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方法文章

由突变黑色素细胞干细胞启动小鼠黑色素瘤的空间与时间控制

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DOI：

10.3791/59666

⸱

2019年6月7日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Cornell University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

以下实验方案描述了一种利用基因工程小鼠模型，在小鼠背部皮肤中实现黑色素细胞肿瘤发生时空控制的方法。本方案详细说明了肉眼可见及显微镜下的皮肤黑色素瘤起始过程。

摘要

皮肤黑色素瘤是众所周知最具侵袭性的皮肤癌。尽管其风险因素和主要的遗传改变已被日益深入地记录，但近几十年来皮肤黑色素瘤的发病率仍呈现出快速且持续上升的趋势。为了寻找有效的预防方法，了解黑色素瘤在皮肤中发生的早期步骤至关重要。已有研究数据表明，成体皮肤组织中的毛囊黑素细胞干细胞（MCSCs）在携带致癌突变和遗传改变时，可作为黑色素瘤的起源细胞。当具有黑色素瘤倾向的MCSCs从静息状态转变为活跃状态时，即可诱发肿瘤发生。这种具有黑色素瘤倾向的MCSCs的状态转变，可通过调控毛囊干细胞的活性状态或外界环境因素（如中波紫外线（UV-B））来促进。在实验室中，这些因素可通过化学脱毛方法进行人为操控，化学脱毛可诱导毛囊干细胞和MCSCs从静息状态进入活跃状态；同时，也可通过使用台式光源进行UV-B照射来实现。这些方法可在小鼠背部皮肤中实现对皮肤黑色素瘤发生的时空精确控制。因此，这些体内模型系统对于明确皮肤黑色素瘤发生的早期过程具有重要价值，并可用于测试潜在的肿瘤预防策略。

引言

黑色素瘤是黑色素细胞肿瘤的恶性形式，是皮肤中最具有侵袭性的癌症，其中皮肤黑色素瘤导致了大多数皮肤癌相关死亡1在美国，黑色素瘤的诊断较为常见，预计将成为第5th 至 6th 2018年估计新增癌症病例中最常见的癌症类型2此外，尽管近几十年来总体癌症发病率呈逐渐下降趋势，但皮肤黑色素瘤的发病率在过去几十年中却持续快速上升，且在两性中均表现出这一趋势2.

为了更有效地防治皮肤黑色素瘤，必须清楚地了解黑色素瘤从其起源细胞开始的早期发生过程，从而更好地识别具有临床效果的预防方法。目前研究表明，成体干细胞可作为多种器官（包括皮肤组织）中癌症的细胞起源，在肿瘤形成过程中发挥重要作用3,4,5。类似地，小鼠背部皮肤中的成体黑素细胞干细胞（MCSCs）在Ras/Raf和Akt信号通路异常激活时，可作为黑色素瘤的起源细胞6。然而，仅这些致癌突变尚不足以高效地从静息状态的MCSCs诱导肿瘤形成。黑素细胞性肿瘤通常在MCSCs因自然毛发周期而被激活后才最终发展形成。但在本实验方案中，我们将介绍人工诱导易瘤型MCSCs细胞活化的方法，从而实现对黑色素瘤起始过程的精确控制6,7。

通过本文所述方法，可成功实现对表达癌基因BrafV600E并同时缺失Pten表达的肿瘤易感性黑素细胞干细胞（MCSCs）向皮肤黑色素瘤启动过程的时空控制，我们此前已有报道6。该方法结合了以往的研究发现，即通过脱毛可激活毛囊干细胞，以及小鼠皮肤暴露于UV-B辐射可促进毛囊内驻留的MCSCs活化，并促使该细胞亚群迁移至毛囊间表皮6,8,9,10。这些体内模型系统可提供重要信息，揭示生理和环境变化如何改变易发黑色素瘤的MCSCs细胞状态，进而诱导皮肤中显著的黑色素瘤发生。

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方案

所有动物实验均按照康奈尔大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定进行。

1. 准备

  1. 从出生后12天的小鼠尾部采集组织样本，加入400 µL 0.05 N NaOH，在95 °C下消化1小时。涡旋混匀后，加入32 µL 1 M Tris-HCl（pH 7）。根据杰克逊实验室提供的PCR方案对小鼠进行基因型鉴定，并筛选出目标基因型6。
    - Tyr-CreER – 半合子（+/CreER）
    - LSL-BrafV600E – 杂合子（+/LSL-V600E）
    - Pten – 纯合flox型（flox/flox）
    - LSL-tdTomato – 半合子（+/LSL-tdTomato）
    注意：引物序列见材料表。
  2. 在进行以下所有实验前2至3天，使用电推剪剃除小鼠背部皮肤的毛发，此时小鼠年龄约为7周。操作时需小心避免损伤小鼠薄嫩的皮肤，因为任何创伤都可能引发伤口愈合反应，从而激活毛囊干细胞，包括黑色素细胞干细胞（MCSCs）。
  3. 在等待期间确认毛发周期是否处于休止期（telogen），并检查皮肤是否有损伤。若皮肤出现任何损伤迹象，则不应将该小鼠用于后续实验。
    注意：尽管不同遗传背景小鼠的毛发周期可能存在轻微差异，但在该年龄段，背部皮肤的毛发周期通常处于休止期11。Tyr-CreER转基因将靶向休止期皮肤中的MCSCs，随后的遗传修饰将在MCSC的所有谱系中永久表达，包括分化后的黑色素细胞及黑色素细胞肿瘤。

