方法文章

用于研究拉帕霉素/mTOR相互作用的半定量药物亲和反应目标稳定性 （DARTS） 测定

DOI：

10.3791/59656

⸱

2019年8月27日

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1Department of Orthopaedic Surgery, New York University Medical Center, 2Department of Cell Biology, New York University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这项研究中，我们通过监测蛋白质稳定性的变化和估计蛋白质-配体相互作用的亲和力，增强了DARTS实验的数据分析能力。相互作用可以绘制成两条曲线:蛋白质解解曲线和剂量依赖曲线。我们使用 mTOR-拉帕霉素相互作用作为示例案例。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

药物亲和力响应目标稳定性 （DARTS） 是检测新型小分子蛋白靶点的有力方法。它可用于验证已知的小分子-蛋白质相互作用，并找到天然产物的潜在蛋白质靶点。与其他方法相比，DARTS 使用原生、未经修饰的小分子，操作简单易行。在这项研究中，我们通过监测蛋白质稳定性的变化和估计蛋白质-配体相互作用的亲和力，进一步提高了DARTS实验的数据分析能力。蛋白质-配体相互作用可以绘制成两条曲线:蛋白质解解曲线和剂量依赖曲线。我们使用 mTOR-拉帕霉素相互作用作为建立我们协议的典范案例。从蛋白溶酶曲线中，我们看到，通过蛋白酶抑制mTOR的蛋白解酶被雷帕霉素的存在所抑制。剂量依赖曲线使我们能够估计雷帕霉素和 mTOR 的结合亲和力。该方法可能是准确识别新型靶蛋白和优化药物靶向的一种强大而简单的方法。

引言

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识别小分子靶蛋白对于机械性理解和开发潜在的治疗药物1，2，3至关重要。亲和色谱作为识别小分子靶蛋白的经典方法，取得了良好的效果4，5。然而，这种方法有局限性，因为小分子的化学修饰往往导致结合特异性或亲和力的减少或改变。为了克服这些限制，最近已经开发并应用了几种新的策略来识别小分子目标，而不需要对小分子进行化学修饰。这些用于无标签小分子目标识别的直接方法包括药物亲和力响应靶稳定（DARTS）6、蛋白质从氧化率（SPROX）7的稳定性、细胞热移位测定（CETSA）8 ，9和热蛋白酶分析 （TPP）10。这些方法是非常有利的，因为它们使用天然的，未经修饰的小分子，并仅依靠直接结合相互作用，以找到目标蛋白质11。

在这些新方法中，DARTS是一种相对简单的方法，大多数实验室都可以轻松采用。DARTS 取决于配体结合蛋白相对于未结合的蛋白质表现出对酶降解的经修饰的易感性的概念。通过液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）检查SDS-PAGE凝胶中改变的带状，可以检测出新的靶蛋白。该方法已成功实施，用于识别以前未知的天然产品和药物目标 14、15、16、17、18、19.它作为筛选或验证化合物与特定蛋白质20、21结合的手段也非常强大。在这项研究中，我们通过监测小分子的蛋白质稳定性变化和识别蛋白质配体结合亲和力，对实验进行了改进。我们以mTOR-雷帕霉素相互作用为例来演示我们的方法。

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方案

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1. 收集和酶细胞

  1. 使用Dulbeco的改性Eagle培养基（DMEM）与10%胎儿牛血清、2 mM谷氨酰胺和1%抗生素一起培育293T细胞。在 37°C 下孵育培养物，在 5% CO2下孵育。
    注:细胞的生长状态可能会影响后续实验的稳定性。
  2. 扩大培养细胞，直到达到80\u201290%汇合。
  3. 将345 μL的细胞溶化试剂（见材料表）与25μL的20x蛋白酶抑制剂鸡尾酒、25μL的1M氟化钠、50μL的100mβ-糖酸磷酸盐、50 μL的50m M焦磷酸盐钠和5μL的200m正弦酸钠混合。将莱沙缓冲液冷藏在冰上。
    注:其他含有各种洗涤剂的莱沙缓冲液（例如，Triton X-100 或 NP-40）可与 DARTS 一起使用，只要它们是非变性。通过在细胞解物中加入0.4%的Triton X-100或0.4%的NP-40来提取膜蛋白或核蛋白。
  4. 用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞两次。
  5. 使用细胞刮刀收集适当数量的细胞莱沙缓冲液中的细胞，并将酶细胞转移到1.5 mL管中。
    注:每个DARTS实验所需的细胞数量将因可以从各种细胞系中提取多少蛋白质而不同。一般来说，所使用的莱沙蛋白浓度在4μu20126μg/μL之间。一个10厘米板的293T细胞在85\u201290%的汇合，与300μL的莱沙缓冲液的分瓶通常导致一个酶溶液与蛋白质浓度为+5μg/μL。
  6. 将解毒缓冲细胞/解毒细胞混合好，在冰上孵育管10分钟。
  7. 在 4°C 下在 18，000 μ g下离心管 10 分钟。
  8. 将上清液转移到新的1.5 mL管中，并在冰上冷藏。
  9. 执行 BCA 测定，以近似于酸的酸度蛋白质浓度。

