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方法文章

利用双荧光素酶报告系统构建CRISPR质粒并检测哺乳动物细胞中的基因敲除效率

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DOI：

10.3791/59639

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2020年12月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qingdao Agricultural University, Qingdao, China, 2University of Cantabria, Santander y Torrelavega, Spain

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍一种简化的方法，用于高效构建可同时表达CRISPR酶和相应单链向导RNA（sgRNA）的质粒。将该sgRNA/CRISPR载体与一种可检测双链断裂修复的双荧光素酶报告载体共转染哺乳动物细胞，可评估基因敲除效率。

摘要

尽管CRISPR酶对基因组位点的修饰效率很高，但仍需预先构建针对目标位点的特异性sgRNA。本文描述了构建高效sgRNA载体的关键步骤，所采用的策略可在DNA测序前通过PCR高效检测阳性克隆。由于CRISPR系统实现高效基因组编辑依赖于高效率的sgRNA，因此有必要对候选sgRNA靶点进行预筛选，以节省时间和工作量。已有研究开发出双荧光素酶报告系统，通过检测单链退火介导的双链断裂修复来评估基因敲除效率。本文中，我们利用该报告系统从候选sgRNA载体中筛选出适用于特定基因编辑的优选xCas9/sgRNA靶点。本实验方案可在10天内获得优选的sgRNA/CRISPR酶载体（起始于设计恰当的寡核苷酸序列）。

引言

CRISPR sgRNA 包含一段20个核苷酸的序列（即原间隔序列），该序列与基因组靶序列互补1,2。尽管CRISPR/Cas系统效率很高，但其对特定基因组位点进行修饰的能力依赖于构建携带针对该靶位点的高效且特异性sgRNA的载体2。本文描述了构建该sgRNA载体的关键步骤。

利用CRISPR/Cas系统进行基因组编辑时，使用高效sgRNA是成功的关键前提3,4,5。由于基因组编辑中所用的工程核酸酶在不同靶位点表现出差异化的编辑效率1，因此有必要预先筛选候选sgRNA靶点，以节省时间和实验成本6,7,8,9。已有研究开发出双荧光素酶报告系统，通过检测单链退火介导的双链断裂修复情况来评估基因敲除效率3,10。本文中，我们利用该报告系统从针对特定基因编辑设计的多个候选sgRNA载体中筛选出最优的CRISPR sgRNA靶点。本方案已在本研究团队及合作实验室中应用数年，用于CRISPR sgRNA的构建与评估。

以下实验方案总结了如何通过网络软件设计合适的sgRNA。在选定合适的sgRNA后，我们描述了获得所需寡核苷酸的不同步骤，以及将成对寡核苷酸插入pX330-xCas9表达载体的方法。我们还介绍了一种基于将这些序列连接至预先酶切的表达载体来构建sgRNA表达载体和双荧光素酶报告载体的方法（步骤2-10，图1A）。最后，我们描述了如何分析每种sgRNA的DNA切割效率（步骤11-12）。

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方案

1. sgRNA 寡核苷酸设计

  1. 使用在线工具（如 Cas-Designer 在线工具，http://www.rgenome.net/cas-designer/）设计 sgRNA。PAM 序列的选择取决于所使用的 Cas9。对于 xCas9，相应的 PAM 序列为 NG，上述 Cas-Designer 在线工具可生成适用于 xCas9 的 sgRNA。
    1. 使用包含靶上和脱靶预测算法的 sgRNA 设计工具（http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design）11。建议选择评分大于或等于 0.2 的 sgRNA。
  2. 为实现最佳筛选效果，选择最多 3 个基因编辑靶点（例如，针对绵羊 DKK2 基因第 1 外显子设计了 T1、T2 和 T3 靶点 [表 1]）。

