本文介绍了一种从小型猪中分离原代猪主动脉内皮细胞（pAECs）的有效酶解方法。所分离的原代pAECs可用于研究异种移植中的免疫和凝血反应。
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本文内容
摘要
摘要
异种移植是解决终末期器官衰竭患者人体器官短缺问题的一种有前景的方法，而猪被认为是合适的器官来源。免疫排斥和凝血反应是异种移植成功面临的两大主要障碍。血管内皮细胞（EC）的损伤和功能障碍在异种移植中炎症和凝血反应的发生发展中具有重要作用。因此，分离猪主动脉内皮细胞（pAECs）对于研究免疫排斥和凝血反应十分必要。本文建立了一种简便的酶消化法，用于从小型猪中分离、鉴定并扩增高纯度的pAECs。首先，使用氯胺酮对小型猪进行麻醉，并切除一段主动脉。其次，将主动脉内皮面暴露于0.005% IV型胶原酶消化液中消化15分钟。第三，仅沿单一方向用细胞刮铲轻轻刮取主动脉内皮面（<10次），刮取过程中避免压迫组织。最后，通过抗CD31抗体流式细胞术鉴定第3天原代及第1代、第2代传代后的pAECs。CD31阳性细胞的比例分别为97.4% ± 1.2%、94.4% ± 1.1%和92.4% ± 1.7%（均值±标准差）。IV型胶原酶的浓度、消化时间、刮取方向以及刮取频率和力度对于减少成纤维细胞污染、获得高纯度和大量内皮细胞至关重要。综上所述，本研究建立的酶消化法是一种高效分离小型猪主动脉内皮细胞的方法，所获细胞可在体外扩增，用于研究异种移植中的免疫和凝血反应。
引言
可供移植的器官短缺是全球范围内亟待解决的突出问题1。根据中国红十字会的数据，2018年在中国仅有少数终末期器官衰竭患者获得了合适的器官进行移植。
异种移植是解决器官短缺问题的一种有前景的方法。由于猪器官在解剖学和生理学上与人类具有相似性，被认为是人类最合适的器官来源2,3。猪异种移植物的失败主要与灵长类动物的免疫排斥和凝血反应有关。猪内皮细胞（ECs）至关重要，因为这些细胞是首先与包括抗体、补体、细胞因子以及免疫细胞（如T细胞、B细胞和巨噬细胞）在内的灵长类免疫系统相互作用的细胞4,5。猪内皮细胞在猪器官及胰岛异种移植中发挥着关键作用6,7。因此，内皮细胞是研究对猪移植物免疫排斥和凝血反应的重要细胞。异种移植研究需要分离高质量的猪内皮细胞。
为了从不同器官（如心脏、肾脏、肝脏和主动脉）中分离内皮细胞（ECs），已有多种方案在异种移植背景下被报道8,9,10,11,12。然而，在标准操作流程中维持分离后内皮细胞的超纯培养仍是一个突出难题。消化液浓度过高、消化时间不当以及刮取力度不适宜，均可能导致当前研究中成纤维细胞污染增加8,10,13。此外，从小型猪中分离肺动脉内皮细胞（pAECs）的方法研究较少。本文介绍了一种优化的酶消化法，用于从小型猪（五指山猪或巴马猪）中分离高纯度的pAECs。本方案中的多个步骤经过设计，旨在减少成纤维细胞污染，从而获得高纯度的内皮细胞。
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方案
动物实验已获得深圳市第二人民医院伦理审查委员会批准，符合动物福利原则。
1. 动物、培养基和缓冲液的准备
- 准备实验用小型猪。
注：所有小型猪均为中国五指山猪或巴马猪（雄性），猪的年龄和体重分别为 100 天 ± 8 天和 5.7 kg ± 1.0 kg（均值 ± 标准差，n = 3）。 - 配制培养基：内皮细胞培养基（ECM）中添加 10%（v/v）热灭活胎牛血清（FBS）、1%（v/v）青霉素/链霉素（P/S）和 1%（v/v）内皮细胞生长补充剂（ECGS）。
