化

1. 为每个器官准备 3 个贴有标签的 1.5 mL 卡扣管,以便进行均质化。
2. 如果样品在收获后立即未进行均质化,请从 -80°C 中取出管。样品不需要解冻,以同质化。
3. 将样品放在冰上,使其保持低温,以尽量减少病毒性牙角损失。然后,在每个含有管的器官中加入1mL的含有5%FBS的冷DMEM。
4. 根据制造商的说明,立即在珠子搅拌器中搅拌管。在珠同质器中用钢珠将所有器官均质化。检查以确保每个器官已完全同质化。
5. 在冷却至8°C的微熔中,在微熔中旋转5分钟,在微fuge中旋转5分钟。 然后将管子送回冰桶。在生物安全柜中,将等分样品放入管中进行必要的检测。然后将管子送回冰桶。
6. 对于聚焦成形测定,将500μL等分放入带标签的管中。然后,将管子放在冰桶上的机架上。将50μL添加到用于荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)的RNA管中,以测量病毒基因组拷贝数。
7. 使用商业RNA分离试剂盒从受感染动物的器官中分离出总RNA。使用引基探针组确定燃烧剂病毒RNA,该基维克特异性识别每个黄病毒基因组中的独特序列。使用含有ZIKV靶序列的T7聚合酶,使用含有确定阳性单链RNA的拷贝控制质粒确定病毒拷贝数。
8. 将剩余样品(约 300 μL)分到第三管中,如果需要,储存在-80°C。
   注:如果样品以前没有冷冻,则冷冻在-80°C。如果样品先前已冷冻,则继续对焦点形成测定和/或RNA分离,然后停止。

3. 寨卡病毒焦点形成^测定26

注:重要的是包括无病毒控制和阳性控制。阳性控制是已知浓度的病毒库存的稀释系列。并非所有控件都需要在同一个板上,但随着测定大于 5 个板,应添加更多控件,并在板之间展开。小心不要用移液器尖端或剧烈清洗刮伤单层。多个器官可以在同一天或不同天进行点炎。但是单个器官不应该在多天内进行定位,因为不同的测定条件会影响病毒性定位。强烈建议在一天内运行单个器官。

