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利用微图形技术和定量成像技术绘制哺乳动物细胞的自组织空间结构

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DOI：

10.3791/59634

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2019年4月30日

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1MRC Centre for Regenerative Medicine, Institute for Stem Cell Research, School of Biological Sciences, University of Edinburgh

本文内容

摘要

本文介绍的方法结合微图形化技术与定量成像，以揭示哺乳动物细胞培养物中的空间组织结构。该技术易于在标准的细胞生物学实验室中建立，为体外研究模式形成提供了一个可操作的实验系统。

摘要

生物学的一个基本目标是理解发育过程中模式是如何形成的。多个研究团队已经证明，当干细胞在微图案上受到空间限制时，可以在体外实现模式形成，从而建立起独特的实验模型，为在体外识别生物组织的基本原理提供了前所未有的机会。

本文介绍了我们对该方法的实际应用。我们改进了一种光刻图案化技术，以减少对专用设备的需求，使该方法更易于在标准的细胞生物学实验室中建立。此外，我们开发了一个免费、开源且易于安装的图像分析框架，用于精确测量细胞亚群在标准形状和大小的细胞集落中的优先定位情况。该方法能够揭示即使在看似无序的细胞群体中也存在的图案化现象。该技术可提供定量分析结果，可用于解析环境因素（如物理信号或内源性信号）对特定图案化过程的影响。

引言

在哺乳动物系统中，模式形成是细胞集体行为的一种涌现特性，因此，只要向细胞提供适当的信号，模式便可以在体外形成1,2,3,4,5,6。揭示细胞在体外自我组织内在能力的一种方法是迫使细胞形成具有特定形状和大小的细胞群或克隆7,8,9,10。实现这一目标的一种技术是微图形化（micropatterning）11。微图形化技术能够精确定义细胞外基质（ECM）分子在表面的沉积位置，从而决定细胞的黏附位置，进而控制细胞的空间组织方式。

微图形化是一种具有多种应用的技术，例如，微图形化可在细胞分化前实现初始条件的标准化12。重要的是，微图形化能够方便地控制细胞集落的大小、形状和间距，这一特性可用于设计实验，以研究细胞对形态发生素或物理信号的集体响应7,8,10,13,14,15,16,17。

已开发出多种微图形化方法11。光图形化技术可能是最容易建立的方法之一18。这些方法还具有高精度的优势，可用于控制单个细胞的形态18,19,20。然而，这些方法通常需要昂贵的专用设备，包括旋涂仪、等离子体腔室和UVO（紫外-臭氧）清洗仪，而这些设备在标准生物学实验室中通常不易获得。为了促进该技术的推广应用，我们对实验方案进行了改进，仅需使用UVO灯即可完成。我们从 commercially available 的塑料载片开始，可根据需要使用剪刀或打孔器将其裁剪成所需的规格。

微图案的一个重要用途是能够对菌落进行标准化，从而在多个重复实验之间比较单个菌落。这使得研究人员可以探究这些菌落内模式形成的可重复程度，并分析影响模式形成稳健性的各种因素。更重要的是，通过对多个标准化菌落的“平均”模式进行量化，还可能揭示出原本不易察觉的模式形成过程。能够对标准化菌落中的模式进行量化分析的优势，依赖于准确测量蛋白质表达水平的能力，理想情况下应达到单细胞水平。然而，微图案上的细胞通常排列非常紧密，导致难以高精度地进行细胞分割。此外，细胞常常以三维而非二维方式组织，这使得在分割过程中检测并保留三维（3D）信息变得具有挑战性。一旦成功完成细胞分割，就需要借助计算方法从所得数据集中提取模式信息。

我们开发了分割和图像分析工具，以帮助克服这些问题。该分析方法仅使用免费的开源软件，无需掌握命令行或编程知识即可实施。为了在此说明该方法，我们采用小鼠胚胎干细胞（mES细胞），这些细胞会自发表达早期分化标志物brachyury（Tbra）21,22。尽管在视觉上无法检测到明显的空间分布模式，但该方法能够生成T+细胞在克隆中优先定位的分布图。我们还显示，Tbra的模式化分布与表达Id1的细胞缺乏优先定位形成对比，后者是骨形态发生蛋白（BMP）信号通路的直接读出指标23。我们还讨论了该方法目前的局限性，以及该技术如何适应其他实验系统。

方案

注意：方法的概述见图1。

1. 掩模设计

  1. 根据 Azioune 等人描述的指南设计光刻掩模18。有关本研究所用软件及掩模制造商的参考信息，请参见材料表。
    注意：可在同一块掩模上创建多种几何形状、尺寸或图形间距。紫外灯可容纳 15 cm 的光刻掩模，最多可包含 49 种不同的设计（假设每个芯片为 2 cm × 2 cm）。