2. 用小分子孵育蛋白质解乳物

  1. 将裂拉的99 μL分解成两个1.5 mL管。
  2. 使起始库存浓度为10 mM小分子。执行 DARTS 时，可以首先使用高浓度的小分子（EC50 值 5\u201210x），以确保最佳结合。
    1. 将小分子可溶于小分子的溶剂1μL，或将1μL的小分子库存溶液添加到每个溶酶的等分。在室温下用30\u201260分钟溶液孵育细胞解液，摇动。
  3. 在冰上，在 1x TNC 中建立新鲜解冻的普酮酶溶液的连续稀释（1:200、1:400、1:800 和 1:1600）（对于 1mL 的 10x TNC 缓冲液，将 300 μL 的超纯水与 100 μL 的 5 M 氯化钠、100 μL 的 1M 氯化钙混合和 500 μL 的 1 M Tris-HCl，pH 8.0）。
  4. 检查范围广的蛋白比（例如，从1:100到1:2000），以保证普里昂酶对靶子的步进效应的可观察性。
    注:计算蛋白酶浓度（例如）:5 μg/μL蛋白质浓度x20μL样品= 100μg蛋白质。对于蛋白酶:蛋白质比为1:100，我们需要0.5 μg/μL（100 μg = 100 + 2 μL）蛋白酶溶液。这个实验可能需要重复几次，以获得一个合适的范围的蛋白比。

3. 执行蛋白解解

注:对于蛋白解，除非另有说明，否则在室温下执行步骤

  1. 使用小分子孵育后，将每个等分分成20μL样品。
  2. 以特定间隔（每 30 秒）在每个样品中添加 2 μL 的丙酶溶液范围。使用相等体积的 1x TNC 缓冲区建立未消化的控制样本。
  3. 5\u201220分钟后，每30秒加入2μL的冷20x蛋白酶抑制剂鸡尾酒，在冰上孵育10分钟，停止消化。
  4. 用适当的体积5xSDS-PAGE加载缓冲液稀释样品，在95°C下煮5分钟。
  5. 执行实验的下一部分或将蛋白质样品储存在+80°C。

4. 量化和分析

  1. 飞镖后，按照先前公布的协议22执行库马西蓝色染色。
  2. 脱色后，染色蛋白带应非常清晰。倒入用过的脱色溶液，加入新鲜的1%醋酸溶液以覆盖凝胶。将凝胶置于光下，观察具有（样本组）或无（对照组）小分子组之间显著差异的带。
  3. 用无菌仪器从凝胶中切割两个相应的带子，并立即执行LC-MS/MS。
    注:LC-MS/MS需要尽快完成，因为凝胶中的蛋白质会持续降解。
  4. 消化带，提取肽，并执行LC-MS/MS分析23。
    1. 要分析LC-MS/MS数据，首先识别单个波段中的所有蛋白质。其次，使用肽谱匹配（PSM）来表示每种蛋白质的丰度。
      注:PSM提供蛋白质的已识别肽序列的总数，包括那些冗余标识的肽序列。一般来说，肽的识别/测序频率可用于粗略估计蛋白质在样品中的丰富程度。在对照组上丰富的样本组中的蛋白质是感兴趣的蛋白质。
  5. 采购所选蛋白质的主要抗体。执行西印，以验证小分子可以直接结合潜在的靶蛋白24。
    1. 将同等量的蛋白质装入 8% SDS-PAGE 凝胶的井中，以及适当的分子量标记。在 80 V 下运行凝胶 30 分钟，然后将电压调整到 120 V 并继续运行 1\u20122 h。
  6. 使用图像处理和分析软件量化不同的靶蛋白带（参见材料表）。
  7. 分析数据并绘制曲线。
    1. 目标蛋白蛋白的蛋白解解曲线的确定
      1. 蛋白酶:蛋白比在进行蛋白解解时变化。通过将对应于未消化波段的波段强度值归纳为 100%，使图像分析中的数据标准化。
      2. 使用统计分析和绘图软件的非线性回归分析绘制了相对波段强度和蛋白比的规范化数据曲线。
      3. 首先，打开软件，选择表和图形类型作为 XY，并允许在并排子列中复制 3 个值。然后在 x 和 y 下方的空白处输入相应的数据。在 x 下，输入数字 0、1、2、3、4、5（作为占位符对应的蛋白比）。
      4. 在 y 列中，输入相对波段强度的规范化数据。执行"非线性回归"，并使用"对数（激动器）与响应-可变斜率（四个参数）"方程实现"剂量-响应-刺激"。
      5. 将曲线中 X 轴的注释转换为相应的蛋白比。
    2. 目标蛋白剂量依赖曲线的确定
      注:对于剂量依赖性分析，小分子的摩尔度因样品而异。通过对蛋白解分析数据的分析，应了解稳定的蛋白比。蛋白溶性曲线中靶蛋白强度差异最大的蛋白比，应用于剂量依赖实验。
      1. 使用图像分析软件量化不同的靶蛋白带。与生成剂量依赖曲线一样，通过将与最小消化带对应的波段强度值归因 100%， 使图像分析中的数据规范化。
      2. 在统计分析和绘图软件中应用非线性回归分析到规范化数据。首先，打开软件，选择表和图形类型作为 XY，并在并排子列中输入 3 个复制值。
      3. 然后，在 x 和 y 下方的空白处输入相应的数据。对于"x"变量，输入不同浓度的小分子;'y' 包括相对波段强度的相应规范化数据。
      4. 使用 X = 日志（X）转换 x 值。最后，采用非线性回归，并使用"对数（激动器）与响应-可变斜率（四个参数）"方程实现剂量-响应刺激。