2. 用于 Cre-Lox 基因重组的他莫昔芬处理

  1. 用于腹腔注射（IP）或局部给药以实现全身性或局部基因重组的他莫昔芬制备
    注意： 为了诱导基因重组，他莫昔芬必须首先在肝脏中代谢为4-羟基他莫昔芬（4-OHT），后者可结合并激活CreER。局部应用的他莫昔芬不会以这种方式被代谢，因此必须直接使用4-OHT。仅需一种他莫昔芬递送方式即可实现充分的基因重组。
    1. 他莫昔芬：将他莫昔芬配制成浓度为10 mg mL-1的玉米油溶液。为促进药物溶解，可在粉末状药物中加入最多占总体积10%的100%分子级乙醇，涡旋3分钟，然后加入剩余体积的玉米油。持续涡旋直至溶液中无可见结晶物质。可通过0.2 µm滤器过滤对溶液进行灭菌。随后进行步骤2.2.1处理。
    2. 4-OHT：用100%乙醇配制浓度最高达3 mg mL-1的羟基他莫昔芬储备液。然后可根据需要将工作液涂抹于目标皮肤区域（通常单次使用即可）。
      注意： 羟基他莫昔芬储备液可用100%乙醇溶解，配制成终浓度为5 mM的溶液。随后，取5 µL 4-OH-他莫昔芬储备液加入15 µL 100%乙醇中稀释，得到工作液。对于4 mm2的区域，可局部涂抹1至3 µL工作液。
  2. 通过全身性或局部方式给予小鼠他莫昔芬处理
    1. 进行全身性处理时，使用26 G针头每日一次腹腔注射2 mg他莫昔芬，连续给药3天。
      注意： 在该模型中，约93% ± 4%的静息态MCSCs会被tdTomato标记6。
    2. 进行区域性激活时，使用4-OHT进行一次局部处理。将工作液覆盖于目标皮肤区域。工作液用量可根据目标区域大小参照步骤2.1.2确定。
  3. 在最后一次给予他莫昔芬后48小时，进入步骤3进行化学脱毛诱导的肿瘤起始，或进入步骤4进行UV-B诱导的肿瘤起始

3. 化学脱毛

  1. 准备一个配备异氟烷系统的实验小鼠处理室，并备齐以下所需材料：脱毛膏、棉签、湿巾纸和水。
  2. 将小鼠放入诱导室，使用3.5%至4.5%异氟烷和1 L/min氧气进行麻醉。
  3. 待呼吸频率稳定后，通过脚趾夹捏测试确认小鼠已达到适当的麻醉深度，随后将小鼠转移至主麻醉管路，维持1%至1.5%异氟烷和1 L/min氧气的麻醉状态。同时涂抹眼膏，防止麻醉期间眼睛干涩。
  4. 使用棉签将一层薄薄的脱毛膏均匀涂抹于小鼠皮肤的剃毛区域。
  5. 脱毛膏均匀涂抹后，使用干净的棉签开始清除。脱毛膏与皮肤接触的总时间不得超过1分钟。
  6. 用湿润的纸巾轻轻擦拭皮肤，确保所有残留的脱毛膏均被清除。
    注意：若脱毛膏未彻底清除，可能引起皮肤刺激。某些品系的小鼠（如C57BL/6背景）较易发生皮炎12。尽管较为罕见，部分动物在使用脱毛膏或机械脱毛后24小时内可能出现皮炎。务必在处理后的第二天检查小鼠，观察是否存在局部皮肤刺激的迹象。
  7. 将去除的毛干及使用过的材料丢弃至生物危害废物桶中。
  8. 将小鼠放入一个干净且无其他动物的笼子中，直至麻醉作用完全消退。
  9. 将小鼠放回其原有饲养笼中。