2. 微图形制造流程

  1. 准备必要的材料。
    1. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制0.1%泊洛沙姆407溶液（10 mg溶于10 mL），置于室温摇床上。泊洛沙姆407约需20分钟溶解。
    2. 将实验室膜（见材料表）铺在10 cm方形培养皿底部，用作基质沉积的腔室。
    3. 依次用100%丙酮、100%异丙醇和ddH2O清洗光掩模表面。如有可能，让光掩模自然风干，否则使用洁净纸巾轻轻擦干。
    4. 准备一块与光掩模尺寸完全相同的方形、刚性且不透光的塑料片（后文称为“支架”）。
      注意：此支架将在光照步骤中用于使塑料盖玻片与光掩模保持接触。
    5. 打开UVO灯，进行10分钟预热照射。
  2. 制备光刻图案芯片。
    注意：本方法可调整以制备任意所需尺寸的芯片。为简便起见，此处描述生成12 mm圆形微图案芯片的步骤。
    1. 使用12 mm打孔器切割疏水性塑料载片，制成12 mm圆形盖玻片，并将其放入洁净的新培养皿中。
      注意：操作时应始终佩戴手套，避免皮肤接触塑料表面，以免破坏表面处理层。
    2. 用镊子小心移除盖玻片上的保护膜。
      注意：避免损伤塑料表面，否则可能影响后续接种步骤（第3节）中细胞在芯片上的定位。
    3. 将光掩模放置于洁净稳定的表面（例如光掩模盒）上，铬面朝上，并在目标芯片设计位置滴加2 µL ddH2O。
    4. 将盖玻片覆盖在ddH2O液滴上，并轻轻按压。
      注意：确保与光掩模接触的一面是之前由保护膜覆盖的塑料面。
    5. 将支架置于塑料载片上方，并用夹子小心固定这一夹层结构，以确保塑料片与光掩模保持接触。
      注意：夹子应尽可能靠近塑料载片的位置放置，以确保塑料载片与光掩模表面完全贴合。
    6. 将组装好的结构置于UVO灯下，距离光源约2 cm，照射10分钟。
      注意：当芯片距光源2 cm时，254 nm波长下的光照强度约为6 mW/cm2。
    7. 手持夹层结构，光掩模朝下，拆卸时一手保持压力，另一手小心移除夹子，防止拆解过程中载片移动。移除支架时，确保所有塑料片仍留在光掩模上，未粘附于支架。
    8. 在芯片上方加入ddH2O，轻轻将芯片从光掩模上剥离。
      注意：若塑料芯片粘附在光掩模上，可用塑料移液枪头轻推芯片使其脱离，同时用镊子悬于芯片上方以防突然脱落。
    9. 最后，将光刻图案芯片放入基质沉积腔室中。
      注意：确保芯片的光照面朝上。
  3. 沉积基质。
    注意：本节所有操作均应在组织培养超净台中进行。
    1. 使用0.22 µm聚醚砜（PES）滤膜过滤泊洛沙姆407溶液。
    2. 通过混合无菌过滤的500 μg/mL泊洛沙姆407溶液与1 mg/mL明胶，制备细胞外基质（ECM）包被溶液。
      注意：有关其他可能使用的ECM分子的更多信息，请参见表1。
    3. 向每片光照处理的芯片上加入200 µL包被溶液。实验室膜可防止液滴溢出芯片范围。
    4. 加入一个盛有ddH2O的3 cm培养皿以减少蒸发，并将芯片置于4 °C过夜。

3. 接种步骤

注意：以下步骤已针对使用标准小鼠胚胎干细胞（mESC）培养基的CGR8小鼠胚胎干细胞（mESC）进行优化（另请参见材料表）24。然而，原则上该方案可适用于任何细胞类型。另请注意，本文未描述小鼠胚胎干细胞的传统细胞培养方法，因其详细资料可在其他文献中找到25。

  1. 吸去包被液，用无菌 PBS 将芯片孵育两次，每次至少 5 分钟。
  2. 同时，在温热的培养基中制备浓度为 5.5 × 105 个细胞/mL 的细胞悬液。
  3. 用移液器将 200 µL 细胞悬液滴加到每片芯片上（约 100,000 个细胞/cm2）。
  4. 封闭接种室，将细胞在培养箱中孵育 1 小时，使其贴附。
  5. 1 小时后，用 500 µL/孔的温热培养基填充多孔板的孔（根据芯片数量选择 4 孔板或 24 孔板），并用无菌镊子将芯片转移至多孔板中。
  6. 剧烈振荡多孔板，以去除未贴附的细胞。吸去培养基，并立即更换为新鲜的温热培养基。在显微镜下观察，确认是否可见图案化结果（图 2a）。
    注意：当使用除 mESC 以外的细胞系或其他基质蛋白时，可能需要优化贴附时间（另见 表 2）。
  7. 重复此步骤，直至图案清晰可见，如 图 2a 所示。
    注意：此步骤极为 关键，决定了实验的成败。洗涤过程过于剧烈可能导致细胞脱落，而洗涤不足则可能导致细胞残留在图案之间的区域（图 2c,d）。

4. 固定

注意：培养 48 小时后，细胞应形成致密的集落，且严格遵循图案的形状（如图 2b所示）。

  1. 保持芯片在培养板中，移除约90%的培养基，仅保留足够防止芯片干燥的液体。
    注意：必须确保芯片始终不干燥，以避免染色伪影并防止细胞从表面脱落。由于黏附图案之间芯片表面具有疏水性，芯片可能容易发生脱水。在此阶段，固定剂可能导致较大的穹顶状菌落从芯片上脱落。洗涤操作应极为轻柔，最好将液体沿孔壁加入，避免直接滴加到芯片上。
  2. 每孔加入至少500 µL基于多聚甲醛（PFA）的固定液，孵育10分钟。
    注意：如果菌落明显较厚（超过5层细胞），可能需要将固定时间调整为20分钟。
  3. 固定后，用洗涤液（含0.01%泊洛沙姆407的PBS）洗涤3次。可额外增加一次洗涤，使用50 mM NH4Cl溶于洗涤液中，以淬灭残留的PFA交联活性。
  4. 将样品在封闭液中孵育至少30分钟。
    注意：此阶段样品可在4 °C保存约一周后再进行染色。若需保存，应用实验室封口膜密封培养板以防止蒸发。

