利用Drosophila进行疾病相关稀有基因变异的体内功能研究

摘要

本实验方案的目的是概述在Drosophila melanogaster中进行体内实验的设计与操作，以评估与人类疾病相关的稀有基因变异的功能性后果。

摘要

测序技术的进步使得全基因组和全外显子组数据集在临床诊断及前沿人类遗传学研究中变得更加可及。尽管已有多种计算机算法被开发用于预测这些数据集中所发现变异的致病性，但功能研究对于确定特定基因组变异如何影响蛋白质功能至关重要，尤其是对于错义变异。在未确诊疾病网络（Undiagnosed Diseases Network, UDN）及其他罕见病研究联盟中，模式生物（model organisms, MO），包括 果蝇, 秀丽隐杆线虫斑马鱼和小鼠被广泛用于评估假定的人类致病性变异的功能。本方案描述了在模式生物筛选中心用于罕见人类变异体功能评估的一种方法 果蝇 UDN的核心。该工作流程首先从多个公共数据库收集人类和模式生物（MO）的信息，利用MARRVEL网络资源评估变异是否可能与患者的病情相关，并基于现有知识和资源设计有效的实验。接下来，构建遗传工具（例如T2A-GAL4和UAS-人cDNA品系），用于在体内评估目标变异的功能 果蝇. 这些试剂开发完成后，可开展基于拯救和过表达实验的双路径功能检测，以评估变异体功能。在拯救路径中，内源性果蝇基因被 "人源化，即通过替换同源的 果蝇 参考或变异的人类转基因基因。在过表达分支中，参考型和变异型人类蛋白在多种组织中被外源性驱动表达。在这两种情况下，任何可评分的表型（如致死性、眼形态、电生理学）均可作为读出指标，而不限于特定疾病。参考等位基因与变异等位基因之间观察到的差异提示存在变异特异性效应，因而可能具有致病性。该方案可对功能已知或未知基因的潜在致病性人类变异进行快速的体内评估。

引言

罕见病患者通常要经历一段艰难的求诊过程，被称为"诊断性漫漫长路"，才能获得准确的诊断¹。大多数罕见病被认为具有显著的遗传起源，因此基因组/基因分析成为临床诊疗中的关键环节。除了基于染色体微阵列的候选基因 panel 测序和拷贝数变异分析外，全外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS）技术在过去十年中已逐渐成为极具价值的工具^2,3。目前，通过 WES 和 WGS 鉴定已知致病性变异的诊断率约为 25%（在儿科病例中更高）^4,5。对于临床 WES/WGS 检测后仍未能确诊的大多数病例，一个常见问题是存在大量候选基因和变异。新一代测序技术常在多个基因中识别出新发或极罕见的变异，而判断这些变异是否与疾病表型相关具有挑战性。例如，尽管基因中的无义突变或移码突变通常因无义介导的转录本降解而被认为是功能丧失（LOF）等位基因，但位于最后几个外显子中的截短突变可逃避该过程，可能表现为良性或功能获得（GOF）等位基因⁶。

此外，预测错义等位基因的影响是一项艰巨的任务，因为它可能导致多种不同的遗传情况，这些情况最早由赫尔曼·穆勒（Herman Muller）在20世纪30年代提出（即：无功能型、低功能型、超功能型、反作用型、新功能型或同功能型）⁷。目前已有多种计算机预测程序和方法被开发出来，用于基于进化保守性、氨基酸改变类型、在功能结构域中的位置、在普通人群中的等位基因频率以及其他参数，来预测错义变异的致病性⁸。然而，这些程序并不能全面解决变异解读这一复杂问题。有趣的是，最近一项研究表明，五种广泛使用的变异致病性预测算法（Polyphen⁹、SIFT¹⁰、CADD¹¹、PROVEAN¹²、Mutation Taster）在约80%的情况下对致病性的判断一致⁸。值得注意的是，即使所有算法判断一致时，仍有高达11%的情况下会给出错误的致病性预测结果。这不仅会导致临床解读出现偏差，还可能因错误地将新发现的变异归类为良性，从而阻碍研究人员对这些变异的进一步研究。弥补当前计算机建模局限性的一种方法是提供实验数据，以展示该变异在体外、离体（例如培养细胞、类器官）或体内条件下的功能影响。

在体内开展与罕见病相关变异的功能研究具有独特优势¹³，已被全球多个罕见病研究计划采纳，包括美国的未确诊疾病网络（Undiagnosed Diseases Network, UDN）以及加拿大、日本、欧洲和澳大利亚的罕见病模型与机制（Rare Diseases Models & Mechanisms, RDMM）网络¹⁴。除了这些将模式生物（MO）研究人员整合到国家级罕见病诊断与机制研究流程中的协调性努力外，众多临床研究人员与模式生物研究人员之间的独立合作研究也促成了大量新的人类致病基因和变异的发现与功能表征^82,83,84。

