Method Article

从小鼠多个器官分离和定量寨卡病毒

DOI:

10.3791/59632

⸱

August 15th, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Saint Louis University, 2School of Veterinary Medicine University of California Davis

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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该协议的目的是通过分离和量化寨卡病毒,从感染后小鼠的多个器官中分离和量化,来展示用于调查病毒性疾病的技术。

Abstract

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提出的方法展示了从寨卡病毒感染动物中分离器官和定量病毒载量的实验室程序。该程序的目的是量化小鼠在感染后不同时间点或不同实验条件下的周围和中枢神经系统区域的病毒性色度,以确定调节寨卡病毒感染的病毒学和免疫学因素。所演示的器官分离程序允许对病毒性定位剂进行焦点形成测定定量和定量PCR评估。快速器官分离技术是为保存病毒性皮炎而设计的。通过聚焦形成测定对病毒进行量度定量,可快速评估寨卡病毒的通量。重点形成测定的好处是评估传染性病毒,这种测定的局限性是降低检测极限的器官毒性的潜力。病毒性排名评估与定量PCR相结合,使用重组RNA拷贝控制病毒基因组拷贝数在器官内评估检测限值低。总体而言,这些技术为分析寨卡病毒感染动物的外围寨卡病毒分子和中枢神经系统提供了准确的快速高通量方法,并可用于评估大多数感染动物器官中的病毒性定子病原体,包括登革热病毒。

Introduction

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寨卡病毒(ZIKV)是一种属于浮病毒家族的病毒,包括重要的神经侵入性人类病原体,如波瓦桑病毒(POWV)、日本脑炎病毒(JEV)和西尼罗病毒(WNV)1。在隔离和鉴定后,非洲和亚洲定期报告人类ZIKV感染2、3、4、5和中美洲和南美洲的流行病(在参考6。然而,直到最近,ZIKV才被认为会导致严重的疾病7。现在有成千上万的神经系统疾病和出生缺陷与ZIKV感染有关。ZIKV的迅速出现引发了许多问题:为什么疾病严重程度增加,对ZIKV感染的免疫反应是什么,以及是否有病毒和/或免疫介导的病理与神经学的增加有关表现和先天缺陷。现在人们急于了解与ZIKV相关的中枢神经系统(CNS)相关疾病,以及快速测试抗病毒药物和疫苗对ZIKV的疗效的必要性。正是在这种背景下,我们开发了使用ZIKV特定焦点形成测定(FFA)对外围和CNS中ZIKV定子进行快速分析的方法。

小型动物模型对于了解疾病进展和早期评估疫苗、治疗和抗病毒药物非常重要。我们已经建立了研究阿尔博病毒病的小动物模型,利用各种小鼠菌株来模拟人....

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Protocol

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本研究的所有程序均符合圣路易斯大学动物护理和使用委员会制定的指导方针。SLU 获得国际实验室动物护理评估与认证协会 (AAALAC) 的完全认可。

1. 器官隔离

注:病毒在室温 (RT) 下不稳定,因此必须仔细规划一次收获的动物数量,以保存病毒性定位剂。

  1. 根据所需的表型,使用所选剂量和路线感染小鼠。对于此方案,感染8-10周大的雄性与雌性I型干扰素受体缺陷(Ifnar1-/-)C57BL/6小鼠。
    1. 麻醉Ifnar1-/-小鼠与氯胺酮(90毫克/千克)和西拉津(10毫克/千克)的鸡尾酒。测试踏板反射由坚定的脚趾捏,以确认麻醉。通过脚垫在 50 μL 皮下 (SC) 中管理 ZIKV 的 1 x 105聚焦成形单元 (FFU)。
  2. 准备前一天收获所需的所有材料:2把剪刀、钳子和20 mL 70%乙醇(EtOH),用50 mL圆锥形进行工具消毒。
    1. 准备注射器和针头:20 mL 灌注注射器、23 G 针头(约每个笼 1 个)和 1 mL 注射器,带 25 G 针头(每 3-5 只鼠标 1 个)。在称重管之前,将钢珠(在发动机罩中)添加到 1.5 mL O 型环形....

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Results

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使用上述协议评估ZIKV针,通过皮下(SC)注射到脚垫上,小鼠感染了ZIKV(PRVABC59)。 在这里,给ZIKV的1 x 105 FFU给8-12周大的Ifnar1-/-小鼠SC不是致命的,但病毒可以在外围和CNS中复制。此剂量和途径用于研究宿主病原体免疫反应和致病性。给ZIKV的1 x 105 FFU注射8-12周大的Ifnar1-/-小鼠静脉注射(IV)是80至100%的致命性,动物在病毒注射后8至14天之间感染。 我们经常使用这种管理途径来确定抗病毒药物和治疗药物的疗效,以及临床前疫苗候选测试。

四只10-12周大的Ifnar1-/-小鼠感染了ZIKV SC的1 x 105 FFU,脾脏、肝脏、肾脏、脊髓和大脑在.......