- 配制洗涤缓冲液：含 1%（v/v）P/S 的 1× PBS 溶液（pH 7.4）。
- 配制 0.005% 胶原酶 IV 消化液：将 1 mg 胶原酶 IV 粉末溶于 20 mL PBS 溶液中。消化前将胶原酶消化液预热至 37 °C。
- 配制终止缓冲液：杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加 10% 热灭活 FBS 和 1% P/S。
2. 猪主动脉内皮细胞分离的手术与准备工作
- 手术前，使用紫外线照射手术室 1 小时，并用医用消毒剂 84 液（有效氯含量为 4.0% - 5.0%，材料表）进行消毒。
- 给小型猪肌肉注射由 15 mg/kg 氯胺酮、15 mg/kg 盐酸赛拉嗪和 0.05 mg/kg 盐酸非那西汀组成的混合液（注射体积：100μL/kg，材料表）（图 1A）后，通过检测猪的疼痛反应（例如捏住一只耳朵或摇动一条前肢）以及生理指标（例如血压、心率和呼吸频率）确认其麻醉状态。
注意：若猪出现苏醒迹象，可追加半剂量注射。 - 使用手术刀切开腹部，暴露下腔静脉，随后用 5 mL 注射器将肝素钠（5,000 U，材料表）注入下腔静脉。
- 5 分钟后，将导管插入腹主动脉放血，切开胸部皮肤并用手术刀切开膈肌，随后剪断左心室。
注意：放血并剪开心脏后，需检查主动脉脉搏以确认猪已被安乐死。 - 使用骨钳剪除肋骨（材料表），暴露心脏和肺脏。找到位于心脏和肺脏后方的主动脉，并夹闭其两端。用预冷的洗涤缓冲液冲洗主动脉一次（图 1B,C）。
- 用剪刀取出主动脉，并保持其两端处于夹闭状态。使用无菌镊子和剪刀去除主动脉周围的多余组织。将主动脉放入 50 mL 离心管中，用预冷的洗涤缓冲液洗涤 3 次（每次 30 mL），然后将主动脉转移至实验室（图 1D）。
3. 猪主动脉内皮细胞的分离
- 在无菌条件下，将猪主动脉从洗涤缓冲液中取出，置于150 mm的培养皿中（图2A）。
- 用无菌镊子和剪刀小心剪除主动脉的两端，并再次去除主动脉周围的多余组织（图2B）。在室温下，用20−50 mL洗涤缓冲液冲洗主动脉的外表面和内腔（在培养皿上方进行）。
注意：手术过程中夹钳夹持区域的内皮细胞可能已受损，应仅切除该区域；同时去除多余组织和动脉侧支。 - 将外科缝合线穿过主动脉，然后用外科缝合线（5-0，90 cm，材料表）结扎主动脉的一端。将缝合线保留在主动脉内腔中（图2C、D）。
- 用镊子轻轻夹住结扎端附近的主动脉，然后缓慢拉动缝合线，将主动脉翻转，直至其内皮表面暴露（图2E-G）。
注意：务必夹住结扎端附近的位置，且夹持力度不宜过紧，否则无法通过拉动缝合线完成翻转。 - 用洗涤缓冲液清洗主动脉内皮表面3次（每次10 mL），然后弃去清洗液。将主动脉放入15 mL离心管中，并加入10 mL 0.005% IV型胶原酶消化液，完全覆盖主动脉（图2H）。
注意：消化前需将0.005% IV型胶原酶消化液预热至37 °C。 - 在37 °C孵育15分钟。将消化后的主动脉及消化液转移至100 mm培养皿中，加入10−15 mL预冷的终止缓冲液，以终止0.005% IV型胶原酶的作用。