5. 免疫染色

  1. 通过在10 cm方形培养皿底部放置一张实验室用膜，制备染色 chamber。
  2. 配制抗体溶液（参见表3，获取本文所用抗体及其稀释比例的列表）。
  3. 将芯片放入染色 chamber 中，使承载细胞的一侧朝上，并立即在芯片上加入100 µL一抗溶液。
    警告：在此步骤中，芯片不应像步骤4.1那样容易发生去润湿现象。但仍需小心操作，确保芯片不干燥。若需处理多个芯片，应依次对每个芯片执行步骤5.3。
  4. 在室温下于旋转平台上孵育1小时。
    注意：如果细胞已形成较大的三维结构，可能需要更长的孵育时间以实现样品的均匀染色。孵育时间可延长至24小时。但此时染色 chamber 内必须放置一个盛有水的3 cm培养皿，并用实验室用膜密封染色 chamber，以防止蒸发。
  5. 将芯片转移至新的多孔板中，并用洗涤液清洗3次。
  6. 按照步骤5.3和5.4所述方法进行二抗孵育。
  7. 使用20 µL任何标准封片介质（例如Mowiol）将芯片封固于显微镜载玻片上。

6. 成像

注意：成像可在标准共聚焦显微镜上进行。此处仅提供一些建议，以确保图像质量足以满足后续定量分析的要求。

注意：为避免操作者偏差，选择成像菌落时应仅依据核膜信号（以判断菌落是否良好地符合图案形状）。除调整显微镜设置外，应避免观察目的标记物的信号。

  1. 确保采集位深度为 12 或 16 位。
  2. 确定合适的设置，以最大化每个图像通道的动态范围。特别注意避免图像截断。
  3. 包含一个用于成像微图案自发荧光的通道（见图 3）。
  4. 调整图像尺寸和缩放倍数，使 x 和 y 轴上的体素大小在 0.1 至 0.6 µm 之间，z 轴上的体素大小在 0.2 至 2 µm 之间。
    注意：例如，在本研究中，我们使用了一台倒置扫描共聚焦显微镜，配备 40 倍物镜（数值孔径为 1.3），图像尺寸为 1024 × 1024 像素，无数字缩放，z 轴步长为 0.5 μm。由此得到的体素大小为 0.38 µm × 0.38 µm × 0.5 μm。
  5. 针对每个菌落，定义 z 轴方向上的最小和最大位置，以确保完整采集整个菌落。菌落上下方均应至少包含一个信号较低或无信号的层面。
  6. 确保 z 轴堆栈的采集方向保持一致（始终从顶部到底部，或始终从底部到顶部）。
  7. 调节扫描速度、图像分辨率、帧平均次数和探测器增益，以在图像质量和成像时间之间达到最佳平衡。作为参考，如图 3所示的一个菌落的成像时间约为 2–3 分钟。进行图像采集。
    警告：所有图像若需相互比较，必须在相同的显微镜上使用相同的物镜和采集参数进行采集。
  8. 采集结束后，保存所有图像，并采用统一的命名规则，以标识每幅图像所对应的实验条件。
    注意：参见图 4中的示例，该命名规则将在后续分析过程中使用。请注意，图像可保存为 BioFormats 26 支持的任意格式。如果菌落大于视场范围，可使用 ImageJ 的拼接插件27。另请注意，在拼接情况下，可能需要进行照明渐晕校正。

7. 图像分析

注意：本实验步骤推荐的计算机配置为：16 GB 内存、多核 3.33 GHz CPU，以及至少 50 GB 硬盘空间（具体需求取决于已成像芯片的数量）。该软件已在 Linux、Windows 和 MacOS 系统上进行测试。PickCells 是一款跨平台的图像分析应用程序，配备图形用户界面，专用于分析复杂多维图像中细胞的集体组织结构（Blin 等，正在准备中）。请注意，有关 PickCells 的更多信息以及本文提及的各个模块的详细文档可在线获取：https://pickcellslab.frama.io/docs/。此外，由于我们持续改进软件，用户界面可能会有所变更。若实际界面与图示或视频中的内容不一致，请参考在线手册。