2. 寡核苷酸修饰

  1. 修饰sgRNA寡核苷酸时，删除3’-NG原间隔序列相邻基序（PAM），保留原间隔序列（例如，T1的起始序列为：TGCCTGCTCCTACTGGCCGC [20 nt]）。
  2. 在寡核苷酸的5’端添加五核苷酸序列CACCG。
    注意：当连接至pX330-xCas9骨架时，该序列将包含U6启动子的3’末端，从而驱动sgRNA转录。序列“CACC”可确保寡核苷酸与经BbsI酶切的pX330-xCas9质粒的黏性末端匹配。碱基“G”是RNA聚合酶III启动子所必需的，可确保sgRNA转录的有效起始（例如，在T1原间隔序列的5’端添加“CACCG”，得到T1-F：CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC [25 nt]）。21 nt gRNA的切割效率与20 nt gRNA存在显著差异1,12,13,14。通常建议使用5’端带G的20 nt gRNA，可通过设计较短的原间隔序列实现；若不可行，则可使用额外带有5’-G的21 nt gRNA。
  3. 生成原间隔序列的反向互补（rc）序列。
    注意：例如，T1原间隔序列的反向互补序列为GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA（20 nt）。
  4. 在rc原间隔序列的5’端添加AAAC，在其3’端额外添加一个C。
    注意：“AAAC”序列确保寡核苷酸适用于克隆至经BbsI酶切的pX330-xCas9质粒中。3’端额外的“C”对于与上述sgRNA转录起始所需的“G”碱基配对至关重要（例如，AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC [25 nt] 即为T1反向互补原间隔序列的最终寡核苷酸序列）。
  5. 订购寡核苷酸。

3. 寡核苷酸退火

  1. 用双蒸水（ddH2O）将冻干的寡核苷酸稀释至终浓度为 10 μM。
  2. 在薄壁 PCR 管中按 1:1 的比例混合正向和反向寡核苷酸（例如，各取 20 μL），无需额外添加缓冲液。
  3. 将混合物于 95 °C 孵育 5 分钟，然后将温度降至 72 °C 并维持 10 分钟。随后在室温（RT）下冷却，即将样品从 PCR 仪中取出后置于室温环境中。
    注意：无需对寡核苷酸混合物进行磷酸化处理以促进连接反应。

4. sgRNA/CRISPR 载体消化

  1. 取1 μg选定的pX330-xCas9载体，用BbsI酶（每1 μg质粒使用10单位酶）在37 °C下消化2小时（图2）。pX330-xCas9 sgRNA表达载体的消化反应总体积为50 μL，包含5 μL 10x消化缓冲液及蒸馏水补足至终体积。
  2. 在10 V/cm电场强度下，通过2%琼脂糖凝胶电泳分离消化后的载体，并切胶回收目的条带，随后使用商品化的凝胶回收试剂盒中的硅胶柱进行纯化。

5. 将退火后的sgRNA寡核苷酸连接至表达载体

  1. 将退火后的sgRNA寡核苷酸（5 μL来自步骤4的混合物）与BbsI酶切的pX330-xCas9载体（纯化后，100 ng）混合。
  2. 加入1 μL连接酶和1 μL 10x连接酶缓冲液。
  3. 加入适量蒸馏水，补至总体积为10 μL。
  4. 在4 °C下孵育过夜。

6. 感受态细胞转化

  1. 取出 E. coli 从-80 °C保存条件下取出DH5α感受态细胞，并在冰上解冻。
  2. 将5 μL连接混合物加入50 μL感受态E. coli DH5α中，冰上放置30 min。
  3. 在42 °C下对混合物进行热激处理，持续90秒。
  4. 冰上静置2分钟。
  5. 在37 °C条件下，于500 μL LB培养基中将菌种在旋转摇床上复苏培养1小时。
  6. 将200 μL培养物接种至含氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。

7. 通过 PCR 鉴定正确的重组质粒

  1. 从LB平板上挑选5至10个细菌菌落，每个菌落分别接种于含有1 mL LB培养基（含60 mg/mL氨苄青霉素）的1.5 mL离心管中。
  2. 将离心管置于摇床中培养2-3小时。
  3. 使用针对sgRNA寡核苷酸的特异性引物对检测正确重组质粒的存在 [例如，用于T1 sgRNA表达载体构建的正向引物 (T1-F)：CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC，反向引物 (BbsI-R)：AAAGTCCCTATTGGCGTTAC，可扩增出287 bp的产物（图3）]。
    1. 配制PCR反应体系（表2）。
    2. 采用以下PCR扩增程序：95 °C预变性5分钟；进行30个循环，每个循环包括95 °C变性30秒、60 °C退火30秒、72 °C延伸30秒；30个循环结束后，在72 °C下进行最终延伸5分钟。
    3. 将PCR产物在10 V/cm电场强度下于2%琼脂糖凝胶中电泳。若出现预期大小的条带 [例如，287 bp]，则判定为阳性结果。