在未确诊疾病网络（UDN）中，一个集中的模式生物筛选中心（Model Organisms Screening Center, MOSC）接收候选基因和变异的提交材料，材料包括患者病情描述，并利用生物信息学工具和体内实验评估该变异是否可能具有致病性。在UDN的第一阶段（2015–2018年），MOSC由一个 果蝇 核心（贝勒医学院，BCM）与斑马鱼核心（俄勒冈大学）合作评估病例，通过信息学分析及多种不同的实验策略 果蝇 以及斑马鱼，该MOSC迄今已助力132名患者的诊断，鉴定了31种新综合征⁵⁵，发现多个新的与人类疾病相关的基因（例如， EBF3¹⁵, ATP5F1D¹⁶, TBX2¹⁷, IRF2BPL¹⁸, COG4¹⁹, WDR37²⁰）以及已知致病基因的表型扩展（例如， CACNA1A²¹ACOX1²²).

除了在未诊断疾病网络（UDN）内的项目外，模式生物筛选中心（MOSC）的果蝇（Drosophila）核心研究人员还利用为UDN开发的一套生物信息学与遗传学策略，与孟德尔基因组学中心及其他研究项目合作，推动了多个新致病基因的发现（例如 ANKLE2²³、TM2D3²⁴、NRD1²⁵、OGDHL²⁵、ATAD3A²⁶、ARIH1²⁷、MARK3²⁸、DNMBP²⁹）。鉴于模式生物研究在罕见病诊断中的重要意义，MOSC在UDN第二阶段（2018–2022年）进行了扩展，新增了线虫（C. elegans）核心单元和第二个斑马鱼核心单元（均位于圣路易斯华盛顿大学）。

本文描述了一项目前正在UDN MOSC中应用的体内功能研究实验方案 果蝇 核心在于利用表达人类蛋白的转基因果蝇，确定错义变异是否对目标蛋白产生功能影响。本方案旨在帮助基础科研人员与临床研究团队协作，为感兴趣基因中的候选变异提供其具有功能影响的实验证据，从而促进临床诊断。该方案在以下情境中最为适用： 果蝇 研究人员被一位临床研究者联系，该临床研究者有一位罕见病患者，其在目标基因中存在一个特定的候选变异。

该方案可分为三个部分：（1）收集信息以评估目标变异导致患者表型的可能性，以及在黑腹果蝇（Drosophila）中开展功能研究的可行性；（2）收集现有的遗传工具并建立新的工具；（3）在体内开展功能研究。第三个部分可根据目标变异功能的评估方式进一步细分为两个子部分（即拯救实验或基于过表达的策略）。需要注意的是，该方案可针对罕见单基因病研究以外的多种情境进行调整和优化（例如常见疾病、基因-环境相互作用，以及用于发现治疗靶点的药理学/遗传学筛选）。确定变异的功能性与致病性，不仅可通过提供准确的分子诊断使目标患者受益，还将对转化医学和基础科学研究产生广泛影响。