  1. 按照在线提供的文档安装并运行 PickCells。
  2. 导入图像并验证所提供信息的准确性（图 4-1）。
  3. 记录每个通道的名称。
  4. 使用 Nessys 模块根据核膜信号对细胞核进行分割28（图 4-2），并提供一个前缀（例如“nuclei”），用于命名生成的分割图像。
    注：有关使用方法和参数调整的文档可在 https://framagit.org/pickcellslab/nessys 查阅。
  5. 如有必要，使用分割编辑器模块检查和编辑分割结果（图 4-3）
    注：如果由于任何原因分割过程未产生满意的结果，请手动删除数据库文件夹中的图像，并删除 MetaModel 视图中的“segmentation result”节点，然后重复步骤 7.4 和 7.5。如果仅少数图像的分割结果不满意，则使用 Nessys 独立应用程序（参见 7.4 中的链接），对“有问题的图像”尝试重新分割，并替换数据库文件夹中对应的文件。
  6. 使用基础分割模块对模式自发荧光信号进行分割（图 4-4）
    1. 提供一个前缀（例如“pattern”），用于命名生成的分割图像。
    2. 选择包含自发荧光信号的通道。
    3. 应用去噪处理；通常使用核大小为 10 × 10 × 0.5 体素的高斯滤波器可获得满意结果。
    4. 设置下阈值，使背景显示为蓝色，前景显示为白色；同时将上阈值设为最大值，以避免高强度区域（红色区域）被排除在最终结果之外。
    5. 最后一步选择 跳过。
    6. 点击 完成，并等待所有图像处理完毕。
  7. 与细胞核类似，现在可使用分割编辑器模块对模式分割结果进行视觉检查和必要修正（图 4-5）。
  8. 创建细胞核对象并计算基本对象特征。
    1. 从主界面左侧的任务栏中启动 intrinsic features 模块（图 4-6）。
    2. 关闭 Ellipsoid Fitter 和 Surface Extractor 面板，仅保留 Basic Features 面板打开。
    3. 选择 Nucleus 作为对象类型，并选择步骤 7.4 中为“segmented images”指定的前缀。
    4. 点击 计算，并等待所有图像处理完成。
      注：此步骤完成后，将无法再次编辑细胞核的分割结果。
  9. 创建模式对象并计算基本对象特征。重复步骤 7.8.1 至 7.8.4，但此次选择 Custom Type 作为对象类型，并使用步骤 7.6.1 中为 segmented images 指定的前缀。
    注：此步骤完成后，将无法再次编辑模式的分割结果。
  10. 将每个细胞核所属图像的名称作为细胞核属性进行存储。
    1. 点击 数据 > 新建属性，在弹出对话框中选择 Nucleus，然后点击 确定。
    2. 选择 从与该节点连接的其他对象收集数据，然后点击 下一步。
    3. 在左侧面板中选择 Image，然后在 路径定义 面板中双击 完成 标志下的问号，将图像节点设置为路径目标。
    4. 展开左侧面板中的 可用属性 区域，并选择 name 属性。
    5. 展开 归约操作 区域，选择 获取一个，然后点击 更改 按钮，再点击 下一步。
    6. 输入“Image Name”，按 Tab 键，然后点击 确定。
  11. 在细胞核对象中创建“归一化坐标”属性（图 4-7）。
    1. 调整步骤 7.10.1 至 7.10.6，将模式质心的坐标作为细胞核属性进行存储。将此新属性命名为“Pattern Coordinate”。
    2. 然后，点击 数据 > 新建属性，选择 Nucleus，然后点击 确定。
    3. 选择 定义节点的空间或方向向量之间的函数，然后点击 下一步。
    4. 在 函数类型 中选择 数组操作，V1 选择 项目向量，然后选择 质心；V2 选择 项目向量，然后选择 Pattern Coordinate。
    5. 点击 下一步，在 名称 字段中输入“Normalised Coordinate”，然后点击 完成。
  12. 将数据导出为制表符分隔值文件。

8. R 分析

  1. 下载并安装 Rstudio。
    注意：软件信息和下载链接请访问 https://www.rstudio.com/。
  2. 下载本分析所需的 R 脚本。
    注意：脚本可从 GitLab 仓库下载：https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr。
  3. 启动 Rstudio。
    注意：若首次运行脚本，请安装所需的 R 包（ggplot2 和 scales）。
  4. 在 Rstudio 中打开 binnedmap_template.R 脚本。
  5. 将工作目录设置为源文件所在位置。
  6. 按照脚本中的说明修改脚本，以适配任意给定数据集，从而生成如图5所示的空间分布图。
  7. 运行脚本以生成密度图。

结果

本文所述的光刻图案化方法可将培养的细胞精确地组织成具有特定形状和大小的细胞集落。该实验操作的成功与否在细胞接种后（步骤 3.7）即可明显观察到，贴壁细胞将按照光掩模的设计排列（如图 2a所示）。细胞接种1小时后，各个图案可能尚未完全融合（每个图案仅有少量细胞），但随着细胞随时间增殖，图案区域将被细胞完全占据，仅有极少数细胞位于黏附区域之外（图 2b）。培养结果的具体形态取决于所使用的细胞系。例如，小鼠胚胎干细胞（mESC）会形成穹顶状的集落10。若在细胞接种后1至2小时内芯片上的图案仍不清晰，则表明实验失败（图 2c、d）。

较大且较厚的菌落有时难以实现均匀染色。我们建议将细胞固定与通透步骤合并为一步（第4节），因为这有助于提高抗体的渗透性29。这也是所选固定液中含有去污剂的原因。 图3 展示了免疫染色后预期的荧光信号。请注意，明亮的Id1阳性细胞位于菌落的致密区域（明亮的NPC区域）内（图3A）。此类特征有助于评估抗体染色实验的质量。同时请注意，本技术所构建的微图案具有自发荧光。该信号（图3A、B 最左侧图像）在分析阶段可用于将不同菌落进行空间配准，并生成如 图5 所示的结果。当使用405 nm激光激发时，自发荧光信号通常最强，因此应保留该通道不进行染色。 图3 还展示了细胞如何被精确限制在不同形状的图案上。

成像数据的分析在 PickCells 中进行，PickCells 是由我们实验室开发的一款免费开源软件（Blin 等，待发表）。该软件包含用于读取和分类共聚焦图像的图像分析模块（图 4-1），用于对象分割（图 4-2、4-4）和校正分割对象（图 4-3,4-5），计算对象特征（如坐标或平均强度）（图 4-6），以及导出数据（图 4-7,4-8）。重要的是，我们开发了一种名为 Nessys28 的稳健的核分割方法，特别适用于密集且异质性的细胞群体，例如生长在微图案上的细胞（图 3）。图 4-2 展示了 Nessys 模块的一个代表性输出结果，其中每个单独的细胞都被准确地赋予唯一的颜色标识。通常仅需极少的手动编辑，但若用户需要，也支持进行编辑（图 4-3）。最后，PickCells 提供了多种数据可视化模块。图 4-6 展示了一个示例：一个环形细胞群以 3D 形式呈现，细胞核根据其在 z 轴上的位置进行颜色编码。在 PickCells 中完成分析验证后，可将数据导出，并利用位于 https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr 的脚本在 R 中生成空间图谱，如 图 530 所示。

