本实验方案的目的是概述在Drosophila melanogaster中进行体内实验的设计与操作，以评估与人类疾病相关的稀有基因变异的功能性后果。
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方法文章
利用Drosophila进行疾病相关稀有基因变异的体内功能研究
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
测序技术的进步使得全基因组和全外显子组数据集在临床诊断及前沿人类遗传学研究中变得更加可及。尽管已有多种计算机算法被开发用于预测这些数据集中所发现变异的致病性，但功能研究对于确定特定基因组变异如何影响蛋白质功能至关重要，尤其是对于错义变异。在未确诊疾病网络（Undiagnosed Diseases Network, UDN）及其他罕见病研究联盟中，模式生物（model organisms, MO），包括 果蝇, 秀丽隐杆线虫斑马鱼和小鼠被广泛用于评估假定的人类致病性变异的功能。本方案描述了在模式生物筛选中心用于罕见人类变异体功能评估的一种方法 果蝇 UDN的核心。该工作流程首先从多个公共数据库收集人类和模式生物（MO）的信息，利用MARRVEL网络资源评估变异是否可能与患者的病情相关，并基于现有知识和资源设计有效的实验。接下来，构建遗传工具（例如T2A-GAL4和UAS-人cDNA品系），用于在体内评估目标变异的功能 果蝇. 这些试剂开发完成后，可开展基于拯救和过表达实验的双路径功能检测，以评估变异体功能。在拯救路径中，内源性果蝇基因被 "人源化，即通过替换同源的 果蝇 参考或变异的人类转基因基因。在过表达分支中，参考型和变异型人类蛋白在多种组织中被外源性驱动表达。在这两种情况下，任何可评分的表型（如致死性、眼形态、电生理学）均可作为读出指标，而不限于特定疾病。参考等位基因与变异等位基因之间观察到的差异提示存在变异特异性效应，因而可能具有致病性。该方案可对功能已知或未知基因的潜在致病性人类变异进行快速的体内评估。
引言
罕见病患者通常要经历一段艰难的求诊过程，被称为"诊断性漫漫长路"，才能获得准确的诊断1。大多数罕见病被认为具有显著的遗传起源，因此基因组/基因分析成为临床诊疗中的关键环节。除了基于染色体微阵列的候选基因 panel 测序和拷贝数变异分析外，全外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS）技术在过去十年中已逐渐成为极具价值的工具2,3。目前，通过 WES 和 WGS 鉴定已知致病性变异的诊断率约为 25%（在儿科病例中更高）4,5。对于临床 WES/WGS 检测后仍未能确诊的大多数病例，一个常见问题是存在大量候选基因和变异。新一代测序技术常在多个基因中识别出新发或极罕见的变异，而判断这些变异是否与疾病表型相关具有挑战性。例如，尽管基因中的无义突变或移码突变通常因无义介导的转录本降解而被认为是功能丧失（LOF）等位基因，但位于最后几个外显子中的截短突变可逃避该过程，可能表现为良性或功能获得（GOF）等位基因6。
此外，预测错义等位基因的影响是一项艰巨的任务，因为它可能导致多种不同的遗传情况，这些情况最早由赫尔曼·穆勒（Herman Muller）....
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方案
1. 收集人类与模式生物信息以评估：关注变异导致疾病表型的可能性及功能研究的可行性 黑腹果蝇
- 进行广泛的数据库和文献检索，以确定所关注的特定基因和变异是否是解释目标患者表型的合适候选因素。具体而言，收集以下信息。
- 评估目标基因是否先前已被关联到其他遗传病中（已知致病基因的表型扩展），或这是一个全新的疾病候选基因［意义未明的基因变异（GVUS）］。
- 评估目标变异在疾病或对照人群数据库中的等位基因频率。
- 评估在疾病或对照人群数据库中是否存在包含该基因的拷贝数变异（CNVs）。
- 确定在不同模式生物（MO）物种（包括小鼠、斑马鱼、Drosophila、C. elegans 和酵母）中该基因的直系同源基因，并进一步研究这些直系同源基因已知的功能和表达模式。
- 评估目标变异是否位于蛋白质的功能结构域内，以及目标氨基酸在进化上是否保守。
注意：上述五个问题（步骤 1.1.1–1.1.5）的答案可通过单独访问多个人类和模式生物数据库，或使用 MARRVEL（用于稀有变异探索的模式生物聚合资源）网络资源获得（在线资源见表1）30，该工具在配套文章中有详细描述31
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结果
与神经发育表型相关的EBF3基因新生错义变异体的功能研究
一名7岁男性患儿表现出包括肌张力低下、共济失调、全面性发育迟缓以及表达性语言障碍在内的神经发育表型，美国国立卫生研究院未确诊疾病项目（UDP）的临床医生和人类遗传学家在该患儿中鉴定出EBF3（早期B细胞因子3）基因的一个新生错义变异体（p.R163Q）15。该基因编码COE（Collier/Olfactory-1/Early B-Cell Factor）家族的转录因子。此病例于2016年3月提交至UDN MOSC进行功能研究。为评估该基因是否为该病例的致病候选基因，MOSC从OMIM、ClinVar、ExAC（现已扩展至gnomAD）、Geno2MP、DGV和DECIPHER等数据库收集了人类遗传学与基因组学信息。此外，利用DIOPT工具鉴定了关键模式生物（MO）中的同源基因。随后，从各个MO数据库（如Wormbase、FlyBase、ZFIN、MGI）获取了基因表达和表型信息。针对EBF3及其他U.......