方案

1. 收集人类与模式生物信息以评估：关注变异导致疾病表型的可能性及功能研究的可行性 黑腹果蝇

1. 进行广泛的数据库和文献检索，以确定所关注的特定基因和变异是否是解释目标患者表型的合适候选因素。具体而言，收集以下信息。
   1. 评估目标基因是否先前已被关联到其他遗传病中（已知致病基因的表型扩展），或这是一个全新的疾病候选基因［意义未明的基因变异（GVUS）］。
   2. 评估目标变异在疾病或对照人群数据库中的等位基因频率。
   3. 评估在疾病或对照人群数据库中是否存在包含该基因的拷贝数变异（CNVs）。
   4. 确定在不同模式生物（MO）物种（包括小鼠、斑马鱼、Drosophila、C. elegans 和酵母）中该基因的直系同源基因，并进一步研究这些直系同源基因已知的功能和表达模式。
   5. 评估目标变异是否位于蛋白质的功能结构域内，以及目标氨基酸在进化上是否保守。
      注意：上述五个问题（步骤 1.1.1–1.1.5）的答案可通过单独访问多个人类和模式生物数据库，或使用 MARRVEL（用于稀有变异探索的模式生物聚合资源）网络资源获得（在线资源见表1）³⁰，该工具在配套文章中有详细描述³¹。代表性结果部分提供了具体示例。Monarch Initiative 网站³² 和 Gene2Function³³ 也提供有用信息。
2. 收集额外信息，进一步从蛋白质功能和结构角度评估该变异是否为合适的致病候选因素。
   1. 评估目标变异是否被计算机预测算法预测为具有破坏性。
      注意：过去约15年中，多个研究团队开发了变异致病性预测算法，其中一些也显示在 MARRVEL 的搜索结果中。较新的程序（包括以下列出的两个）结合了多种变异致病性预测算法和机器学习方法，以生成致病性评分。有关变异预测算法及其性能的更多信息，请参见 Ghosh 等人⁸。（i）CADD（整合注释依赖性耗竭）：基于60多个基因组特征构建的综合注释工具，可为人类单核苷酸变异（SNVs）以及短插入和缺失提供评分¹¹。（ii）REVEL（稀有外显子变异集成学习器）：整合多种变异致病性算法（MutPred、FATHMM、VEST、PolyPhen、SIFT、PROVEAN、MutationAssessor、MutationTaster、LRT、GERP、SiPhy、phyloP 和 phastCons），为所有可能的人类错义变异提供综合评分³⁴。
   2. 确定目标人类基因/蛋白质或其模式生物直系同源物是否已被证明在遗传上或物理上与先前关联到遗传病的基因/蛋白质相互作用。如果是，评估目标患者是否表现出与这些疾病重叠的表型。
      注意：已开发多种工具用于分析基于模式生物出版物以及多物种大规模蛋白质组学筛选的遗传和蛋白质-蛋白质相互作用。STRING（邻近基因重复实例搜索工具）³⁵：一个包含已知和预测蛋白质-蛋白质相互作用的数据库，整合了遗传相互作用、共表达数据集以及文本挖掘工具，用于识别在多种生物中可能共同发挥作用的基因和蛋白质。MIST（分子相互作用搜索工具）³⁶：一个整合来自核心遗传模式生物（酵母、C. elegans、Drosophila、斑马鱼、青蛙、大鼠、小鼠）及人类的遗传和蛋白质-蛋白质相互作用数据的数据库。该数据库还展示基于直系同源基因/蛋白质推断的相互作用（interlogs）。
   3. 确定目标蛋白质的三维结构是否已被解析或建模。如果是，确定目标变异相对于关键功能结构域的位置。
      注意：通过X射线晶体学、核磁 共振（NMR）和冷冻电子显微镜解析的蛋白质结构可在公共数据库中获取，如PDB（蛋白质数据库）和EMDatabank³⁷。尽管目前尚无单一数据库集中收录预测/建模的蛋白质结构，但已有多种算法（例如SWISS-MODEL³⁸、Modeller³⁹ 和 Phyre₂⁴⁰）可供用户进行蛋白质建模。
3. 与临床合作者沟通，讨论第1.1–1.2节中信息学分析所获得的信息。如果临床合作者也认为目标基因和变异是解释患者表型的合适候选因素，则进入第2节。如果对患者的基因型和表型存在特定疑问，应在继续之前与临床合作者讨论。
   注意：如果认为目标变异不太可能解释所关注的表型（例如，在对照人群中高频发现相同变异），应与临床合作者讨论以确定该变异是否为合适候选因素，因为可能缺乏解读临床表型所需的专业知识。

2. 收集现有遗传工具并建立新的试剂以研究特定感兴趣变异体

注意：一旦确定目标变异体是值得进行实验研究的良好候选对象，需收集或制备相关试剂以开展体内功能研究。本方案中所述的功能研究需要一些关键的Drosophila melanogaster试剂：1）携带参考序列或变异序列的上游激活序列调控的人源cDNA转基因品系；2）目标果蝇基因的功能缺失等位基因；3）可用于拯救实验的GAL4品系。

