以下实验方案描述了一种利用基因工程小鼠模型，在小鼠背部皮肤中实现黑色素细胞肿瘤发生时空控制的方法。本方案详细说明了肉眼可见及显微镜下的皮肤黑色素瘤起始过程。
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方法文章
由突变黑色素细胞干细胞启动小鼠黑色素瘤的空间与时间控制
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
皮肤黑色素瘤是众所周知最具侵袭性的皮肤癌。尽管其风险因素和主要的遗传改变已被日益深入地记录，但近几十年来皮肤黑色素瘤的发病率仍呈现出快速且持续上升的趋势。为了寻找有效的预防方法，了解黑色素瘤在皮肤中发生的早期步骤至关重要。已有研究数据表明，成体皮肤组织中的毛囊黑素细胞干细胞（MCSCs）在携带致癌突变和遗传改变时，可作为黑色素瘤的起源细胞。当具有黑色素瘤倾向的MCSCs从静息状态转变为活跃状态时，即可诱发肿瘤发生。这种具有黑色素瘤倾向的MCSCs的状态转变，可通过调控毛囊干细胞的活性状态或外界环境因素（如中波紫外线（UV-B））来促进。在实验室中，这些因素可通过化学脱毛方法进行人为操控，化学脱毛可诱导毛囊干细胞和MCSCs从静息状态进入活跃状态；同时，也可通过使用台式光源进行UV-B照射来实现。这些方法可在小鼠背部皮肤中实现对皮肤黑色素瘤发生的时空精确控制。因此，这些体内模型系统对于明确皮肤黑色素瘤发生的早期过程具有重要价值，并可用于测试潜在的肿瘤预防策略。
引言
黑色素瘤是黑色素细胞肿瘤的恶性形式，是皮肤中最具有侵袭性的癌症，其中皮肤黑色素瘤导致了大多数皮肤癌相关死亡1在美国，黑色素瘤的诊断较为常见，预计将成为第5th 至 6th 2018年估计新增癌症病例中最常见的癌症类型2此外，尽管近几十年来总体癌症发病率呈逐渐下降趋势，但皮肤黑色素瘤的发病率在过去几十年中却持续快速上升，且在两性中均表现出这一趋势2.
为了更有效地防治皮肤黑色素瘤，必须清楚地了解黑色素瘤从其起源细胞开始的早期发生过程，从而更好地识别具有临床效果的预防方法。目前研究表明，成体干细胞可作为多种器官（包括皮肤组织）中癌症的细胞起源，在肿瘤形成过程中发挥重要作用3,4,5。类似地，小鼠背部皮肤中的成体黑素细胞干细胞（MCSCs）在Ras/Raf和Akt信号通路异常激活时，可作为黑色素瘤的起源细胞6。然而，仅这些致癌突变尚不足以高效地从静息状态的MCSCs诱导肿瘤形成。黑素细胞性肿瘤通常在MCSCs因自然毛发周期而被激活....
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方案
所有动物实验均按照康奈尔大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定进行。
1. 准备
- 从出生后12天的小鼠尾部采集组织样本，加入400 µL 0.05 N NaOH，在95 °C下消化1小时。涡旋混匀后，加入32 µL 1 M Tris-HCl（pH 7）。根据杰克逊实验室提供的PCR方案对小鼠进行基因型鉴定，并筛选出目标基因型6。
- Tyr-CreER – 半合子（+/CreER）
- LSL-BrafV600E – 杂合子（+/LSL-V600E）
- Pten – 纯合flox型（flox/flox）
- LSL-tdTomato – 半合子（+/LSL-tdTomato）
注意：引物序列见材料表。 - 在进行以下所有实验前2至3天，使用电推剪剃除小鼠背部皮肤的毛发，此时小鼠年龄约为7周。操作时需小心避免损伤小鼠薄嫩的皮肤，因为任何创伤都可能引发伤口愈合反应，从而激活毛囊干细胞，包括黑色素细胞干细胞（MCSCs）。
- 在等待期间确认毛发周期是否处于休止....