4. UV-B 照射

  1. 准备一个配备异氟烷系统的实验小鼠处理室，并备齐以下所需材料：UV-B 光源系统、UV-B 光强度计、小鼠防护覆盖物、研究人员用 UV-B 防护个人防护装备（PPE）以及计时器。
  2. 应以目标 UV-B 剂量（例如 0–180 mJ/cm2）照射小鼠。使用 UV-B 光强度计确定照射小鼠所需的合适时间。
    注意：mW/cm2 × 时间 = 剂量
  3. 使用异氟烷对小鼠进行麻醉。在诱导舱内，使用 3.5% 至 4.5% 的异氟烷和 1 L/min 的氧气。
  4. 待小鼠状态稳定后，通过脚趾夹捏法确认麻醉效果，并将小鼠转移至位于 UV 腔室内的主麻醉管中。涂抹眼膏以防止麻醉期间眼睛干涩。以 1% 至 1.5% 的异氟烷和 1 L/min 的氧气维持麻醉状态。
  5. 用 UV-B 防护材料覆盖小鼠背部皮肤，仅暴露目标照射区域。
    注意：此时应使用适当的个人防护装备。 所需照射时间取决于所用灯泡的强度，但如果所需时间超过 30 秒，则可能需要监测麻醉状态。 
  6. 使用抗 UV 的盖子或其他合适的材料盖住 UV 腔室。
  7. 打开 UV-B 灯，按照研究人员为特定实验目的确定的时间照射小鼠。
  8. 关闭 UV-B 系统和异氟烷，然后将小鼠放入空的小鼠笼中，直至麻醉作用消退。
  9. 将小鼠放回其原有笼具中。

5. 组织处理

  1. 皮肤分离
    1. 开始前准备以下物品：解剖器械、滤纸和纸巾.
    2. 根据IACUC批准的方案实施安乐死，并在继续操作前确认动物死亡。
    3. 使用理发剪剃除背部皮肤区域的毛发。用无绒布轻轻擦拭该区域以清洁。
    4. 用锋利的剪刀在尾部基部稍上方做一个小切口。
    5. 将大型钝头剪刀插入切口，分离皮下结缔组织。
    6. 使用锋利的剪刀沿组织边缘小心地切割，分离出目标皮肤区域。
    7. 将皮肤组织置于干净的纸巾上，使用钝头镊子轻轻拉伸皮肤，使其贴附于纸巾并保持紧绷。此步骤可为组织提供额外支撑，便于后续操作和处理过程中维持其形态。
      注意： 操作时应仅夹取皮肤组织的外围区域，因为镊子可能对皮肤造成损伤，这种损伤可在组织学上观察到。
  2. 组织固定
    1. 将一张滤纸对折并做好相应标记。立即将带有纸巾衬垫的皮肤样本紧贴折痕处放入折叠的滤纸中，确保样本平整，无折叠或褶皱。用订书钉将滤纸开口的两侧封好，然后修剪多余部分，以便剩余滤纸可用于后续样本。
      注意： 此步骤的目的是使皮肤在固定过程中保持其原有形态。
    2. 将组织样本完全浸入10%中性缓冲福尔马林中，室温下放置3至5小时，或4℃过夜。 °C.
    3. 固定后，将样本从甲醛溶液中取出，用去离子水清洗（每次5分钟，共2次），然后进行组织包埋。仔细清除皮肤组织上残留的任何物质（如残留纸屑）。
  3. 制作冷冻组织块图1)
    1. 修剪皮肤样本的边缘，使其平滑无锯齿，然后进行3次矢状面切割。这些条带的宽度不应超过冷冻模具的高度（5 mm）。接着进行横向切割，使皮肤组织块的长度不超过冷冻模具的宽度（20 mm），以便包埋。对剩余的背部皮肤半侧重复上述操作，或将组织保存用于其他用途（也可在固定前预先保存一半组织）。
      注意： 保持皮肤组织的正确方向至关重要。
    2. 将冷冻模具（25 x 20 x 5 mm）定向摆放3) 纵向放置，并将 4 至 5 块皮肤置于 OCT 包埋剂上。待所有皮肤块就位后，使用两对精细镊子将皮肤的长边向下拉至冷冻模具底部。此时皮肤应垂直立于 OCT 中，与模具底部垂直。此过程中需注意尽量减少 OCT 内气泡的形成（图1).
    3. 用OCT填充模具至第二层边缘，并置于干冰的平坦表面上。在组织块开始冻结时，使用镊子调整在转移过程中可能发生移位的任何皮肤组织。一旦底层完全凝固，将无法再对组织进行操作。
    4. 剪取8-10 µ用于分析的 m 张载玻片
  4. 制作福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块
    1. 将两片固定好的皮肤组织放入已标记的包埋盒中，依次用浓度递增的乙醇进行脱水（75%乙醇30分钟，85%乙醇30分钟，90%乙醇30分钟，95%乙醇30分钟，100%乙醇两次，每次30分钟），再用二甲苯或二甲苯替代物处理两次，每次30分钟。随后在58–60 °C条件下用石蜡孵育。˚，先30分钟，然后过夜。
    2. 将组织包埋于 24 x 24 mm2 不锈钢组织模具中加入液体石蜡，并在 -5℃ 下固化 °C. 组织方向应与冷冻组织块的方向相似，以便观察跨越多个毛囊的纵向切面（图1).
    3. 石蜡凝固后，取下模具并切成5-10 μ用于分析的 m 个切片