我们最近的研究表明，在较小的（30,000 µm2）圆形或椭圆形微图案上对小鼠胚胎干细胞（mESC）进行空间限制，可引导表达中胚层标志物Tbra的细胞亚群形成特定分布模式10。因此，为了在此说明我们的方法，我们探究了在较大的细胞集落（90,000 µm2）中，BMP信号通路是否会影响Tbra的分布模式。图5A显示，当mESC在较大的圆形微图案上生长时，Tbra阳性细胞主要局限于图案的边缘区域（Tbra+ 密度图），而该区域的局部细胞密度最低（见图5A左侧的蓝色图谱）。Tbra的这种分布模式也通过平均Tbra荧光强度图得到了验证。

这些数据表明，该方法能够揭示肉眼无法观察到的信息。实际上，从图3可以看出，仅通过目视检查一个菌落，不足以识别Tbra表达的任何空间组织形式。这主要是由于菌落间的显著变异性所致，该变异性已被量化，并显示在图5A最右侧的面板中。

该技术还显示，Id1（BMP 信号通路的一个靶基因）不存在可检测到的模式化分布，这可能表明在此背景下，T 细胞的模式化发育并非由 BMP 信号通路驱动。

微图形化技术使得迫使细胞群落采用几乎任何所需几何形状成为可能。这对于研究系统如何响应不同几何形状尤为有用。例如，我们可以推断，如果形态发生素梯度在群落中心形成，则在群落中创建一个孔洞将破坏该梯度。有趣的是，我们仍然能在环形微图形上观察到模式形成，尽管其稳健性有所降低（图5B）。

光刻方法示意图：光刻、细胞接种、免疫染色、图像分析。
图1：方法概述。 该示意图展示了本方法的主要步骤。对于每个步骤，其名称下方标明了预估所需时间，同时配有示意图以说明该操作的目的。在有相关图示时，还提供了对应的参考图编号。请点击此处查看本图的放大版本。

生物技术研究中水凝胶液滴内细胞包封效率的显微镜图像。
图 2：细胞接种到微图案上后 1 小时和 48 小时的培养情况。 接种到微图案上的小鼠胚胎干细胞（mESC）的明场图像。（a）接种后 1 小时预期的细胞排列情况，图案应清晰可辨。（b）培养 48 小时后的预期结果。mESC 已增殖，并仍严格局限于图案形状内。（c–d）可能的非理想结果：要么极少细胞黏附于塑料表面，仅在载玻片边缘有细胞（c），要么细胞黏附在图案之间的区域（d）。参见表 2获取故障排除指南。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞分化，荧光显微镜；Id1、NPC、Tbra、LaminB1 在圆盘/环状结构中的分布。
图3：在微图案上生长的免疫染色克隆的代表性共聚焦图像。
经免疫荧光染色后的小鼠胚胎干细胞（mESC）克隆代表性图像，分别为（A）Id1 与核孔复合体（Nuclear Pore Complex），以及（B）Tbra 与 LaminB1。每种染色均展示了一个在圆盘形微图案上生长的克隆和一个在环形微图案上生长的克隆。各单独通道以灰度图像呈现。请注意微图案在405 nm激光激发下产生的明显自发荧光信号。比例尺为50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

共聚焦图像分析工作流程；细胞核分割；坐标归一化；导出；示意图。
图 4：图像分析流程图。 一组 3D 共聚焦图像被导入 PickCells 进行分析（1）。本示例展示了一个包含两种不同形状（如 图 2 中的圆盘和环形）的实验。左侧显示图像命名规则，右侧为 PickCells 界面。随后使用 Nessys 模块自动分割细胞核（2）。在截图中，每个独立的细胞核被赋予唯一颜色，表明分割准确。图案的自发荧光也通过“基础分割”模块进行分割（4），其中背景显示为蓝色，白色信号定义为图案形状。分割后的形状随后进行视觉检查以确保准确性，并可根据需要使用分割编辑器模块进行修改（3–5）。截图展示了检测到的形状轮廓，其中粉红色和黄色的形状已被编辑。最后，计算对象特征并导出至文件，供后续在 R 中处理（6–7）。此处提供了一个以 3D 视图呈现的菌落截图（6）。对于步骤 2 至 6，在撰写本文时 PickCells 界面中对应的图标已列于步骤编号旁。请点击此处查看该图的放大版本。

空间细胞密度与强度分析；显微镜数据，Tbra 和 Id1 蛋白可视化。
图 5：两种不同转录因子及微图形形状的代表性结果
小鼠胚胎干细胞（mESC）在微图形上培养 48 小时后的分箱空间图，分别为（A）圆形微图形或（B）环形微图形。对于每种微图形形状，左侧显示的是细胞密度图（不区分细胞表型），采用蓝色色阶表示。随后针对每个标记物（上排为 Tbra，下排为 Id1），从左至右分别提供三张不同的图：仅表达该标记物的细胞的密度图（基于阈值分析）、标记物平均强度（log2）图，以及标记物强度标准差图。强度值以任意荧光单位表示。每张图中，微图形的轮廓以白色线条标示。请点击此处查看该图的放大版本。

ECM 类型明胶纤连蛋白基底膜基质
浓度ECM 浓度1 mg/mL20 μg/mL200 μg/mL
泊洛沙姆 407 浓度500 μg/mL400 μg/mL1 mg/mL
测试条件mESC是是是
mEpiSC否是是
无血清培养基否是是