8. 验证sgRNA表达质粒的序列

  1. 使用反向引物 BbsI-R（参见步骤 7.3）通过 Sanger 测序验证 PCR 阳性克隆的序列15。该引物结合于 sgRNA 寡核苷酸插入位点的下游区域。已构建表达包含原间隔序列 TGCCTGCTCCTACTGGCCGCGG 和 xCas9 的 sgRNA 序列的 pX330-xCas9-T1 质粒。
  2. 使用正向引物 T1-F 对阳性克隆进行测序。由于测序引物后 30–50 bp 的片段无法被准确读取，因此正向引物不能提供 sgRNA 寡核苷酸插入位点周围区域的完整序列信息。

9. 双荧光素酶报告载体的构建

  1. 合成含有sgRNA靶序列的300-500 bp DNA片段，并通过双酶切将其亚克隆至双荧光素酶报告载体中（例如，使用AscI和SalI双酶切将440 bp的绵羊DKK2外显子1片段亚克隆至pSSA-Dual质粒16,17，得到pSSA-Dual-DKK2）。
  2. 合成含有sgRNA靶序列的300-500 bp DNA片段。请注意，DNA片段的序列必须是基因组序列的一部分，可从NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）或相关文献中获取。
  3. 选择合适的双荧光素酶报告载体，如pSSA-Dual16,17（或分别表达萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的两种载体），然后使用两种限制性内切酶（如AscI和SalI）对上述载体和DNA片段进行酶切。
  4. 最后使用T4 DNA连接酶将这两个片段连接，得到pSSA-Dual-Target。双酶切和连接反应的详细信息分别见表3和表4。需要特别指出的是，报告载体应在稳定的菌株（如Top10）中扩增，建议以较低转速（通常不超过200 rpm）培养，以避免DNA重组。

10. 细胞转染

  1. 提取上述载体的无内毒素质粒。使用适当的仪器评估质粒的纯度和浓度。建议质粒的最终浓度不低于 500 ng/μL，且在 260/280 nm 吸光度（A260/A280）下的纯度比值为 1.7–1.9。
  2. 将适当细胞系（如 PIEC18）与质粒以等比例共转染（例如，pX330-xCas9-T1 : pSSA-Dual-DKK2 = 1:1，使用 24 孔板时每孔各 0.5 μg 质粒）。使用空载体（如 pX330-xCas9）作为阴性对照。
    1. 转染前一天，以每孔 2 × 105 个细胞的密度将细胞接种于 24 孔培养板中。当细胞融合度达到 60–80% 时，即可进行转染。
    2. 在转染时间点前，尽可能吸除上清液，并每孔轻柔加入 0.5 mL 新鲜培养基。
    3. 按 1:25 的比例将转染试剂稀释于 DMEM 培养基中，并充分混匀。
    4. 将 0.5 μg DNA 溶于 25 μL DMEM 培养基中制备 DNA 主混合液，然后加入 1 μL P3000 试剂。
    5. 将稀释后的 DNA 加入各管已稀释的转染试剂中（按 1:1 比例）。
    6. 室温孵育 10–15 分钟。
    7. 向每孔细胞中加入 50 μL DNA-脂质复合物。
    8. 在 37 °C 下孵育细胞 24 小时，随后按步骤 11 分析转染后的细胞。

11. 双荧光素酶检测

  1. 通过将1体积的5x被动裂解缓冲液（PLB）加入4体积的蒸馏水中，配制足量的1x被动裂解缓冲液（PLB），并充分混匀。
  2. 对24孔培养板中培养的细胞进行被动裂解。
    1. 移除培养细胞的生长培养基，轻柔地加入足量磷酸盐缓冲液（PBS）以清洗培养容器表面。轻轻摇晃容器，以去除脱落的细胞和残留的培养基。在加入PLB试剂前，彻底移除清洗液。
    2. 向每个培养孔中加入100 μL的1x PLB，确保完全覆盖细胞单层。将培养板静置20分钟。
    3. 将裂解液转移至离心管或小瓶中，用于后续操作或储存。
  3. 将提供的冻干萤光素酶检测底物用10 mL提供的萤光素酶检测缓冲液重悬，配制萤光素酶检测试剂（LAR）。
  4. 配制足够体积的双萤光素酶报告基因检测所需试剂（每项检测需100 µL试剂）。在玻璃或硅化聚丙烯管中，将1体积的50x终止底物加入50体积的终止缓冲液中。
  5. 双萤光素酶报告基因（DLR）检测
    1. 设置化学发光仪程序，提供2秒预读延迟，随后进行10秒的测量期。
    2. 根据所需进行的DLR检测数量，预先分装100 µL萤光素酶检测试剂至相应数量的化学发光仪检测管中。
    3. 小心地将最多20 µL细胞裂解液转移至含有LAR的化学发光仪检测管中，用移液器吹打混匀2至3次。将检测管放入化学发光仪中，启动读数。
    4. 从化学发光仪中取出样品管，加入100 µL终止试剂，短暂涡旋混匀。将样品管重新放回化学发光仪中，启动读数。
    5. 记录海肾萤光素酶活性相对于萤火虫萤光素酶活性的归一化值，即屏幕上显示比值的倒数。
    6. 弃去反应管，进行下一项检测。