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Discussion

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ZIKV感染可引起神经系统疾病,因此目前动物模型研究的发病机制、免疫反应和疫苗和抗病毒药物的保护功效需要专注于中枢神经系统内的病毒控制。关注中枢神经系统疾病的挑战之一是,它往往以研究周围感染为代价。这里提出的器官分离方法侧重于需要快速评估在外围和CNS的ZIKV感染,以便评估中枢介ZIKV相关疾病,并建立抗病毒药物临床前测试模型,治疗和疫苗。该技术的另一个好处是,它还允许高度的灵活性,包括结合研究对ZIKV的免疫反应或感染组织学分析。这种技术,不仅限于ZIKV,但也可以普遍应用于研究一系列宿主-病原体相互作用,包括黄病毒,如登革热病毒21,正痘病毒,如猴痘和冠状病毒。这种收获技术的考虑和缺点主要集中于实验者的能力。由于ZIKV在室温下长时间不稳定,灌注后收获器官所需的时间会对结果质量产生显著影响。对于我们所做的大多数实验,我们比较了治疗有两种情况的小鼠的病毒定度,因此我们专注于器官收获之间的时间一致性,而不是速度。通过这种方式,同一个人对整个实验执行相同的过程以保持一致性。这个程序的另一个主要考虑因素是安全性,我们很容易使用BSL-2(ZIKV,登革热病毒)和BSL-3(WNV,基孔肯雅病.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的

Acknowledgements

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Pinto博士的资金来自圣路易斯大学医学院的种子赠款和圣路易斯大学医学院的启动基金。Brien博士的资助来自NIH NIAID的K22AI104794早期调查员奖以及圣路易斯大学学院的种子补助金。对于所有受资助的个人,资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有作用。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-溴-3-氯丙烷 （BCP）MRC 基因BP151
10 cc 注射器Thermo Fisher ScientificBD 309642
18 G 针头Thermo Fisher Scientific22-557-145
1 cc TB 注射器Thermo Fisher Scientific14-823-16H
20 cc 注射器Thermo Fisher Scientific05-561-66
24 管珠磨Thermo Fisher Scientific15 340 163
3.2 mm 不锈钢珠Thermo Fisher ScientificNC9084634
37 °C 组织培养箱Nuair5800
4G2 内部
96 孔平底板MidsciTP92696
96 孔圆底板MidsciTP92697
Basix 1.5 mL eppendorf 管Thermo Fisher Scientific02-682-002
浓缩杀菌漂白剂订书钉30966CT
CTL S6 分析仪CTLCTL S6 万能分析仪
弯曲的剪刀精细的科学工具14061-11
Dulbecco's 改良鹰's 中 - 高葡萄糖 含 4,500 mg/L 葡萄糖MilliporeSigmaD5671
乙醇（分子生物学级）MilliporeSigmae7023
胎牛血清MilliporeSigmaF0926-500ML
镊子精细科学工具11036-20
冰醋酸MilliporeSigma537020
山羊抗小鼠 HRP 标记抗体MilliporeSigma8924
HEPES 1 MMilliporeSigmaH3537-100ML
异丙醇（分子生物学级）MilliporeSigmaI9516
氯胺酮/甲苯噻嗪混合物比较医学
L-谷氨酰胺MilliporeSigmag7513
Magmax RNA纯化套件Thermo Fisher ScientificAM1830
甲基纤维素MilliporeSigmaM0512
微量离心机Ependorf5424R
MiniCollect 0.5 mL EDTA 管Bio-one450480
O 形圈管Thermo Fisher Scientific21-403-195
一步法 q RT-PCR 混合物Thermo Fisher科学4392938
多聚甲醛Thermo Fisher ScientificEMS- 15713-S
磷酸盐缓冲盐水MilliporeSigmad8537-500ml
脯氨酸多通道移液器赛多利斯72230/72240
脯氨酸单通道移液器赛多利斯728230
无 RNAse 水ThermoFisher Scientific10-977-023
RNAzol BDMRC 基因RB192
摇床Thermo Fisher Scientific11-676-333
RPMI 1640FisherMT10040CV
皂苷MilliporeSigmas7900
勺/抹刀精细科学工具10090-17
直剪刀精细科学工具14060-11
Triton X-100MilliporeSigmat8787
真蓝色底物VWR95059-168
胰蛋白酶MilliporeSigmaT3924-100ML
机 抗体

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
  2. Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tr....

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