表1：测试的泊洛沙姆407和ECM浓度。 本表概述了我们在实验室中测试的ECM和泊洛沙姆407的浓度。对于每种ECM/泊洛沙姆407组合，列出了成功实现图案化的细胞类型，以及培养体系中是否含有血清。mESC = 小鼠胚胎干细胞，mEpiSC = 小鼠上胚层干细胞。

操作步骤观察现象可能问题解决方案
微图案化细胞贴附率低ECM/泊洛沙姆307浓度比例不适当提高ECM/泊洛沙姆307的浓度比例
细胞贴附时间过短延长孵育时间，确保细胞有足够时间充分贴附于图案上（步骤3.4）。为优化此步骤，可在显微镜下观察细胞形态变化，以判断细胞是否开始贴附。
洗涤过于剧烈（步骤3.6）更换培养基时，避免将液体直接吹打到芯片表面。应将液体轻轻加至孔壁边缘
细胞在图案之间发生贴附ECM/泊洛沙姆307浓度比例不适当降低ECM/泊洛沙姆407的浓度比例
细胞贴附时间过长缩短孵育时间（步骤3.4）。
洗涤效果不佳（步骤3.6）通常剧烈振荡培养板即可有效去除多余细胞。对于倾向于强烈贴附于芯片的细胞类型，可尝试将液体直接吹打至芯片表面以改善结果。增加洗涤次数也可能有所帮助，特别是确保此步骤后培养基中无悬浮细胞残留。
细胞未严格沿图案形状生长细胞类型与图案几何形状不匹配在光掩模上设计多种几何形状和尺寸，以便测试并确定特定细胞类型和图案形状下的最佳图案尺寸。详见讨论部分的“局限性”章节
光图案化效果不理想，可通过观察自发荧光信号的清晰度进行判断。图案边界应如图2所示清晰锐利。若图案边缘模糊，则需改进光图案化步骤。图案边缘模糊表明在光照过程中塑料载片与掩模表面之间距离过大。应确保固定载片与光掩模的部件平整，并在整个光照过程中施加均匀且足够的压力。
染色染色不均匀抗体孵育时间过短延长抗体孵育时间（室温下最长可达24小时）
封片过程中菌落被压平使用如Chamlide或Cytoo-chambers等成像培养室对微图案载片进行染色和成像，无需传统封片操作。这将更好地保持菌落的三维结构。
染色过程中菌落脱落芯片发生去润湿现象保留适量液体，或使用两支移液器，一支用于移除旧液，另一支用于加入新溶液
显微镜下菌落呈现剪切状在将芯片安装至显微镜载片时菌落受到剪切力安装芯片时务必轻柔操作。或者，可使用如Chamlide或Cytoochambers等成像培养室进行免疫染色和成像，避免传统封片过程。这也有助于保持菌落的超微结构。

表2：故障排除指南。 本表概述了可能出现的非理想结果，同时列出了问题的潜在原因及建议的解决方案。

讨论

本文介绍了一种用于分析细胞培养中涌现性模式的方法。采用简化的微图形化技术来标准化细胞集落的形状和大小，并提供了图像分析工具和R语言脚本，以实现对这些集落内模式的检测与定量分析。

我们提出的流程在某种程度上与先前发表的一种方法相似31，该方法中作者专注于培养条件，利用市售的微图案技术，在胚胎干细胞（ESC）集落中实现可重复的胚层形成，以研究体外早期原肠胚形成事件。我们的目标更侧重于提供一种可推广的流程，用于发现体外的模式形成，其中细胞的集体组织特征可能只有在统计分析后才会显现。为此，我们提供了一套稳健的图像分析工作流程，能够对多个集落中细胞核在三维空间中的位置进行精确定位与分析（另请参见本讨论部分的“模式检测方法的优势与局限性”一节）。此外，我们决定开发一种简易的实验室自制微图案技术，从长远来看，该方法比市售方案更具灵活性且成本更低，我们希望这一方法能对科研社区有所帮助。

最后，我们注意到，在本稿件修订期间，已发布了一种新的软件包，可用于体外模式分析，其功能与我们的 R 脚本类似32。该新软件包接受细胞特征表格作为输入，这些表格可来自高通量成像平台。我们认为，本方案第7步生成的细胞核特征表格在理论上可作为该新软件包的输入数据，但我们尚未亲自验证这一可能性。

该方法对其他细胞类型和菌落形态的适用性

本文以多能性细胞在含血清培养条件下研究中胚层转录因子的出现为例，介绍该方法的应用。然而，该方法也可轻松适用于其他细胞类型以及无血清培养体系，尽管可能需要优化细胞外基质（ECM）/泊洛沙姆407的浓度（参见表1中的测试浓度和表2中的故障排除指南）。该方法还可根据用户需求，适配于不同大小和多种形状的微图案。然而，在建立该方法时需注意，并非所有形状与细胞类型的组合都是最优的。例如，小鼠胚胎干细胞（mESC）高表达E-钙黏蛋白33, 34，使其能够形成跨越无ECM区域的集体结构。这类细胞不会严格遵循具有锐角或包含小孔的图案几何形状。例如，在图3B的环形图案中，细胞正在向中心区域迁移定植。在我们的实验中，即使减小中心区域面积，也无法迫使mESC形成环状集落。因此，强烈建议在设计光刻掩模时包含多种几何形状，以便测试并确定最适合目标细胞类型的尺寸和曲率。