注意：推荐消化时间为10至20分钟。确保主动脉的内皮表面被终止缓冲液完全覆盖。 - 使用细胞刮刀沿一个方向轻轻刮取主动脉内表面的pAECs（图2I）。用洗涤缓冲液清洗刮取后的主动脉3次（每次5 mL）。将培养皿中的液体转移至50 mL离心管中。再用洗涤缓冲液冲洗培养皿底部2次（每次5 mL），并将冲洗液一并转移至同一50 mL离心管中。
注意：刮取时动作应轻柔，避免压迫组织，不要触碰边缘和孔洞区域。建议刮取5−8次。 - 在4 °C条件下，以600 × g离心6分钟。弃去上清液，保留约10 mL液体于50 mL离心管底部。向管中加入20 mL洗涤缓冲液，重悬细胞沉淀。此步骤应避免产生气泡。
- 在4 °C条件下，以600 × g离心6分钟。缓慢弃去上清液。用1 mL培养基重悬细胞沉淀，并充分混匀。
注意：每厘米主动脉平均可获得内皮细胞数量为1.9 × 105 ± 1.4 × 104（均值 ± 标准差，n = 3）。 - 使用细胞计数仪对细胞进行计数。根据细胞数量，将细胞接种并培养于未经任何包被处理的培养容器中。若细胞数量小于或等于1.0 × 106，则接种于一个25 cm2培养瓶中；若细胞数量大于1.0 × 106，则分装至多个25 cm2培养瓶中（每瓶接种1.0 × 106个细胞）。将培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中静置培养，每2−3天更换一次培养基。
注意：部分细胞可能因刮取操作而受损。细胞活力检测显示活细胞比例为95.7% ± 1.7%（均值 ± 标准差，n = 3）。分离获得的细胞倍增时间约为1−2天。
4. 纯化内皮细胞的收获与表征
- 将细胞培养约 4−5 天。当细胞达到 80% 汇合度（图 3A）时，用 0.25% 胰蛋白酶消化细胞并进行传代。随后，收集部分分离的细胞（第 3 天、第 1 代和第 2 代），并通过流式细胞术（使用抗 CD31 抗体）进行鉴定。
- 用抗猪 CD31-异硫氰酸荧光素（FITC）偶联抗体对分离的 pAECs 细胞（细胞数量：1 × 105）（第 3 天、第 1 代和第 2 代）进行标记（每 100 µL 细胞加入 10 µL 抗体，4 °C 下染色 30 分钟），用于流式细胞术分析。
- 通过前向散射图选通总活细胞群体，以未染色样本作为阴性对照。然后以直方图显示选通细胞中 CD31 阳性细胞的比例。
注：CD31 阳性细胞的比例分别为 97.4% ± 1.2%（第 3 天）、94.4% ± 1.1%（P1）和 92.4% ± 1.7%（P2）（均值 ± 标准差）（图 3B）。
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结果
本方法旨在提供一种从小型猪主动脉中分离高纯度内皮细胞的有效途径。图1展示了主动脉手术过程。第一步是将整段主动脉从猪体内完整切除。防止其他细胞或细菌污染至关重要，因此在操作中应避免损伤其他器官或组织，以防非靶细胞或细菌污染主动脉，并使用预冷的洗涤缓冲液清洗主动脉3次（图1B-D）。另一个维持细胞活力的关键步骤是尽量缩短获取手术标本与开始分离操作之间的时间间隔。
pAECs 的纯化过程如图2所示。我们的方法与其他方法不同，因为主动脉的一端被结扎，内皮表面得以暴露（图2C-G）。随后，将整个主动脉的内皮表面置于15 mL离心管中，用预热的胶原酶消化液（5–10 mL）进行消化（图2H）。与其它方法相比，由于主动脉被翻转并完全浸入消化液中（无气泡），内皮表面能更充分且优先地接触消化液。消化完成后，使用终止缓冲液终...