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结果
化学脱毛诱导的皮肤黑色素瘤发生
化学脱毛的过程如图2所示。当小鼠出生后7周时，其背部皮肤处于休止期（telogen）。在休止期，毛囊干细胞和MCSCs已知处于静息的静止状态。剃毛后皮肤应无明显毛发生长。相反，化学脱毛可诱导毛囊干细胞活化，从而在目标区域出现显著的毛发生长（图2）。类似地，表达致癌突变的易发肿瘤MCSCs也需要被激活才能加速肿瘤形成。化学脱毛可显著诱导毛囊干细胞和MCSCs的活化。处于活化状态的易发黑色素瘤MCSCs能够形成肿瘤，利用谱系示踪等位基因LSL-tdTomato可在化学脱毛后2周内观察到显微镜下的黑色素瘤起始过程（图3）。
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讨论
皮肤黑色素瘤肿瘤中常见的标志性遗传改变已有充分描述13。其中最主要的驱动突变是 BrafV600E，Bosenberg 研究组构建了用于研究 BrafV600E 介导的黑色素瘤的基因工程小鼠模型14，并将其保存于杰克逊实验室。利用该小鼠模型，我们近期的研究证明，在背部皮肤中有效启动 BrafV600E 介导的黑色素瘤需要肿瘤易感性黑素细胞干细胞（MCSCs）的细胞活化6。
已知脱毛是一种有效诱导小鼠背部皮肤毛囊干细胞活化的方法6,10。小鼠黑素细胞干细胞（MCSCs）位于毛囊内，且毛囊内MCSCs的细胞状态与毛囊干细胞的状态同步8。人工调控毛囊干细胞可改变MC.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究工作由美国国防部卫生事务助理部长办公室通过同行评审癌症研究项目（资助号：W81XWH-16-1-0272）资助。观点、解释、结论和建议均为作者个人观点，不一定代表美国国防部的立场。本研究工作还获得了康奈尔干细胞计划向 A.C. White 提供的种子基金资助。H. Moon 得到了康奈尔脊椎动物基因组中心学者项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 他莫昔芬 | Sigma | T5648-1G | 用于全身注射 |
| 他莫昔芬 | Cayman Chemical | 13258 | 用于全身注射 |
| 玉米油 | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-他莫昔芬 | Sigma | H7904-25MG | 用于局部处理 |
| 26 G 1/2" 针头 | 各种 | 兽用级 | |
| 1 mL 注射器 | 各种 | 兽用级 | |
| 宠物毛发修剪器 | Wahl | 09990-502 | |
| 脱毛膏 | Nair | n/a | 大多数药店有售 |
| 棉签 | 各种 | ||
| 紫外灯泡 | UVP | 95-0042-08 | 型号 XX-15M 中波紫外灯 |
| 200 proof 乙醇 | 各种 | 纯乙醇 | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | 石蜡颗粒 |
| 10% 中性缓冲福尔马林 | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | 二甲苯替代品 |
| O.C.T. 包埋剂 | Thermo | 23730571 | |
| 组织包埋盒 | Sakura | 89199-430 | 用于 FFPE 处理 |
| 冷冻模具 | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE 金属模具 | Leica | 3803082 | 24 mm x 24 mm |
| 异氟烷 | 各种 | 兽用级 | |
| 麻醉吸入系统 | 各种 | 兽用级 | |
| 精细剪刀 | FST | 14085-09 | 直型，尖/尖 |
| 精细剪刀 | FST | 14558-09 | 直型，尖/尖 |
| 梅岑鲍姆剪刀 | FST | 14018-13 | 直型，钝/钝 |
| 镊子 | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| 镊子 | FST | 11018-12 | 显微有齿镊 |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG | |
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG | |
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA | |
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA | |
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATFCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
参考文献
- Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
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