一种无需交联剂制备壳聚糖-聚（乙烯醇）水凝胶的冻融方法及双氟尼酸释放研究

摘要

冻融法用于制备无需交联剂的壳聚糖-聚（乙烯醇）水凝胶。采用该方法时，需考虑冷冻条件（温度、冻融循环次数）和聚合物比例，这些因素会影响所获得水凝胶的性能和应用。

摘要

通过冻融法可制备壳聚糖-聚（乙烯醇）水凝胶，且无需使用有毒交联剂。这些体系的应用受限于其特性（如孔隙率、柔韧性、溶胀能力、载药能力及药物释放能力），而这些特性取决于冷冻条件以及聚合物的种类和比例。本实验方案描述了如何以50/50 w/w%的聚合物配比制备壳聚糖和聚（乙烯醇）水凝胶，并通过改变冷冻温度（-4 °C、-20 °C、-80 °C）和冻融循环次数（4、5、6次冻融循环）来调控其性能。获取了水凝胶的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、扫描电镜（SEM）图像及孔隙度数据。同时评估了水凝胶的溶胀能力以及双氟尼酸的载药与释放行为。SEM图像和孔隙度分析结果表明，随着温度降低，孔径减小而孔隙率增加。在较低冷冻温度下，溶胀百分比更高。研究了双氟尼酸从水凝胶中的释放行为。所有凝胶网络均可维持药物释放达30小时，且根据Korsmeyer-Peppas模型和Higuchi模型分析，双氟尼酸的释放由简单的扩散机制调控。

引言

近年来，水凝胶因其具有高含水量、柔软且柔韧的三维网络结构，在生物医学领域受到广泛关注，能够轻易模拟天然组织¹。此外，水凝胶在生理温度和pH条件下不溶于水性介质，但可发生显著溶胀²。水凝胶可用作组织工程支架、卫生用品、隐形眼镜和伤口敷料；由于其能够包埋并释放活性化合物和药物，因此也被用作药物递送系统³。根据具体应用需求，水凝胶可由天然聚合物、合成聚合物或两者的组合制备，以获得最佳性能特征⁴。

水凝胶的性质是多种物理和化学因素共同作用的结果。在物理层面，其结构和形貌取决于孔隙率、孔径大小以及孔分布⁵。在化学和分子层面，聚合物类型、聚合物链中亲水基团的含量、交联点类型以及交联密度是决定溶胀能力和机械性能的关键因素^6,7。

根据形成网络所用交联剂的类型，水凝胶可分为化学水凝胶和物理水凝胶。化学水凝胶通过链间的共价相互作用连接而成，这种共价键可通过紫外光或γ射线辐照，或使用交联剂形成^7,8。化学水凝胶通常具有较高的强度和稳定性，但一般而言，所用交联剂对细胞具有毒性，且难以完全去除，因此其应用受到限制。另一方面，物理水凝胶通过聚合物链之间的非共价相互作用连接而成，无需使用交联剂^4,9。网络中的主要非共价相互作用包括疏水相互作用、静电作用力、互补作用以及氢键⁷。

聚乙烯醇（PVA，图1a）是一种合成的水溶性聚合物，具有优异的机械性能和生物相容性，可通过冻融法制备无需交联剂的水凝胶^10,11。当该聚合物冻结时，其分子链上的羟基（-OH）之间可形成高浓度的氢键区域（即结晶区）¹²。这些结晶区在凝胶网络中起到交联点的作用，其形成受到两个过程的促进：一是冰晶膨胀使聚合物链相互靠近，二是在冷冻过程中PVA的构象从全同立构转变为间同立构¹³。由于冷冻干燥过程中冰晶发生升华，留下空隙，从而形成水凝胶中的孔隙¹⁴。为了获得性能更优的水凝胶，PVA可 facile 地与其他聚合物复合使用。

从这一角度来看，壳聚糖是一种理想的选择，因为它是自然界来源中唯一带正电荷的生物聚合物。壳聚糖通过甲壳素的脱乙酰化获得，由β-1,4连接的D-葡糖胺（脱乙酰化单元）和N-乙酰-D-葡糖胺（乙酰化单元）随机组合构成^15,16（图1b）。壳聚糖可被人源酶降解，且具有良好的生物相容性。此外，由于其阳离子特性，能够与细胞表面的负电荷相互作用，这一性质被认为与其抗菌活性相关¹⁷。该聚合物易于加工处理，但其机械性能不足，因此常添加其他材料形成具有更优特性的复合物。