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讨论
内皮细胞常用于血管功能障碍、糖尿病、组织再生、移植和癌症等领域的研究14,15,16,17,18。为了理解并表征内皮细胞在这些疾病中的生物学特性与功能，已有多种方法被报道用于从不同病变器官或组织中分离内皮细胞8,19,20,21,22,23,24。近年来，...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了广东省自然科学基金（资助/奖项编号：2016A030313028）、广东省医学科研基金（资助/奖项编号：B2018003）、深圳市科技计划项目（资助/奖项编号：JCYJ20180306172449376、JCYJ20180306172459580、JCJY20160229204849975、GJHZ20170314171357556、JCYJ20160425103000011 和 JCYJ20160428142040945）、深圳市龙华区科技计划项目（资助/奖项编号：2017013）以及国家重点研发计划的资助。&中国国家重点研发计划，资助/奖项编号：2017YFC1103704；深圳市医疗卫生“三名”工程，资助/奖项编号：SZSM201412020；广东省高水平医院建设专项资金（2019年）；深圳市高水平医学学科建设项目基金，资助/奖项编号：2016031638；深圳市卫生和计划生育委员会基金，资助/奖项编号：SZXJ2017021 和 SZXJ2018059。我们感谢深圳大学的 Hancheng Zhang 和 Zhicheng Zou 在手稿准备过程中提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BD FACSAria II | BD 生物科学 | ||
| 骨科镊 | 北京和利康源科技发展有限公司 中国 | HL-YGQ | |
| BOON 一次性注射器（10ml） | 江苏益乐医疗器械有限公司 中国 | ||
| CD31-FITC 抗体 | 伯乐生命科学 | MCA1746F | |
| 细胞刮 | 康宁 | 3010# | |
| IV型胶原酶 | 西格玛-奥德里奇 | C5138#-1G | |
| 复方氯胺酮注射液 | 中国沈阳兽药厂 | 盐酸氯胺酮：0.3g/2ml，盐酸赛拉嗪：0.3g/2ml，盐酸非那西汀：1mg/2ml | |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐） | 生命技术公司 | D1306# | |
| DMEM | 生命技术公司 | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf 带盖微量离心管（1.5mL） | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm 细胞培养皿 | 康宁 | 353003# | |
| 胎牛血清 | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| 镊子 | 上海医疗器械有限公司 中国 | ||
| 肝素钠 | 江苏万邦生化医药集团有限责任公司 中国 | ||
| 碘酊 | 桂林立丰医疗器械有限公司 中国 | ||
| 小型猪（巴马或五指山） | 康益生态农业有限公司 中国 | ||
| Mshot 显微镜 | 广州麦景科技有限公司 | M152 | |
| 培养皿（150 x 15 mm） | Biologix集团 | 66-1515# | |
| 青霉素/链霉素 | 生命技术公司 | 15070063# | |
| 带通气盖的矩形斜颈细胞培养瓶 ?T25? | 康宁 | 3289# | |
| 剪刀 | 上海医疗器械有限公司 中国 | ||
| 血清移液管（10ml） | JET Biofil | GSP010010# | |
| 无菌巴斯德吸管 | GeneBrick | GY0025# | |
| 无菌注射器滤器（0.22µm） | 默克密理博 | SLGV033RS# | |
| 手术刀 | 上海医疗器械有限公司 中国 | 22# | |
| 外科缝合线 | 上海浦东金环医疗用品有限公司 | 5-0# | |
| 注射器?5mL? | 圣光医用仪器有限公司 中国 | ||
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红 | GIBCO | 25200056# | |
| 75% 医用酒精 | 桂林立丰医疗器械有限公司 中国 | ||
| 20 x PBS 溶液（pH 7.4，无核酸酶） | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | B540627# | |
| 医用消毒剂 84 液 | 四川省益佳时医疗科技有限公司 | 450ml/瓶 |
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