1. 在测定当天之前,准备聚焦形成测定所需的细胞和试剂。
   1. 准备含有 500 mL DMEM 的生长介质,其中 5 mL 的 HEPES 和 25 mL 的 FBS。在测定开始前,在生长培养基在37°C、CO25%的细胞中生长。Vero细胞不应是高通道,或在测定开始前生长超过100%的汇合度。
   2. 通过高压灭菌,将 1L 玻璃介质瓶与 10 克甲基纤维素和一个大搅拌棒以及一个单独的 1 L 玻璃介质瓶(H₂O) 的 500 mL 进行高压灭菌,制备 2% 甲基纤维素溶液的 500 mL。如果高压灭水在微波炉中冷却,直到瓶子热到接触,但不沸腾。
   3. 在组织培养罩中,将温/热水轻轻倒入一瓶甲基纤维素中。部分盖瓶并在热板上搅拌,直到甲基纤维素在溶液中(1-4小时)。将2%甲基纤维素溶液与无菌50 mL锥形管中分用。2% 甲基纤维素可储存在4°C,直到需要。
   4. 在 PBS 中制备 5% 的甲醛溶液,用于固定板材,并储存在 4°C 下,直到需要为止。将0.05%Triton X-100添加到PBS并储存在RT.通过在PBS中加入1mg/mL皂素,并在4°C下储存,制备1xFFA染色缓冲液。准备1x聚焦成型洗涤液缓冲液。这些可以提前一到两周准备。
2. 计算测定所需的平底 96 孔板的数量,使每个器官都镀成三联。包括足够的附加井,用于正负控制。
   1. 在生长介质中生长足够的Vero细胞,完成测定设计。胰蛋白化Vero细胞,并在生长培养基中以每mL1.5 x10 5细胞的1.5x10⁵细胞计数。在96孔平底板中的板Vero细胞,在3.0 x 10⁴ Vero-WHO细胞/生长培养基中通过每孔加入200μL。
   2. 在37°C的Co2下孵育板,在5%CO₂过夜,确保板在孵化器中水平,使细胞在井内均匀分布。
      注:每个实验室的维罗细胞生长略有不同;目标是在寨卡病毒检测当天,每口井的90-95%汇合单层。
3. 稀释寨卡病毒样本的当天的测定。如果器官样品以前是均质的,从-80°C冷冻箱中取出样品,让它们解冻,然后再将样品放在冰上进行检测。
   1. 在冰上,通过在 H 排 B 中添加 180 μL 的冷生长介质,将 A 排留空,准备一个圆底 96 孔板。将每个均质器官样品的150 μL添加到圆形底板的A行中。
   2. 使用多通道移液器制备每个样品的连续 10 倍稀释。将 20 μL 的样品加入 180 μL 的生长介质中,在每次稀释之间更换移液器提示,将样品稀释到圆底 96 孔板中。
4. 将介质从覆盖 Vero 细胞的平底 96 孔板中取出,准备对焦成型板。在添加病毒样本之前立即执行此操作,以防止单层干燥。
   1. 在 Vero 板的每个孔中加入 100 μL 的病毒稀释剂。通过从最低浓度到最高浓度,使用同一组提示添加样本。岩石板侧对侧2-4倍小心不要旋转。
   2. 在37°C下孵育,5%CO₂孵育1-2小时。确保板在培养箱内水平。在孵育期间,将2%的甲基纤维素加热到RT。
   3. 在生长培养基中稀释2%的甲基纤维素溶液。稀释率应约为2:1的2%甲基纤维素与生长介质的比例。保持房间温度,直到它的时间使用它。在 96 孔板的每个孔中添加 1-2 滴/孔(将移液器设置为 125 μL):生长介质。
   4. 在37°C下孵育32-40小时,CO₂为5%。由于每个人的Vero细胞的生长略有不同,包括细胞汇合和寨卡病毒株在内的因素可以改变潜伏时间。
5. 使用制备的 5% 甲醛溶液修复 Vero 细胞。
   1. 在生物安全柜的甲基纤维素层顶部每口添加50μL5%的甲醛。在 RT 孵育 60 分钟。固定物可在 4°C 下过夜,但用副膜覆盖板以减少蒸发。
   2. 将细胞外的覆盖层和介质倒入生物安全柜内的处置容器中。用 PBS 轻轻清洗 150 μL/井。从板中取出 PBS,然后从 BSL-2 上拆下板。
   3. 重复PBS洗涤2倍加入150μL/井。然后删除 PBS。加入150μL/well 1x FFA洗涤缓冲液,让在RT坐5-10分钟,以渗透固定细胞。
6. 使用原发性寨卡抗体检测感染。在FFA染色缓冲液中以1mg/mL的浓度制备原抗体4G2(D1-4G2-4-15)。为整个测定准备足够的抗体。
   注:远离实验室尿布或其他高绒吸收材料,因为纤维会对心质的成像产生负面影响。
   1. 从板中取出 FFA 洗涤缓冲液。在FFA染色缓冲液中加入50μL/井的初级抗体。用副膜密封板,并在4°C的摇杆平台上孵育过夜。在RT进行2小时的孵育后,即可进行测定。
7. 通过添加继发HRP结合抗体来可视化感染。在FFA染色缓冲液中制备浓度为1:5,000的二级山羊抗小鼠HRP标记抗体。为整个测定准备足够的抗体。
   1. 用 FFA 洗涤缓冲液清洗细胞 3 倍,每次轻拂进入水槽,去除洗涤缓冲液。在50μL/well的FFA染色缓冲液中用二级抗体染色细胞。在 RT 孵育 1-2 小时。
   2. 用 FFA 洗涤缓冲液清洗细胞 3 倍,每次轻拂进入水槽,去除洗涤缓冲液。添加 50 μL/井的真蓝基底。
   3. 仔细观察盘子,等待2-15分钟,直到斑点被完全定义和最小的背景。斑点可见后,用清水轻轻清洗,用手保护单层免受水流的力。在纸巾上轻触干爽(不要使用),并尽快显示图像。
   4. 点可以手动计数或使用自动点计数器。如果手动计数,可以使用解剖范围来帮助可视化。
   5. 对于每个样品,选择具有易于区分的点子(例如,每口井 20 到 200 个)的稀释,并使用重复井的平均值计算每 mL (FFU/ml) 对焦形成单元中的牙点:FFU/mL = (均值点/井) = (稀释系数) = (mL 雾化)。

Results

使用上述协议评估ZIKV针,通过皮下(SC)注射到脚垫上,小鼠感染了ZIKV(PRVABC59)。 在这里,给ZIKV的1 x 10⁵ FFU给8-12周大的Ifnar1-/-小鼠SC不是致命的,但病毒可以在外围和CNS中复制。此剂量和途径用于研究宿主病原体免疫反应和致病性。给ZIKV的1 x 10⁵ FFU注射8-12周大的Ifnar1-/-小鼠静脉注射(IV)是80至100%的致命性,动物在病毒注射后8至14天之间感染。 我们经常使用这种管理途径来确定抗病毒药物和治疗药物的疗效,以及临床前疫苗候选测试。

四只10-12周大的Ifnar1-/-小鼠感染了ZIKV SC的1 x 10⁵ FFU,脾脏、肝脏、肾脏、脊髓和大脑在...