考虑到壳聚糖和聚乙烯醇（PVA）的特定性质，已通过冻融法成功制备出水凝胶^2,18，从而避免使用有毒交联剂。在壳聚糖-PVA 水凝胶中，PVA 的结晶区同样形成，壳聚糖链相互贯穿，并与 PVA 中的 -NH₂ 基团和 -OH 基团形成简单的氢键。最终的壳聚糖-PVA 水凝胶具有良好的机械稳定性、高溶胀率、低毒性以及抗菌性能¹⁸。然而，最终材料的特性会因制备过程中所采用的冷冻条件（温度、时间及循环次数）不同而发生变化。一些研究表明，增加冷冻循环次数会降低溶胀度，同时提高拉伸强度^19,20。为了增强网络结构，在冻融制备后还可额外采用伽马射线或紫外光辐照以及化学交联剂等辅助手段^21,22,23。壳聚糖比例较高的水凝胶具有更多孔的网络结构和更高的溶胀能力，但机械强度和热稳定性较低。因此，在制备过程中需充分考虑工艺条件，以获得适用于特定应用目标的合适水凝胶。

本研究的目的是详细阐述冷冻条件（冷冻温度和冻融循环次数）如何影响CS-PVA水凝胶的最终特性。评估了其傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、形态与孔隙特性、溶胀能力，以及药物负载和释放能力。在释放实验中，选用双氟尼酸（图1c）作为模型药物，因其分子尺寸与水凝胶结构相匹配。

方案

1. 壳聚糖-PVA 水凝胶的制备

1. 制备2% (w/w) 壳聚糖和10% (w/w) 聚乙烯醇（PVA）溶液。将0.2 g壳聚糖溶解于10 mL已预先过滤的0.1 M CH₃COOH溶液中，在室温下持续机械搅拌过夜。将1 g PVA溶解于10 mL蒸馏水中，在80 °C下搅拌1 h。
2. 使用磁力搅拌器在室温下将两种溶液按1:1比例混合至均匀，然后将混合物倒入培养皿中。在常压下静置样品2 h以脱气。
3. 将水凝胶分别在-4 °C、-20 °C或-80 °C下冷冻20 h并进行4个冻融循环（样品分别为CP4-4、CP4-20和CP4-80）。另将一种水凝胶在-80 °C下冷冻20 h，进行5或6个冻融循环（样品分别为CP5-80和CP6-80）。在第三次冻融循环后，用去离子水洗涤水凝胶。最后，在-46 °C下冷冻干燥48 h，保存以备进一步表征（方法学参考自²）。

2. FT-IR 表征

1. 将一小块（1 mm × 2 mm）水凝胶置于傅里叶变换红外光谱仪的ATR模式下。采集4000至600 cm^-1范围内的FT-IR光谱（分辨率为2 cm^-1，累积32次扫描取平均值）。

3. 肿胀实验

1. 从水凝胶中切下圆片（直径13 mm，高度10 mm）并称重。将圆片置于50 mL去离子水中，在25 °C下振荡孵育。重复三次。
2. 每30分钟将样品从介质中取出，用吸水纸吸去多余水分后称重。使用公式1计算溶胀度，并使用公式2计算24小时时的溶胀平衡状态，。
   )
   其中 为干燥水凝胶的质量， 为溶胀后水凝胶的质量。
   

4. 电子显微镜

1. 在溅射镀膜仪中，用薄金层（30 秒，10 mA）覆盖一小块水凝胶。
2. 将样品放入扫描电子显微镜（SEM）中。在真空条件下以 20 kV 分析样品，并以 500 倍和 1500 倍放大倍数拍摄图像。

5. 孔隙率测定

1. 将直径为15 mm、重量约为0.26 g的圆片放入 penetrometer（一种实体 penetrometer，其整体体积为0.3660 mL，茎部体积为5.7831 mL）中。采用压汞法（Mercury Intrusion Porosimetry, MIP）分析孔隙率和孔径。
2. 以滞后模式（进汞-退汞）进行实验。测定总进汞体积（mL/g）、总孔面积（m²/g）、孔径（µm）、孔隙率（%）、渗透率（mDarcy）和曲折度。重复实验两次。