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结果

化学脱毛诱导的皮肤黑色素瘤发生

化学脱毛的过程如图2所示。当小鼠出生后7周时，其背部皮肤处于休止期（telogen）。在休止期，毛囊干细胞和MCSCs已知处于静息的静止状态。剃毛后皮肤应无明显毛发生长。相反，化学脱毛可诱导毛囊干细胞活化，从而在目标区域出现显著的毛发生长（图2）。类似地，表达致癌突变的易发肿瘤MCSCs也需要被激活才能加速肿瘤形成。化学脱毛可显著诱导毛囊干细胞和MCSCs的活化。处于活化状态的易发黑色素瘤MCSCs能够形成肿瘤，利用谱系示踪等位基因LSL-tdTomato可在化学脱毛后2周内观察到显微镜下的黑色素瘤起始过程（图3）。

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讨论

皮肤黑色素瘤肿瘤中常见的标志性遗传改变已有充分描述13。其中最主要的驱动突变是 BrafV600E，Bosenberg 研究组构建了用于研究 BrafV600E 介导的黑色素瘤的基因工程小鼠模型14，并将其保存于杰克逊实验室。利用该小鼠模型，我们近期的研究证明，在背部皮肤中有效启动 BrafV600E 介导的黑色素瘤需要肿瘤易感性黑素细胞干细胞（MCSCs）的细胞活化6。

已知脱毛是一种有效诱导小鼠背部皮肤毛囊干细胞活化的方法6,10。小鼠黑素细胞干细胞（MCSCs）位于毛囊内，且毛囊内MCSCs的细胞状态与毛囊干细胞的状态同步8。人工调控毛囊干细胞可改变MC...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究工作由美国国防部卫生事务助理部长办公室通过同行评审癌症研究项目（资助号：W81XWH-16-1-0272）资助。观点、解释、结论和建议均为作者个人观点，不一定代表美国国防部的立场。本研究工作还获得了康奈尔干细胞计划向 A.C. White 提供的种子基金资助。H. Moon 得到了康奈尔脊椎动物基因组中心学者项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
他莫昔芬SigmaT5648-1G用于全身注射
他莫昔芬Cayman Chemical13258用于全身注射
玉米油Sigma45-C8267-2.5L-EA
4OH-他莫昔芬SigmaH7904-25MG用于局部处理
26 G 1/2" 针头各种兽用级
1 mL 注射器各种兽用级
宠物毛发修剪器Wahl09990-502
脱毛膏Nairn/a大多数药店有售
棉签各种
紫外灯泡UVP95-0042-08型号 XX-15M 中波紫外灯
200 proof 乙醇各种纯乙醇
Histoplast PEFisher Scientific22900700石蜡颗粒
10% 中性缓冲福尔马林SigmaHT501128-4L
Clear-Rite 3Thermo Scientific6901二甲苯替代品
O.C.T. 包埋剂Thermo23730571
组织包埋盒Sakura89199-430用于 FFPE 处理
冷冻模具Sakura455725 x 20 mm
FFPE 金属模具Leica380308224 mm x 24 mm
异氟烷各种兽用级
麻醉吸入系统各种兽用级
精细剪刀FST14085-09直型，尖/尖
精细剪刀FST14558-09直型，尖/尖
梅岑鲍姆剪刀FST14018-13直型，钝/钝
镊子FST11252-00Dumont #5
镊子FST11018-12显微有齿镊
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/fJackson Labs13590
LSL-tdTomatoJackson Labs007914ai14
Cre-1n/aGCATTACCGGTCGATGCAACGA
GTGATGAG
Cre-2n/aGAGTGAACGAACCTGGTCGAA
ATCAGTGCG
Braf-V600E-1n/aTGAGTATTTTTGTGGCAACTGC
Braf-V600E-2n/aCTCTGCTGGGAAAGCGGC
Kras-G12D-1n/aAGCTAGCCACCATGGCTTGAGT
AAGTCTGCA
Kras-G12D-2n/aCCTTTACAAGCGCACGCAGACT
GTAGA
Pten-1n/aACTCAAGGCAGGGATGAGC
Pten-2n/aAATCTAGGGCCTCTTGTGCC
Pten-3n/aGCTTGATATCGAATFCCTGCAGC
tdTomato-1n/aAAGGGAGCTGCAGTGGAGTA
tdTomato-2n/aCCGAAAATCTGTGGGAAGTC
tdTomato-3n/aGGCATTAAAGCAGCGTATCC
tdTomato-4n/aCTGTTCCTGTACGGCATGG

参考文献

  1. Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
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