1. UAS-人cDNA载体的构建及转基因果蝇的制备
   1. 鉴定并获取适当的人源 cDNA 克隆。许多克隆可从 MGC（哺乳动物基因集合）获得⁴³ 可从选定供应商处购买。对于存在可变剪接的基因，应通过 Ensembl 或 RefSeq 数据库确认所对应的 cDNA 亚型。
      注意许多 cDNA 可在与重组酶介导的克隆系统兼容的试剂中获得⁴⁴，这简化了亚克隆步骤。cDNA 可能以以下形式提供 "开放（无终止密码子）" 或 "封闭式（带有内源性或人工终止密码子）”格式。开放式克隆可用于对蛋白质进行C端标记，有助于通过生物化学（如Western印迹）和细胞生物学（如免疫染色）检测方法监测目标蛋白的表达，但在某些情况下可能干扰蛋白质功能。
   2. 将参考序列和变异体cDNA亚克隆至 果蝇 转基因载体。使用φC31介导的转基因系统，因为该系统可使参考序列和变异cDNA整合到基因组的相同位置⁴⁵对于本项目，MOSC 果蝇 核心实验常规使用 pGW-HA.attB 载体⁴⁶.
      注意：如果人源cDNA位于重组酶介导的克隆系统兼容载体中（例如pDONR221、pENTR221），则跳至第2.1.4节，该节说明如何通过LR反应将cDNA亚克隆至pGW-HA.attB中。
      1. 如果人源cDNA不在与重组酶介导克隆系统兼容的质粒中，则使用标准分子生物学技术将人源cDNA亚克隆至Gateway入门载体中（下文记录了此类实验方案的一个示例）。
         1. 通过末端延伸PCR引入 attB1 和 attB2 臂。上游引物应具有 attB1 序列5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACC-3'，后接目的cDNA的前22个核苷酸。反向引物应具有 attB2 序列 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA-3'，后接目的 cDNA 最后 25 个核苷酸的反向互补序列。排除 cDNA 的终止密码子，若需要，可添加 C' 标签 "打开一个克隆，或添加一个终止密码子 "关闭一个克隆。
         2. 配制100 μL高保真PCR反应体系，包含50 μL高保真PCR预混液、36 μL去离子水、步骤2.1.2.1.1中所列正向和反向引物各5 μL（稀释至10 μM）以及4 μL目的cDNA（150 ng/μL）。
         3. 使用标准的定点突变PCR方案进行PCR以添加 attB1 和 attB2 将引物连接至目标cDNA上。反应条件将根据具体构建体和目标变异体的不同而有所调整。
         4. 通过凝胶电泳和凝胶回收分离带有同源臂的目标cDNA。制备1%琼脂糖凝胶，采用标准方法进行电泳。切下与cDNA大小加上同源臂额外长度相对应的条带。通过标准方法从凝胶中提取DNA。⁹⁵市面上有多种公司提供的商业化凝胶回收试剂盒。
         5. 根据所使用的系统，按照重组酶介导的克隆方案进行体外重组酶反应。
         6. 将BP反应混合物转化至感受态细胞中 E. coli 细胞。感受态细胞可自行制备或从商业供应商购买。将转化后的细胞在含有适当抗生素的LB平板上过夜培养，以进行菌落筛选。次日，挑选数个菌落，分别接种于独立的液体培养基中过夜培养。
         7. 通过微量制备法从过夜培养物中提取DNA。对阳性克隆进行Sanger测序，以确认cDNA具有正确的序列。⁹⁶将含有目标序列的阳性菌种用25%甘油于-80 °C保存。
   3. 通过定点突变将目标变异引入含有参考人cDNA的Gateway质粒⁹⁷该方法的详细方案可在供应商网站获取^48,49通过Sanger测序对突变质粒的完整开放阅读框（ORF）进行测序，以验证目标变异的存在，并确保该诱变步骤未引入其他额外变异。