6. 药物负载与释放

1. 在上样前，配制4 L浓度为15 mg/L的双氯芬酸溶液，并搅拌过夜。通过紫外-可见分光光度法确认溶液浓度（初始浓度）。将400 mg冻干水凝胶样品置于6 mL蒸馏水中溶胀24 h。
2. 上样时，将50 mL双氟尼酸溶液加入烧瓶中并保持 25 °C 持续搅拌。将每个溶胀的水凝胶浸入烧瓶中。
   1. 在不同时间点取剩余的双氟尼酸溶液等分试样（2 mL），以测定其 高原 曲线的特定时间点，例如：3、6、24、27、30 和 48 小时。24 小时后，更换为新鲜溶液。
3. 在252 nm处测定每份等分试样的吸光度，并利用双氟尼酸的标准曲线确定溶液中双氟尼酸的浓度。根据初始浓度与最终浓度的差值，结合总体积（56 mL），计算24小时和48小时时水凝胶中保留的双氟尼酸含量。
   1. 使用公式 3 计算包封率（EE）。
      
   2. 将负载的水凝胶在 -80 °C 下冷冻80 °C 并在 -50 °C.
4. 药物释放实验中，将300 mg冷冻干燥的双氟尼酸负载水凝胶浸入50 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中 25 °C持续搅拌。在不同时间点吸取2 mL等分样品，并补充新鲜培养基以维持恒定体积。
   1. 根据标准曲线，通过紫外分光光度法在252 nm处测定双氟尼酸的释放量。
5. 根据Korsmeyer-Peppas模型（公式4）拟合水凝胶中药物释放数据的前60%，推断主要的药物释放机制，以获得动力学参数k）以及扩散（n）常数。该 n 数值表明药物释放机制^24,25然后， n 接近 0.5 的值对应于菲克扩散，0.5–1.0 的值对应于反常传输，其中涉及扩散与链段松弛过程，而 1.0 的值则对应于情况 II 传输。
   
   1. 为验证结果，采用Higuchi、一级和零级数学模型（公式5至7），并选择拟合度最佳的模型。
   2. 
      
      
      其中 t 表示释放时间， Mt 在特定时间内递送的药物量，以及 M_∞ 过程结束时递送的药物总剂量。

结果

水凝胶的制备
采用先前报道的冻融法，在 -4 °C、-20 °C 和 -80 °C 条件下进行 4 次冷冻循环，以及在 -80 °C 条件下进行 5 次和 6 次冷冻循环，制备得到壳聚糖-PVA 水凝胶²。所有水凝胶均呈均匀、半透明状，具有良好的柔韧性及抗操作损伤能力。

FT-IR 表征
FT-IR 光谱如图 2所示。检测到壳聚糖和聚乙烯醇（PVA）聚合物的七个特征信号：在 3286 cm^-1 处为 PVA 羟基（-OH）的伸缩振动模式，在 2918 cm^-1 处为 -CH 基团的伸缩振动模式^26,27。...

讨论

冻融法是一种适用于制备用于生物医学、制药或化妆品领域的生物相容性水凝胶的合适方法^34,35,36。与其它制备水凝胶的常用方法相比，该方法最重要的优势在于无需使用交联剂，从而避免了可能引发人体炎症反应或不良副作用的风险³⁴。该方法具有良好的通用性，因为它能够以聚乙烯醇（PVA）或其与其他聚合物的混合物为原料制备水凝胶^11,37，从而在新材料中引入其他聚合物的新特性（例如更高的吸水能力、抗菌或抗氧化性能^2,18,35）。然而，需要注意的是，引入其他聚合物可能会降低水凝胶的机械强度

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料：
中等分子量壳聚糖	Sigma-Aldrich	448877	通过毛细管粘度法测定的分子量（637,000 Da），脱乙酰度为70%
双氟尼柳（2'-4'-二氟-4-羟基-3-联苯甲酸）	Merck
冰醋酸	Sigma-Aldrich	1005706
聚乙烯醇	Sigma-Aldrich	341584	分子量89,000–98,000，水解度≥99%
设备：
Cressington Sputter Coater 108 auto	TED PELLA INC
Cryodos 冷冻干燥机	Telstar
Falcon 管	Thermo Fisher Company
傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）	Nicolet iS50	采用ATR模式
冷冻干燥机	LABCONCO
Micromeritics Autopore IV 9500	Micromeritics
扫描电子显微镜	Pemtron SS-300LV
紫外-可见分光光度计	Agilent 8453