我们描述了两种方法，用于评估与转移微环境（TMEM）通道功能及癌细胞内渗相关的短暂性血管通透性，该方法通过向小鼠静脉注射高分子量（155 kDa）葡聚糖实现。这些方法包括在活体动物中进行活体成像以及利用免疫荧光对固定组织进行分析。
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本文内容
摘要
摘要
癌症相关死亡最常见的原因是转移，这一过程需要癌细胞从原发肿瘤扩散到继发部位。近期我们发现，在原发性乳腺癌中以及肺部转移部位的癌细胞扩散仅发生在一种称为转移性肿瘤微环境（Tumor MicroEnvironment of Metastasis, TMEM）的“门户”结构处。TMEM门户的数量可作为乳腺癌患者远处复发的预后指标。TMEM门户由一个过表达肌动蛋白调控蛋白Mena的癌细胞组成，该癌细胞直接接触一个表达高水平TIE2和VEGF的血管周围促血管生成型巨噬细胞，且这两个细胞均紧密地与一个血管内皮细胞结合。由于TMEM相关巨噬细胞与表达Mena的癌细胞协同作用，诱导了短暂的血管通透性，使得癌细胞能够通过TMEM门户进入血管内。在本文中，我们描述了两种评估TMEM介导的短暂性血管通透性的方法：活体成像和固定组织免疫荧光染色。尽管这两种方法各有优缺点，但联合使用可提供对TMEM介导的血管通透性及其功能所需微环境前提条件的最全面分析。由于乳腺癌（可能还包括其他类型癌症）的转移过程涉及通过TMEM门户的癌细胞扩散，因此必须采用成熟可靠的方法来分析TMEM门户的活性。本文所述的两种方法为分析TMEM门户活性提供了全面的策略，适用于未经处理或经药物处理的动物模型，这对于开发阻止癌细胞经TMEM扩散的药物的临床前试验具有至关重要的意义。
引言
近年来，随着对癌症转移机制的深入理解，研究发现仅靠上皮-间质转化（EMT）以及迁移性/侵袭性癌细胞亚群的产生本身并不足以实现血行播散1事实上，人们曾认为转移性癌细胞会穿过整个肿瘤相关内皮，因为肿瘤新生血管通常缺乏周细胞覆盖，因而具有高通透性和不稳定性2,3,4尽管这些现象强烈提示肿瘤内部存在功能缺陷，但在癌变过程中观察到的血管改变本身并不能证明肿瘤细胞能够轻易且不受控制地穿透血管壁。活体成像（IVI）研究提供了进一步见解，其中肿瘤细胞被荧光标记，血管系统则通过静脉注射荧光探针（如葡聚糖或量子点）进行标记。研究表明，尽管肿瘤血管对低分子量葡聚糖（例如70 kD）具有普遍通透性，但高分子量葡聚糖（155 kD）和肿瘤细胞仅能在特定的侵入位点穿越内皮层，这些位点优先分布于血管分支点处。5,6,7. 利用动物模型和人类患者来源材料进行的免疫组织化学（IHC）分析表明，这些位点是 "“门户”，专门负责局部且短暂地调节血管通透性，为迁移性/侵袭性癌细胞进入循环系统提供短暂的窗口期。这些门户被称为 "转移性肿瘤微....
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方案
所有使用活体动物的实验必须遵循动物使用与护理的指南和规定。本研究中描述的实验程序均依照美国国立卫生研究院关于实验动物护理与使用的法规，并经阿尔伯特·爱因斯坦医学院动物护理与使用委员会（IACUC）批准后进行。
1. 利用活体动物成像评估"爆发性通透性"
- 同基因型乳腺肿瘤移植至表达荧光蛋白的巨噬细胞小鼠模型
- 生成适合移植的肿瘤组织片段。
- 通过将自发性、同源性、基因工程小鼠乳腺癌模型 MMTV-PyMT 小鼠与表达荧光报告基因的转基因小鼠杂交，建立荧光标记的肿瘤小鼠乳腺癌模型 荧光标记, 乳腺癌模型, MMTV-PyMT 小鼠, 转基因小鼠, 荧光报告基因, 自发性肿瘤, 同源性肿瘤, 基因工程小鼠38,39 [例如，增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、增强型青色荧光蛋白（ECFP）或 Dendra2]。
- 让携带荧光标记肿瘤的MMTV-PyMT小鼠生长至肿瘤大小不超过2 cm（约10-12周龄）。
- 将荷瘤的MMTV-PyMT小鼠放入含5%异氟烷的密闭容器中，待呼吸完全停止后继续维持30秒，实施安乐死。
- 实施颈椎脱位术。
- 使用脱毛膏去除安乐死小鼠腹部的毛发。....