   4. 将参考序列和变异的人类cDNA亚克隆至供体质粒（Gateway质粒中 attL1 和 attL2 位点）插入到转基因质粒中（例如 pGW-HA.attB 中） attR1 和 attR2 通过LR克隆酶反应（LR clonase reaction）进行位点特异性重组。
      注意：已有设计用于基于常规限制性内切酶的亚克隆的 UAS φC31 载体（例如 pUAST.attB）⁵⁰如果倾向于通过限制性内切酶方法亚克隆人类 cDNA。
   5. 选择用于整合UAS-人cDNA转基因的φC31整合位点。多个实验室已构建了多种整合位点，并可从公共品系保藏中心获取^50,52,53. 
      注意由于将人类转基因置于不包含目标基因果蝇直系同源物的染色体上较为方便，因此当果蝇直系同源物位于X、第三或第四染色体时，建议使用第二染色体整合位点 [VK37 (BDSC stock #24872)]；当果蝇直系同源物位于第二染色体时，则应使用第三染色体整合位点 [VK33 (BDSC stock #24871)]。
   6. 将UAS-人cDNA载体注射到生殖系表达φC31整合酶的果蝇中（例如vas-φC31、nos-φC31）。
      注意：显微注射可由实验室自行完成，也可送至核心设施或商业机构进行转基因操作。有关转基因果蝇制备的详细实验方案，可参见所引用的图书章节。⁵¹.
   7. 从注射后的胚胎中建立稳定的转基因品系。每种构建体注射约100–200个胚胎。⁹⁴一个将转基因插入第二条染色体整合位点（VK37）的代表性杂交方案如图所示 图1A参见所引用的书籍^54,55 基础 果蝇 遗传信息
2. 获得或构建一个T2A-GAL4品系，以实现基于挽救的功能性检测 （参见 图2 以及第3.1节。
   注意该品系具有两个用途。首先，大多数经过测试的T2A-GAL4品系通过发挥基因捕获等位基因的功能，表现为强效的基因功能缺失（LOF）等位基因。其次，T2A-GAL4品系可作为GAL4驱动工具，使UAS构建体（例如UAS-GFP、UAS-人cDNA）在目标基因的内源调控元件控制下表达。^56,57 (图2A-C).
   1. 在公共品系库中搜索可用的 T2A-GAL4 品系，包括 黑腹果蝇 基因破坏项目（GDP）⁵⁸ 已生成约1,000条T2A-GAL4品系⁵⁹这些品系目前可从Bloomington获得 果蝇 可通过GDP和BDSC网站搜索果蝇资源中心（BDSC）。
   2. 如果目标果蝇基因的T2A-GAL4品系不可获得，请检查是否存在合适的编码区含内含子的MiMIC（Minos介导的整合盒）品系可用于通过重组酶介导的盒式交换（RMCE）转化为 T2A-GAL4 品系⁶⁰ (图2A).
      注意RMCE 可将位于两个编码外显子之间的内含子内 MiMIC 元件通过显微注射供体质粒构建成 T2A-GAL4 品系（一种杂交方案的示例如图所示） 图1B）或一系列杂交，具体描述如下^57,59.
   3. 如果无法获得T2A-GAL4品系，且不存在合适的编码区含内含子的MiMIC插入，则可考虑通过CRIMIC（CRISPR介导的整合盒）系统构建T2A-GAL4品系⁵⁹.
      注意该方法利用CRISPR介导的DNA切割和同源定向修复（HDR），将类似MiMIC的盒式结构整合到目标基因的编码内含子中。
   4. 如果目的基因缺乏较大的内含子（>150 bp）或无内含子，则使用CRISPR/Cas9系统通过HDR方法尝试将GAL4转基因敲入果蝇基因中^20,61,62.
      注意：如果难以构建T2A-GAL4或GAL4基因敲入等位基因，可尝试使用现有的等位基因或RNAi品系，并结合泛表达或组织特异性GAL4驱动子进行挽救实验，具体方法如前所述⁹² (参考文献)