另一个需要考虑的重要因素是实验持续时间和细胞的增殖速率。对于某些快速增殖的细胞类型（包括多能性细胞），在微图案上维持细胞多天可能较为困难（对于小鼠胚胎干细胞，最多为三天）。此外，细胞在微图案上的接种并不总能在每个克隆中达到理想效果，因此建议接种过量的克隆，以备备用。

模式检测方法的优势与局限性

该方法的一个显著优势是能够通过整合多个重复菌落的图像分析结果来检测“平均化”模式（图5），从而揭示单个菌落观察中不明显的模式形成事件。这种“平均化”方法的缺点是可能遗漏某些类型的重复性模式，例如小斑点或细窄条带。然而，通过精心选择的模式尺寸组合，反而可能揭示此类模式8。此外，本文所述的图像分析流程可在单细胞和菌落两个分辨率水平上提供定量数据，从而能够研究菌落间的变异程度（图5），或在多个尺度上进行邻近细胞分析10。

平均化方法的另一个重要优势在于，它能够绘制多种标志物的优先定位，而不受检测通道可用荧光染料的限制。事实上，尽管本文所展示的工作中仅使用了两种分化标志物，但通过对类器官进行标准化并提取“平均”模式，使得不同类器官组的分布图可以相互比较，从而揭示标志物之间普遍存在的空间关系。

此外，尽管本文的重点是研究分化标志物，但该分析方法也可扩展应用于其他具有细胞核标志物的生物学过程。例如，利用表达荧光泛素化细胞周期指示剂35（FUCCI）的细胞系进行微图形化，可研究群体水平上集落几何形态对细胞周期事件的影响。

未来方向

该方法适用于中等通量的图像分析，但目前图像采集尚未完全自动化，在进行规模较大的实验时可能成为限制因素。由于菌落排列规则，有望建立完全自动化的采集程序，类似于已为单细胞平均化所开发的方法20。然而，由于成像单个菌落所需的视场较大，可能需要图像拼接，并且菌落具有三维结构，因此通过仅对相关菌落进行成像来减少数据集大小和采集时间显得尤为重要。因此，未来的研究工作可致力于开发一种“智能”显微镜，能够识别出相关菌落并针对每个样本自适应调整成像坐标。这不仅将减少时间和工作量，还能避免潜在的操作者偏差。

通过减少用户所需执行的步骤数量，分析流程还可以变得更加高效。我们计划构建一个流程构建机制，并将 R 直接集成到我们的软件中（另请参见代码仓库问题跟踪系统中的问题 pickcells-api#3 和 pickcells-rjava#1 [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]）。分析流程的完全自动化将减少时间和精力消耗，并限制潜在的用户错误。

最后，我们注意到，目前的分析方法尚未完全捕捉到细胞模式形成的动态特性。通过分析一系列快照图像，可以提取部分有限的动态信息8,10,36。然而，若要更深入地理解模式是如何形成的，能够记录细胞群体的历史动态将是非常理想的。一个主要限制在于，在三维密集的细胞群体中准确追踪单个细胞仍是一项极具挑战性的任务37。我们的细胞检测方法利用核膜信号，在密集且相互重叠的细胞群体中表现出色28。标记核膜的活细胞报告系统已广泛可用28,38，而微图案技术的一个优势在于，它可被用于防止细胞在长时间成像过程中移出视野。总体而言，我们相信，结合近年来已建立的多种工具28,39,40，实现细胞的自动追踪是可行的，这将为理解自组织的基本原理带来新的见解。

披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

本工作由Sir Henry Wellcome博士后奖学金（WT100133，授予G.B.）、Wellcome Trust高级研究员奖学金（WT103789AIA，授予S.L.）以及Wellcome Trust博士研究生奖学金（108906/Z/15/Z，授予D.W.）资助。我们还感谢Manuel Thery博士在改进光图案化技术方面提供的建议。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇Gibco31350-010在通风橱中操作
1× 主石英抗反射铬掩膜板Toppan Photomask定制设计
24孔板Corning3526
4孔板Nunclon Delta176740
5% 驴血清SigmaD9663
抗核孔复合物抗体Abcamab24609小鼠单克隆抗体，使用比例1:1000
抗Id1抗体Biocheck37-2兔多克隆抗体，使用比例1:200
抗Lamin B1抗体Abcamab16048兔多克隆抗体，使用比例1:1000
抗Tbra抗体R&DAF2085山羊多克隆抗体，使用比例1:400
封闭液NANA0.1% TritonX-100
0.01% Pluronic F-127
5% 驴血清
0.003% 叠氮化钠
溶于PBS
CGR8 mESCNANA参考文献：Mountford 等，PNAS，1994
固定液NANA4% 多聚甲醛溶于洗涤液
胎牛血清Gibco10270-106血清批次必须经过测试以确保适用于胚胎干细胞的维持
明胶SigmaG1890
格拉斯哥最低必需培养基SigmaG5154
实验室封口膜VWR291-1212
版图编辑软件LayoutEditorNAhttps://layouteditor.com/
版图编辑软件KlayoutNAhttps://www.klayout.de/
L-谷氨酰胺Gibco25030-024
LIFMilliporeESG1107
MEM 非必需氨基酸Gibco11140-035
mESC 培养基NANAGMEM
10% FCS
100 U/ml LIF
100 nM 2-巯基乙醇
1× 非必需氨基酸
2 mM L-谷氨酰胺
1 mM 丙酮酸钠
50 mM NH4ClSigma9718
多聚甲醛Sigma158127注意：有毒，稀释前在通风橱中操作，并佩戴防护装备
PBS（免疫染色用）SigmaP4417溶于200 ml ddH2O
PBS（组织培养用）Gibco11140-035
塑料载玻片IbidiIB-10813
泊洛沙姆407SigmaP2443
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂Molecular ProbesP36930
叠氮化钠Sigma8591注意：有毒，在通风橱中操作，并佩戴防护装备
丙酮酸钠Gibco11360070
TritonX-100SigmaT8532
胰蛋白酶Gibco25200056
UVO 清洗仪Jetlight, USA42-220注意：遵循制造商’的安全建议
洗涤液NANA0.1% TritonX-100
0.01% Pluronic F-127
溶于PBS