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结果

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实验的流程图如图1所示。库马西蓝色染色的结果如图2所示。用小分子孵育可以保护蛋白解。发现三个带，似乎通过孵化与雷帕霉素在车辆控制下孵化。蛋白解曲线实验的预期结果如图3所示。作为原理证明，我们检查了经过充分研究的蛋白质mTOR，这是药物雷帕霉素25的目标。西方印迹说明了mTOR蛋白在低蛋白酶中的存在:蛋白质比及其减少和损失与增加的比率（图3A）。mTOR的蛋白酶通过蛋白酶的蛋白酶明显受到雷帕霉素的存在抑制，而雷帕霉素的加入在蛋白溶性曲线中产生明显的变化（图3B）。为了研究药物浓度的影响，我们保持了恒定的蛋白比，同时不同浓度的雷帕霉素。当配体浓度接近目标结合饱和时，观察到靶蛋白的存在增加。拉帕霉素剂量依赖性增强mTOR水平，表明通过...

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讨论

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DARTS 允许利用蛋白质结合对降解的保护作用来识别小分子靶点。DARTS不需要任何化学修饰或小分子的固定26。这允许使用小分子来确定其直接结合蛋白靶点。经典DARTS方法的标准评估标准包括凝胶染色、质谱和西印12、13。经典方法还提到这些数据可以定量分析，但没有提供这样的示例。在这里，我们使用蜂窝热移变测定（CETSA）的原理对数据进行半定量分析，并获取与CESTA（Tm和EC50）提供的参数类似的参数，这增加了DARTS分析8的效用。配体-目标相互作用可以针对蛋白酶:蛋白比进行绘制，以显示蛋白溶性曲线中的明显变化。使用不同的蛋白酶进行蛋白解:蛋白质比有助于缩小在下游实验中应使用的蛋白酶的浓度。此外，使用蛋白酶的优化浓度，在小分子浓度不同的情况下进行蛋白解解可以提供小分子与其靶蛋白的亲和力的间接测量。此外，生成剂量依赖曲线允许近似于对基于配体浓度的目标蛋白的影响。纳入剂量依赖分析能力是DARTS方法的有力扩展;提供一个简单快...

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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这项工作部分得到了NIH研究资助R01NS103931、R01AR062207、R01AR061484和国防部研究补助金W81XWH-16-1-0482的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100X 蛋白酶抑制剂混合物Sigma-AldrichP8340用超纯水稀释至 20X，293T
细胞系ATCCCRL-3216DMEM 培养基，含 10% FBS
乙酸Sigma-AldrichA6283
BCA 蛋白检测试剂盒Fisher23225
氯化钙Sigma-AldrichC1016
细胞刮刀Thermo Fisher179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 染色液Bio-Rad1610436
二甲基亚砜 （DMSO）Sigma-AldrichD2650
GraphPad PrismGraphPad 软件6.0 版统计分析和绘图软件
盐酸Sigma-AldrichH1758
ImageJ美国国立卫生研究院1.52 版图像处理和分析软件
M-PER 细胞裂解试剂Thermo Fisher78501
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）康宁R21-040-CV
链霉蛋白酶罗氏PRON-RO10 mg/ml
氯化钠Sigma-AldrichS7653
氟化钠Sigma-AldrichS7920
原钒酸钠Sigma-Aldrich450243
焦磷酸钠Sigma-Aldrich221368
Trizma 碱Sigma-AldrichT1503调节至 pH 值 8.0
&β;-甘油磷酸盐Sigma-AldrichG9422
Thermo

参考文献

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