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讨论
利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）开展的实验研究为评估与疾病相关的人类变异体的后果提供了一个强有力的检测体系。这得益于过去一个世纪以来，果蝇研究领域的众多研究人员所积累的丰富知识和多样的遗传工具89。然而，与其他任何实验体系一样，必须认识到其存在的局限性和注意事项。
数据挖掘的相关注意事项
尽管本实验方案的第一步是挖掘数据库以获取与目标基因相关的信息，但应仅将其作为起点。例如，尽管通过计算机预测基因变异功能可提供有价值的参考信息，但这些数据的解读始终需谨慎。在某些情况下，所有主要算法均预测某一人源变异为良性，但果蝇（Drosophila）中的功能研究却明确证实该变异具有致病性24。同样，尽管蛋白质-蛋白质相互作用、共表达以及结构建模数据均为有益的信息来源，但这些大规模组学数据集中可能存在假阳性或假阴性结果。例如，部分先前鉴定或预测的蛋白质-蛋白质相互作用可能是人为假象，或仅在特定.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Jose Salazar、Julia Wang 和 Karen Schulze 博士对本文稿的审阅。我们感谢 Ning Liu 博士和 Xi Luo 博士对本文讨论的 TBX2 变异体进行的功能表征研究。未确诊疾病网络模式生物筛选中心获得了美国国立卫生研究院（NIH）共同基金（U54 NS093793）的支持。H. T. C. 还获得了美国国立卫生研究院[CNCDP-K12 和 NINDS（1K12 NS098482）]、美国神经病学学会（神经科学研究基金）、Burroughs Wellcome 基金会（医学科学家职业奖）、儿童神经病学学会和儿童神经病学基金会（PERF Elterman 基金）以及 NIH 院长早期独立奖（DP5 OD026426）的支持。M. F. W. 还获得了 Simons 基金会（SFARI 奖：368479）的支持。S. Y. 还获得了美国国立卫生研究院（R01 DC014932）、Simons 基金会（SFARI 奖：368479）、阿尔茨海默病协会（新研究者研究基金：15-364099）、Naman 家族基础研究基金以及 Caroline Wiess Law 分子医学研究基金的支持。贝勒医学院（BCM）的共聚焦显微镜研究部分由 NIH 基金 U54HD083092 支持，该基金资助智力与发育障碍研究中心（IDDRC）神经可视化核心。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 果蝇 UAS-人cDNA转基因品系 | |||
| 用于转基因的注射品系（D. melanogaster) | BDSC | #24871 | 特定试剂：VK33（第3染色体）注射品系 |
| 用于转基因的注射品系（D. melanogaster) | BDSC | #24872 | 特定试剂：VK37（第二染色体）注射品系 |
| 质粒DNA | |||
| 克隆载体 | Thermo Fisher | #12536-017 | 特定试剂：pDONR221 |
| 果蝇 转基因载体 | Johannes Bischof 博士和 Konrad Basler 博士惠赠（Bischof 等，2013 PNAS） | 特定试剂：pGW-HA.attB | |
| 分子生物学试剂盒和试剂 | |||
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | #A2790 | 特定试剂：琼脂糖（分子生物学级） |
| 化学感受态细胞（E. coli) | Thermo Fisher | #18265017 | 特定试剂：DH5α |
| DNA凝胶回收试剂盒 | Thermo Fisher | #K210012 | 特定试剂：PureLink Gel Extraction Kit |
| DNA 提取与纯化试剂盒 | Qiagen | #27104 | 特定试剂：QIAprep Spin Miniprep Kit |
| 高保真聚合酶 | NEB | #M0491 | 特定试剂：Q5 DNA聚合酶试剂盒 |
| 重组酶介导的克隆系统 | Thermo Fisher | #11789020 | 特定试剂：Gateway BP Clonase 试剂盒 |
| 重组酶介导的克隆系统 | Thermo Fisher | #11791100 | 特定试剂：Gateway LR Clonase II 酶试剂盒 |
| 定点突变试剂盒 | 安捷伦 | #200523 | 特定试剂：Quick Change II 突变试剂盒 |
| 视网膜电图仪相关设备 | |||
| ERG 分析 | Molecular Devices | N/A | 特定试剂：Axon pCLAMP 10 数据软件包 |
| ERG 数据采集 | LabX | #R150358 | 特定试剂：ISO-DAM 隔离式生物信号放大器 |
| ERG 刺激器 | Astro-Med | #S48 | 特定试剂：方波刺激器 |
参考文献
- Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
- Lupski, J. R., et al. Whole-Genome S....
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