3. 在Drosophila体内对人类感兴趣变异体进行功能分析

注意：使用第2节中收集或构建的工具，在Drosophila中通过基于挽救的分析（第3.1节）以及过表达研究（第3.2节）来评估目标变异体在体内的效应。建议同时采用这两种方法，因为二者具有互补性。

1. 通过基于挽救的实验进行功能分析
   注意基于异源拯救的实验 果蝇 利用人类蛋白质确定这两个直系同源基因的分子功能在约5亿年的进化过程中是否得以保守。他们还评估了该变异在人类蛋白质背景下的功能。⁶³尽管尚未见报道针对数百个基因对的系统性分析，但已有数十个人类和哺乳动物（如小鼠）基因被发现能够替代 果蝇 基因¹³.
   1. 在基于挽救的策略中，首先应确定果蝇直系同源基因的功能丧失型突变体中是否存在明显、可评分且可重复的表型，然后再评估各变异体的功能。
      注意：关于果蝇基因的前期文献是数据挖掘的首要资源，可通过 FlyBase 和 PubMed 等数据库获取。MARRVEL、Monarch Initiative 和 Gene2Funcion 等其他数据库在收集此类信息时也十分有用。
   2. 对纯合子及半合子（T2A-GAL4 等位基因与分子定义明确的染色体缺失组合）动物进行可评分表型的全局调查，尤其当该 T2A-GAL4 等位基因为特定基因的首个被鉴定突变时。评估包括致死性、不育性、寿命、形态学（如眼的大小和形态）以及行为（如求偶、飞行、攀爬和震击敏感性缺陷）等表型。
      注意：如果初筛未发现显著表型，可采用可高度重复且特异的细微表型，例如通过电生理记录检测的神经功能缺陷。例如，步骤3.2.3中描述了利用视网膜电图（ERG）进行的功能研究。若仍无法检测到任何可评分的表型，则转入第3.2节，开展基于过表达的功能研究。
   3. 一旦在果蝇的功能缺失突变体中鉴定出可评分的表型，通过尝试使用人源cDNA拯救突变果蝇品系，检测参考人源cDNA是否能够替代果蝇直系同源基因的功能。此处进行的表型分析实验取决于步骤3.1.2的结果，并且针对所研究的特定基因而定。
      注意：如果 "如果果蝇基因的“人源化”成功，现在就可以建立一个平台，用于比较目标变异体与其参考序列在拯救效率上的差异。参考人源cDNA所实现的拯救效果无需完全恢复。即使使用人源cDNA仅部分挽救了果蝇突变表型，仍可为利用变异人源cDNA品系开展比较研究提供参考依据。
   4. 使用步骤3.1.2中选定的检测系统，比较参考人源cDNA与变异人源cDNA所观察到的挽救效应，以确定目标变异是否对目的基因产生影响。
      注意如果变异的人源cDNA表现差于参考等位基因，则表明该目标变异对蛋白质功能具有有害影响。如果无法在功能上区分变异型与参考型，则可能有两种情况：1）该等位基因可能是同形变体（即不影响蛋白质功能的变异）；或2）检测方法的灵敏度不足以检测出细微差异。
   5. 如果该变异被确定为有害等位基因，则需进一步通过蛋白质印迹、免疫荧光染色或其他方法，在体内评估目的参考蛋白与变异蛋白的表达水平及细胞内定位。⁹³.
      注意：如果UAS-人cDNA来源于pGW-HA.attB载体中的开放克隆，则使用抗HA抗体进行这些生化和细胞实验。如果原始克隆为封闭克隆，则检测针对人源蛋白的商用抗体是否可用于这些实验。表达水平和细胞内定位的差异可能揭示目标变异对蛋白功能的影响。
2. 通过过表达研究进行功能分析
   注意：在野生型果蝇中普遍性或组织特异性地过表达人类cDNA，可提供与3.1节所述基于拯救实验互补的信息。基于拯救的实验主要用于检测功能缺失型变异（无功能型、低功能型），而基于过表达的实验则可能揭示更难评估的功能获得型变异（超功能型、反功能型、新功能型）。
   1. 选择一组GAL4驱动子以过表达目标人源cDNA。公共品系保藏中心（例如BDSC）提供多种组成型及组织/阶段特异性GAL4驱动子，其中部分使用频率较高。首先聚焦于组成型驱动子及易于观察的表型（致死性、不育性、形态学表型），随后再转向组织特异性驱动子及更特异的表型。
      注意：在实验前，需使用报告基因品系（例如 UAS-GFP）验证 GAL4 驱动系的表达，以确认其表达模式。
   2. 在相同条件下（例如温度），通过将3-5只GAL4品系（例如 ey-GAL4 用于眼盘表达）与3-5只来自UAS品系的雄性果蝇（例如， UAS-TBX2(+) 或 UAS-TBX2(p.R305H) 在4.2节所示示例中，将所有组分加入单个样品瓶中。
      1. 每隔2-3天转移一次杂交果蝇，以获得来自同一次杂交的大量羽化个体。
   3. 在体视显微镜下观察后代，检测参考品系与变异品系之间的差异（如眼部形态）。使用连接体视显微镜的相机拍摄果蝇图像，以记录表型。
      注意：如果表型仅在参考品系中出现，而在变异品系中未出现，则该变异可能为无功能等位基因或强效低效等位基因。如果表型在两种基因型中均出现，但参考品系导致更严重的缺陷，则该变异可能为轻度至弱效低效等位基因。如果参考品系无表型或仅表现出微弱表型，而变异品系表现出明显缺陷，则该变异可能为功能获得型（GOF）等位基因。
   4. 如果在标准培养条件（室温或25 °C）下未观察到表型，可将杂交设置在18–29 °C范围内的不同温度下进行，因为UAS/GAL4系统已知具有温度敏感性^64,65通常，UAS 转基因在较高温度下的表达水平更高。