- 生成适合移植的肿瘤组织片段。
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结果
本方案文章中描述的实验步骤在图1A-C中进行了简要总结和图示说明。
为了测量由TMEM介导的血管通透性（“爆发样活动”），并减少来自其他类型血管通透性模式（即跨细胞和旁细胞通透性，如引言中所述）的实验噪声，我们进行了静脉内（i.v.）注射高分子量示踪物，例如与四甲基罗丹明偶联的155 kDa葡聚糖。低分子量的葡聚糖无法区分这三种血管通透性模式。我们以往的经验表明，155 kDa TMR-葡聚糖在全身循环中可有效标记正常组织（如乳腺和肺组织）（图2A,B）以及肿瘤组织（如原发性乳腺癌和肺部乳腺癌转移灶）的血管系统（图2C,D）。正如先前研究5,46所证实的，155 kDa TMR-葡聚糖是检.......
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讨论
本文概述了两种可用于可视化和量化特定类型血管通透性的实验方案，该通透性存在于TMEM通道处，并与血管紧密连接和黏附连接的破坏相关。如上所述，这种血管通透性是短暂的，由三联TMEM细胞复合物所调控5。识别并量化与TMEM相关的血管通透性，对于评估促进转移的癌细胞微环境至关重要，同时也适用于研究传统细胞毒性疗法对肿瘤微环境的影响，以及靶向和非靶向治疗药物抗转移潜力的临床前研究。重要的是，本文证明了该评估既可通过活体成像，也可通过固定组织的免疫荧光染色来完成。两种方法各有优缺点：活体成像可直接观察血管通透性的动态过程，但需要专门的设备和技术培训；而固定组织的免疫荧光染色仅能提供静态图像，但可在大多数实验室常规开展。
癌症患者通常接受某种形式的全身治疗，而全身治疗的效果通常通过评估与癌细胞存活相关的参数（如细胞凋亡、增殖或肿瘤总体大小）来判断。然而，考虑到大多数癌症相关死亡是由转移引起的，因此同样重要的是理解这些全身治疗如何影响癌细胞的播散；转移过程既涉及癌细胞的增殖，也涉及癌细胞的播散1。例如.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢阿尔伯特·爱因斯坦医学院分析影像中心（AIF）在成像方面提供的支持。本研究得到了美国国家癌症研究所（NCI）资助（P30CA013330、CA150344、CA100324 和 CA216248）、SIG 1S10OD019961-01、格鲁斯-利珀生物光子学中心及其综合影像项目，以及蒙特菲奥里医学中心肿瘤微环境研究外科医生露丝·L·柯什斯坦 T32 培训项目（CA200561）的资助。
GSK 共同撰写了论文，完成了图1C和3B的成像工作，开发了固定组织分析方案，并对所有数据进行了分析和解释；JMP 共同撰写了论文，并完成了图1B、2C和3A的手术及活体成像；LB & AC 完成了图2B的手术及活体成像；RJ 完成了图2A的手术及活体成像；JSC 共同撰写了论文，并对所有数据进行了分析和解释；MHO 共同撰写了论文，并对所有数据进行了分析和解释；DE 完成了图2D的手术及活体成像，共同撰写了论文，开发了固定组织分析和活体成像方案，并对所有数据进行了分析和解释。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗兔 IgG（Alexa 488） | Life Technologies Corporation | A-11034 | |
| 抗大鼠 IgG（Alexa 647） | Life Technologies Corporation | A-21247 | |
| 牛血清白蛋白 | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| 柠檬酸盐 | Eng Scientific Inc | 9770 | |
| 盖玻片 | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| 氰基丙烯酸酯粘合剂 | Henkel Adhesive | 1647358 | |
| DAPI | Perkin Elmer | FP1490 | |
| 四甲基罗丹明-葡聚糖 | Sigma Aldrich | T1287 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
| 内粘蛋白（一抗） | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | |
| 恩诺沙星 | Bayer | 84753076 v-06/2015 | |
| 胎牛血清 | Sigma Aldrich | F2442 | |
| 鱼皮明胶 | Fisher Scientific | G7765 | |
| 胰岛素注射器 | Becton Dickinson | 309659 | |
| 异氟烷 | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Matrigel | Corning | CB40234 | 人工细胞外基质 |
| 针头（30 G） | Becton Dickinson | 305128 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Life Technologies Corporation | PBS | |
| 聚乙烯导管 | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | |
| 脉搏血氧仪 | Kent Scientific | MouseOx | |
| Puralube Vet 软膏 | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| 量子点 | Life Technologies Corporation | Q21561MP | |
| 橡胶 | McMaster Carr | 1310N14 | |
| TMR（一抗） | Invitrogen | A6397 | |
| Tween-20 | MP Biologicals | TWEEN201 | |
| 二甲苯 | Fisher Scientific | 184835 |
参考文献
- Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
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