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结果

本方案所述方法用于构建sgRNA和xCas9表达载体，并对具有相对较高基因靶向效率的sgRNA寡核苷酸进行优化筛选。本文以绵羊DKK2基因第1个外显子的3个sgRNA靶点为例进行说明。sgRNA和xCas9表达载体可通过预先酶切载体骨架（图2），再将一系列短的双链DNA片段通过寡核苷酸对退火后连接构建而成。阳性克隆可通过特异性引物对引导的PCR进行检测（图3）。将一段440 bp的绵羊DKK2外显子1 DNA片段通过AscI和SalI双酶切亚克隆至pSSA-Dual质粒15，获得重组质粒pSSA-Dual-DKK2。同时检测pX330-xCas9-T1、pX330-xCas9-T2和pX330-xCas9-T3的基因靶向能力（图5），最终确定第三个sgRNA载体相对效果最佳，因此在下一步绵羊基因编辑研究中选用该载体。

该检...

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讨论

本文所述的sgRNA载体克隆流程可高效生产sgRNA，主要成本来源于寡核苷酸合成与载体测序。尽管本方法旨在帮助用户制备适用于CRISPR/Cas9系统的sgRNA，但该方案也可轻松改造用于Cas9同源蛋白或其他RNA引导的核酸酶（如Cpf1），仅需对载体骨架及寡核苷酸突出序列进行微小修饰即可。

上述方案在使用设计恰当的寡核苷酸起始时，可在10天内获得理想的sgRNA靶点。该流程包括sgRNA设计（1小时，步骤1-2）、寡核苷酸的稀释、分装与退火（30分钟，步骤3）、sgRNA表达载体的消化与纯化（3小时，步骤4）、将sgRNA寡核苷酸克隆至预先消化的空载体中（过夜，步骤5-6）、菌落的PCR检测（4-5小时，步骤7）以及sgRNA表达质粒序列的验证（24小时，步骤8）。与此同时，双荧光素酶报告载体的构建及序列验证需5–7天（步骤9）。细胞系的准备、质粒转染及双荧光素酶检测约需48小时（步骤10-11）。各质粒构建的失败率几乎为0。

该实验方案中最关键的步骤是使用如BbsI等限制性内切酶对sgRNA载体进行酶切...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本项目由山东省一流草学学科建设项目、国家自然科学基金（31301936，31572383）、公益性行业（农业）科研专项（201403071）、国家乳制品质量安全风险评估重大专项（GJFP201800804）以及青岛市民生科技项目（19-6-1-68-nsh，14-2-3-45-nsh，13-1-3-88-nsh）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
新一代全触屏梯度PCR仪LongGeneA200目的基因扩增
AscI限制性内切酶New England BiolabsR0558V切割目的载体
BbsI限制性内切酶New England BiolabsR0539S切割目的载体
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Lipofectamine 3000 转染试剂盒赛默飞世尔科技L3000015DNA转染
SalI限制性内切酶New England BiolabsR3138V切割目的载体
SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒生工生物B518131-0050回收DNA片段
SanPrep柱式质粒DNA小提试剂盒生工生物B518191-0100质粒DNA提取
T4 DNA连接酶New England BiolabsM0202V连接DNA片段
TaKaRa MiniBEST DNA片段纯化试剂盒 Ver.4.0TaKaRa9761DNA纯化
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水浴恒温振荡器常州国宇仪器制造有限公司SHZ-82使菌液持续振荡，有利于与空气接触

参考文献

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