3. 开展与目标基因和蛋白质相关的额外功能研究。
   注意除了检测一般缺陷外，还可选择特定的检测系统以深入探究基因及其变异体的分子功能。在代表性结果部分讨论的一个示例中（TBX2 在该案例中，使用ERG记录来确定该变异对感光细胞功能的影响，因为所关注的果蝇基因（分叉的) 已在视觉系统发育研究中得到广泛探讨。关于视网膜电图（ERG）的详细实验方案在 果蝇 可参见先前已发表的研究^66,67,68.
   1. 生成果蝇以检测视觉系统的功能缺陷。将未交配的雌性果蝇与 视紫红质1（Rh1）-GAL4 将品系与参照或变异的UAS-人cDNA转基因雄性果蝇杂交，以在R1-R6光感受器中表达目标人源蛋白。
      注意将3-5只处女雌蝇与3-5只雄蝇放入同一试管中杂交，每2-3天将杂交组合转移一次，以获得来自同一次杂交的大量出蝇个体。所有杂交组合必须置于设定为实验温度的培养箱中培养，以确保结果的一致性。
   2. 一旦果蝇开始羽化（在25 °C条件下，初始杂交后约10天），收集后代Rh1-GAL4/+; UAS-人cDNA/+将样品转移至新的离心管中，放回设定为实验温度的培养箱，继续培养3天，以使视觉系统充分发育成熟。
      注意：尽管可以在新羽化后1-2天的果蝇上进行ERG记录，但新羽化的果蝇其ERG信号可能存在较大波动。若需观察与年龄相关的表型，可将这些果蝇饲养数周，只需定期（例如每约5天）将其转移至新的培养管中，以避免因食物过湿而导致溺亡。
   3. 通过使用 CO2 麻醉果蝇，为记录ERG准备果蝇₂ 或将它们放入装有冰的离心管中。轻轻将果蝇的一侧粘附到玻璃载玻片上以固定。
      注意：可将多只参照果蝇和变异果蝇固定于同一载玻片上。将所有果蝇大致按相同方向摆放，确保其中一只眼睛可接触记录电极。注意避免胶水沾染眼睛，并保持喙部自由不受束缚。
   4. 准备记录电极和参考电极。将一根1.2 mm玻璃毛细管放入拉针仪中并启动。拉断毛细管以获得两根尖端细长的电极。所得电极应为中空结构，末端直径为 <0.5 mm
   5. 用生理盐水（100 mM NaCl）填充毛细管，确保无气泡。将玻璃毛细管滑过银丝电极（包括记录电极和参考电极，参见 图4）并将毛细管固定到位。
   6. 配置刺激器和放大器。 详细的设置可参见 Lauwers 等人。⁶⁷. 未诊断疾病网络 果蝇 MOSC 装置由材料部分列出的设备组成。
      1. 将放大器设置为0.1 Hz高通滤波器、300 Hz低通滤波器，增益为100。
      2. 将刺激器设置为周期1 s、脉冲宽度500 ms、脉冲延迟500 ms、运行模式和7 Amp。
      3. 准备用于光刺激的光源。使用卤素光源激活果蝇感光细胞。
      4. 在连接了ERG设备的计算机上准备记录软件。创建包含采集模式的刺激方案 "固定长度事件”和20秒持续时间。
   7. 在开始ERG记录之前，将果蝇置于完全黑暗环境中适应。实验开始前，将果蝇置于完全黑暗中至少10分钟。
      注意：由于果蝇无法感知红光，因此在暗适应期间应使用红光光源。
   8. 将载有果蝇的载玻片放置于记录装置上，移动携带参考电极和记录电极的显微操作器，使其接近载玻片上目标果蝇的位置。观察电极尖端，小心地将参考电极插入果蝇的胸部（穿透体壁）。待参考电极稳定插入后，将记录电极置于果蝇复眼表面。
      注意参考电极的确切位置对ERG信号影响不大。记录电极应放置在眼球表面，因为ERG是一种场电位记录，而非细胞内记录。施加在记录电极上的压力应适中，以在眼球表面形成轻微凹陷但不穿透眼球为宜。
   9. 关闭所有灯光，使果蝇在黑暗环境中适应3分钟。
   10. 设置好记录软件并开始记录信号。如果使用带有手动快门的卤素光源，请在快门关闭的情况下打开光源，然后开始记录信号。
   11. 在单次运行的20秒期间，每隔1秒打开和关闭快门一次，使果蝇眼睛暴露于光下。
       注意卤素光源的开关可手动控制，也可通过编程实现自动化，后者需使用白色LED光源。与白光LED相比，使用卤素光源可获得更稳定、更可靠的视网膜电图（ERG）信号，这可能是由于卤素光源发射的光谱范围更宽所致。
   12. 从载玻片上固定的所有果蝇中记录ERG。每种基因型在每种条件下记录15只果蝇的ERG。
       注意可调整的参数以寻找能够显示参考cDNA与变异cDNA之间显著差异的条件，可能包括温度、年龄或环境条件（例如，在明暗循环或持续光照/黑暗条件下培养）。
   13. 进行数据分析：比较参考样本、变异样本及对照样本的视网膜电图（ERG），以确定是否存在差异。评估ERG数据中on-瞬变、去极化、off-瞬变和复极化的变化情况⁶⁹ (图4B).
       注意去极化和复极化反映了光感受器内光转导级联反应的激活与失活，而on-和off-瞬变反应则是接收光感受器信号的突触后细胞活动的指标。复极化的振幅降低和动力学改变常与光感受器功能及健康缺陷相关，而on-和off-瞬变反应的异常则见于突触发育、功能或维持存在缺陷的突变体中⁷⁰.
   14. 在发现过表达参考序列与变异人cDNA导致ERG表型差异后，通过组织学分析和透射电子显微镜检查，确定该电生理表型是否与光感受器及其突触的结构和超微结构缺陷相关。
       注意：关于ERG缺陷的解释以及结构/超结构分析的进一步讨论此前已有描述⁶⁹.