Discussion

ZIKV感染可引起神经系统疾病,因此目前动物模型研究的发病机制、免疫反应和疫苗和抗病毒药物的保护功效需要专注于中枢神经系统内的病毒控制。关注中枢神经系统疾病的挑战之一是,它往往以研究周围感染为代价。这里提出的器官分离方法侧重于需要快速评估在外围和CNS的ZIKV感染,以便评估中枢介ZIKV相关疾病,并建立抗病毒药物临床前测试模型,治疗和疫苗。该技术的另一个好处是,它还允许高度的灵活性,包括结合研究对ZIKV的免疫反应或感染组织学分析。这种技术,不仅限于ZIKV,但也可以普遍应用于研究一系列宿主-病原体相互作用,包括黄病毒,如登革热病毒21,正痘病毒,如猴痘和冠状病毒。这种收获技术的考虑和缺点主要集中于实验者的能力。由于ZIKV在室温下长时间不稳定,灌注后收获器官所需的时间会对结果质量产生显著影响。对于我们所做的大多数实验,我们比较了治疗有两种情况的小鼠的病毒定度,因此我们专注于器官收获之间的时间一致性,而不是速度。通过这种方式,同一个人对整个实验执行相同的过程以保持一致性。这个程序的另一个主要考虑因素是安全性,我们很容易使用BSL-2(ZIKV,登革热病毒)和BSL-3(WNV,基孔肯雅病...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-溴-3-氯丙烷 （BCP）	MRC 基因	BP151
10 cc 注射器	Thermo Fisher Scientific	BD 309642
18 G 针头	Thermo Fisher Scientific	22-557-145
1 cc TB 注射器	Thermo Fisher Scientific	14-823-16H
20 cc 注射器	Thermo Fisher Scientific	05-561-66
24 管珠磨	Thermo Fisher Scientific	15 340 163
3.2 mm 不锈钢珠	Thermo Fisher Scientific	NC9084634
37 °C 组织培养箱	Nuair	5800
4G2 内部
96 孔平底板	Midsci	TP92696
96 孔圆底板	Midsci	TP92697
Basix 1.5 mL eppendorf 管	Thermo Fisher Scientific	02-682-002
浓缩杀菌漂白	剂订书钉	30966CT
CTL S6 分析仪	CTL	CTL S6 万能分析仪
弯曲的剪刀	精细的科学工具	14061-11
Dulbecco's 改良鹰's 中 - 高葡萄糖 含 4,500 mg/L 葡萄糖	MilliporeSigma	D5671
乙醇（分子生物学级）	MilliporeSigma	e7023
胎牛血清	MilliporeSigma	F0926-500ML
镊子	精细科学工具	11036-20
冰醋酸	MilliporeSigma	537020
山羊抗小鼠 HRP 标记抗体	MilliporeSigma	8924
HEPES 1 M	MilliporeSigma	H3537-100ML
异丙醇（分子生物学级）	MilliporeSigma	I9516
氯胺酮/甲苯噻嗪混合物	比较医学
L-谷氨酰胺	MilliporeSigma	g7513
Magmax RNA纯化套件	Thermo Fisher Scientific	AM1830
甲基纤维素	MilliporeSigma	M0512
微量离心机	Ependorf	5424R
MiniCollect 0.5 mL EDTA 管	Bio-one	450480
O 形圈管	Thermo Fisher Scientific	21-403-195
一步法 q RT-PCR 混合物	Thermo Fisher科学	4392938
多聚甲醛	Thermo Fisher Scientific	EMS- 15713-S
磷酸盐缓冲盐水	MilliporeSigma	d8537-500ml
脯氨酸多通道移液器	赛多利斯	72230/72240
脯氨酸单通道移液器	赛多利斯	728230
无 RNAse 水	ThermoFisher Scientific	10-977-023
RNAzol BD	MRC 基因	RB192
摇床	Thermo Fisher Scientific	11-676-333
RPMI 1640	Fisher	MT10040CV
皂苷	MilliporeSigma	s7900
勺/抹刀	精细科学工具	10090-17
直剪刀	精细科学工具	14060-11
Triton X-100	MilliporeSigma	t8787
真蓝色底物	VWR	95059-168
胰蛋白酶	MilliporeSigma	T3924-100ML