参考文献

  1. Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
  2. Turner, D. A., Baillie-Johnson, P., Martinez Arias, A. Organoids and the genetically encoded self-assembly of embryonic stem cells. BioEssays. 38 (2), 181-191 (2016).
  3. Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
  4. Tewary, M., Shakiba, N., Zandstra, P. W. Stem cell bioengineering: building from stem cell biology. Nature Reviews. Genetics. 19 (10), 595-614 (2018).
  5. Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20 (8), 878(2018).
  6. Laurent, J., et al. Convergence of microengineering and cellular self-organization towards functional tissue manufacturing. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 939(2017).
  7. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).
  8. Tewary, M., et al. A stepwise model of Reaction-Diffusion and Positional-Information governs self-organized human peri-gastrulation-like patterning. Development. , (2017).
  9. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
  10. Blin, G., Wisniewski, D., Picart, C., Thery, M., Puceat, M., Lowell, S. Geometrical confinement controls the asymmetric patterning of brachyury in cultures of pluripotent cells. Development. 145 (18), (2018).
  11. Micropatterning in cell biology. Pt. A. , Elsevier. Amsterdam. (2014).
  12. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), Dayton, Ohio. 2300-2310 (2008).
  13. Heemskerk, I., Burt, K., Miller, M., Chabra, S., Guerra, M. C., Warmflash, A. Morphogen dynamics control patterning in a stem cell model of the human embryo. bioRxiv. , 202366(2017).
  14. Nemashkalo, A., Ruzo, A., Heemskerk, I., Warmflash, A. Morphogen and community effects determine cell fates in response to BMP4 signaling in human embryonic stem cells. Development. 144 (17), 3042-3053 (2017).
  15. Peerani, R., Onishi, K., Mahdavi, A., Kumacheva, E., Zandstra, P. W. Manipulation of signaling thresholds in “engineered stem cell niches” identifies design criteria for pluripotent stem cell screens. PloS One. 4 (7), e6438(2009).
  16. Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. The EMBO journal. 26 (22), 4744-4755 (2007).
  17. Etoc, F., et al. A Balance between Secreted Inhibitors and Edge Sensing Controls Gastruloid Self-Organization. Developmental Cell. 39 (3), 302-315 (2016).
  18. Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep UVs. Methods in Cell Biology. 97, 133-146 (2010).
  19. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
  20. Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (46), e2514(2010).
  21. Beddington, R. S. P., Rashbass, P., Wilson, V. Brachyury - a gene affecting mouse gastrulation and early organogenesis. Development. 116 (Supplement), 157-165 (1992).
  22. Wilkinson, D. G., Bhatt, S., Herrmann, B. G. Expression pattern of the mouse T gene and its role in mesoderm formation. Nature. 343 (6259), 657-659 (1990).
  23. Hollnagel, A., Oehlmann, V., Heymer, J., Rüther, U., Nordheim, A. Id Genes Are Direct Targets of Bone Morphogenetic Protein Induction in Embryonic Stem Cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19838-19845 (1999).
  24. Mountford, P., et al. Dicistronic targeting constructs: reporters and modifiers of mammalian gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4303-4307 (1994).
  25. Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of tissue culture methods. 13 (2), 89-94 (1991).
  26. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  27. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  28. Blin, G., Sadurska, D., Migueles, R. P., Chen, N., Watson, J. A., Lowell, S. Nessys: a novel method for accurate nuclear segmentation in 3D. bioRxiv. , 502872(2018).
  29. Weiswald, L. -B., Guinebretière, J. -M., Richon, S., Bellet, D., Saubaméa, B., Dangles-Marie, V. In situ protein expression in tumour spheres: development of an immunostaining protocol for confocal microscopy. BMC cancer. 10, 106(2010).
  30. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org/ (2013).
  31. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nature Protocols. 11 (11), 2223-2232 (2016).
  32. Ostblom, J., Nazareth, E. J. P., Tewary, M., Zandstra, P. W. Context-explorer: Analysis of spatially organized protein expression in high-throughput screens. PLOS Computational Biology. 15 (1), e1006384(2019).
  33. Larue, L., Ohsugi, M., Hirchenhain, J., Kemler, R. E-cadherin null mutant embryos fail to form a trophectoderm epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (17), 8263-8267 (1994).
  34. Pieters, T., van Roy, F. Role of cell-cell adhesion complexes in embryonic stem cell biology. J Cell Sci. 127 (12), 2603-2613 (2014).
  35. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  36. Morgani, S. M., Metzger, J. J., Nichols, J., Siggia, E. D., Hadjantonakis, A. -K. Micropattern differentiation of mouse pluripotent stem cells recapitulates embryo regionalized cell fate patterning. eLife. 7, e32839(2018).
  37. Ulman, V., et al. An objective comparison of cell-tracking algorithms. Nature Methods. 14 (12), 1141(2017).
  38. Moir, R. D., Yoon, M., Khuon, S., Goldman, R. D. Nuclear Lamins a and B1. The Journal of Cell Biology. 151 (6), 1155-1168 (2000).
  39. McDole, K., et al. In Toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
  40. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Developmental Cell. 36 (2), 225-240 (2016).

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