结果

与神经发育表型相关的EBF3基因新生错义变异体的功能研究
一名7岁男性患儿表现出包括肌张力低下、共济失调、全面性发育迟缓以及表达性语言障碍在内的神经发育表型，美国国立卫生研究院未确诊疾病项目（UDP）的临床医生和人类遗传学家在该患儿中鉴定出EBF3（早期B细胞因子3）基因的一个新生错义变异体（p.R163Q）¹⁵。该基因编码COE（Collier/Olfactory-1/Early B-Cell Factor）家族的转录因子。此病例于2016年3月提交至UDN MOSC进行功能研究。为评估该基因是否为该病例的致病候选基因，MOSC从OMIM、ClinVar、ExAC（现已扩展至gnomAD）、Geno₂MP、DGV和DECIPHER等数据库收集了人类遗传学与基因组学信息。此外，利用DIOPT工具鉴定了关键模式生物（MO）中的同源基因。随后，从各个MO数据库（如Wormbase、FlyBase、ZFIN、MGI）获取了基因表达和表型信息。针对EBF3及其他U...

讨论

利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）开展的实验研究为评估与疾病相关的人类变异体的后果提供了一个强有力的检测体系。这得益于过去一个世纪以来，果蝇研究领域的众多研究人员所积累的丰富知识和多样的遗传工具⁸⁹。然而，与其他任何实验体系一样，必须认识到其存在的局限性和注意事项。

数据挖掘的相关注意事项
尽管本实验方案的第一步是挖掘数据库以获取与目标基因相关的信息，但应仅将其作为起点。例如，尽管通过计算机预测基因变异功能可提供有价值的参考信息，但这些数据的解读始终需谨慎。在某些情况下，所有主要算法均预测某一人源变异为良性，但果蝇（Drosophila）中的功能研究却明确证实该变异具有致病性²⁴。同样，尽管蛋白质-蛋白质相互作用、共表达以及结构建模数据均为有益的信息来源，但这些大规模组学数据集中可能存在假阳性或假阴性结果。例如，部分先前鉴定或预测的蛋白质-蛋白质相互作用可能是人为假象，或仅在特定...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
果蝇 UAS-人 cDNA 转基因
注射菌株（D. melanogaster）	BDSC	#24871	特异性试剂：VK33（第 3 条染色体）注射线
转基因注射菌株 （D. melanogaster）	BDSC	#24872	特异性试剂：VK37（第 2 条染色体）注射线
质粒 DNA
克隆载体	Thermo Fisher	#12536-017	特异性试剂：pDONR221
果蝇转基因载体	来自 Johannes Bischof 和 Konrad Basler 博士的礼物（Bischof et al.， 2013 PNAS）		特异性试剂：pGW-HA.attB
分子生物学试剂盒和试剂
琼脂糖	Sigma-Aldrich	#A2790	特异性试剂：琼脂糖（分子生物学级）
化学感受态细胞（大肠杆菌）	Thermo Fisher	#18265017	特异性试剂：DH5α
DNA 凝胶提取试剂盒	Thermo Fisher		#K210012 特异性试剂：PureLink 凝胶提取试剂盒
DNA 分离和纯化试剂盒	Qiagen	#27104	特异性试剂：QIAprep Spin 小量提取试剂盒
高保真聚合酶	NEB	#M0491	特异性试剂：Q5 聚合酶试剂盒
重组酶介导的克隆系统	Thermo Fisher	#11789020	特异性试剂：Gateway BP 克隆酶试剂盒
重组酶介导的克隆系统	Thermo Fisher	#11791100	特异性试剂：Gateway LR 克隆酶 II 酶试剂盒
定点突变试剂盒	安捷伦	#200523	特异性试剂：Quick Change II 诱变试剂盒
视网膜电图装置相关设备
ERG 分析	Molecular Devices	N/A	特异性试剂：Axon pCLAMP 10 数据软件包
ERG 数据采集	LabX	#R150358	特异性试剂：ISO-DAM 离体生物放大器
ERG 刺激器	Astro-Med	#S48	特异性试剂：方波脉冲刺激器