本文介绍了一种从小型猪中分离原代猪主动脉内皮细胞（pAECs）的有效酶解方法。所分离的原代pAECs可用于研究异种移植中的免疫和凝血反应。
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本文内容
摘要
摘要
异种移植是解决终末期器官衰竭患者人体器官短缺问题的一种有前景的方法，而猪被认为是合适的器官来源。免疫排斥和凝血反应是异种移植成功面临的两大主要障碍。血管内皮细胞（EC）的损伤和功能障碍在异种移植中炎症和凝血反应的发生发展中具有重要作用。因此，分离猪主动脉内皮细胞（pAECs）对于研究免疫排斥和凝血反应十分必要。本文建立了一种简便的酶消化法，用于从小型猪中分离、鉴定并扩增高纯度的pAECs。首先，使用氯胺酮对小型猪进行麻醉，并切除一段主动脉。其次，将主动脉内皮面暴露于0.005% IV型胶原酶消化液中消化15分钟。第三，仅沿单一方向用细胞刮铲轻轻刮取主动脉内皮面（<10次），刮取过程中避免压迫组织。最后，通过抗CD31抗体流式细胞术鉴定第3天原代及第1代、第2代传代后的pAECs。CD31阳性细胞的比例分别为97.4% ± 1.2%、94.4% ± 1.1%和92.4% ± 1.7%（均值±标准差）。IV型胶原酶的浓度、消化时间、刮取方向以及刮取频率和力度对于减少成纤维细胞污染、获得高纯度和大量内皮细胞至关重要。综上所述，本研究建立的酶消化法是一种高效分离小型猪主动脉内皮细胞的方法，所获细胞可在体外扩增，用于研究异种移植中的免疫和凝血反应。
引言
可供移植的器官短缺是全球范围内亟待解决的突出问题1。根据中国红十字会的数据，2018年在中国仅有少数终末期器官衰竭患者获得了合适的器官进行移植。
异种移植是解决器官短缺问题的一种有前景的方法。由于猪器官在解剖学和生理学上与人类具有相似性，被认为是人类最合适的器官来源2,3。猪异种移植物的失败主要与灵长类动物的免疫排斥和凝血反应有关。猪内皮细胞（ECs）至关重要，因为这些细胞是首先与包括抗体、补体、细胞因子以及免疫细胞（如T细胞、B细胞和巨噬细胞）在内的灵长类免疫系统相互作用的细胞4,5。猪内皮细胞在猪器官及胰岛异种移植中发挥着关键作用6,7。因此，内皮细胞是研究对猪移植物免疫排斥和凝血反应的重要细胞。异种移植研究需要分离高质量的猪内皮细胞。
为了从不同器官（如心脏、肾脏、肝脏和主动脉）中分离内皮细胞（ECs），已有多种方案在异种移植背景下被报道8,
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方案
动物实验已获得深圳市第二人民医院伦理审查委员会批准，符合动物福利原则。
1. 动物、培养基和缓冲液的准备
- 准备实验用小型猪。
注：所有小型猪均为中国五指山猪或巴马猪（雄性），猪的年龄和体重分别为 100 天 ± 8 天和 5.7 kg ± 1.0 kg（均值 ± 标准差，n = 3）。 - 配制培养基：内皮细胞培养基（ECM）中添加 10%（v/v）热灭活胎牛血清（FBS）、1%（v/v）青霉素/链霉素（P/S）和 1%（v/v）内皮细胞生长补充剂（ECGS）。
- 配制洗涤缓冲液：含 1%（v/v）P/S 的 1× PBS 溶液（pH 7.4）。
- 配制 0.005% 胶原酶 IV 消化液：将 1 mg 胶原酶 IV 粉末溶于 20 mL PBS 溶液中。消化前将胶原酶消化液预热至 37 °C。
- 配制终止缓冲液：杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加 10% 热灭活 FBS 和 1% P/S。
2. 猪主动脉内皮细胞分离的手术与准备工作
- 手术前，使用紫外线照射手术室 1 小时，并用医用消毒剂 84 液（有效氯含量为 4.0% - 5.0%，材料表）进行消毒。
- 给小型猪肌肉注射由 15 mg/kg 氯胺酮、15 mg/kg ....
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结果
本方法旨在提供一种从小型猪主动脉中分离高纯度内皮细胞的有效途径。图1展示了主动脉手术过程。第一步是将整段主动脉从猪体内完整切除。防止其他细胞或细菌污染至关重要，因此在操作中应避免损伤其他器官或组织，以防非靶细胞或细菌污染主动脉，并使用预冷的洗涤缓冲液清洗主动脉3次（图1B-D）。另一个维持细胞活力的关键步骤是尽量缩短获取手术标本与开始分离操作之间的时间间隔。
pAECs 的纯化过程如图2所示。我们的方法与其他方法不同，因为主动脉的一端被结扎，内皮表面得以暴露（图2C-G）。随后，将整个主动脉的内皮表面置于15 mL离心管中，用预热的胶原酶消化液（5–10 mL）进行消化（图2H）。与其它方法相比，由于主动脉被翻转并完全浸入消化液中（无气泡），内皮表面能更充分且优先地接触消化液。消化完成后，使用终止缓冲液终.......
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讨论
内皮细胞常用于血管功能障碍、糖尿病、组织再生、移植和癌症等领域的研究14,15,16,17,18。为了理解并表征内皮细胞在这些疾病中的生物学特性与功能，已有多种方法被报道用于从不同病变器官或组织中分离内皮细胞8,19,20,21,22,23,24。近年来，.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了广东省自然科学基金（资助/奖项编号：2016A030313028）、广东省医学科研基金（资助/奖项编号：B2018003）、深圳市科技计划项目（资助/奖项编号：JCYJ20180306172449376、JCYJ20180306172459580、JCJY20160229204849975、GJHZ20170314171357556、JCYJ20160425103000011 和 JCYJ20160428142040945）、深圳市龙华区科技计划项目（资助/奖项编号：2017013）以及国家重点研发计划的资助。&中国国家重点研发计划，资助/奖项编号：2017YFC1103704；深圳市医疗卫生“三名”工程，资助/奖项编号：SZSM201412020；广东省高水平医院建设专项资金（2019年）；深圳市高水平医学学科建设项目基金，资助/奖项编号：2016031638；深圳市卫生和计划生育委员会基金，资助/奖项编号：SZXJ2017021 和 SZXJ2018059。我们感谢深圳大学的 Hancheng Zhang 和 Zhicheng Zou 在手稿准备过程中提供的协助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BD FACSAria II | BD 生物科学 | ||
| 骨科镊 | 北京和利康源科技发展有限公司 中国 | HL-YGQ | |
| BOON 一次性注射器（10ml） | 江苏益乐医疗器械有限公司 中国 | ||
| CD31-FITC 抗体 | 伯乐生命科学 | MCA1746F | |
| 细胞刮 | 康宁 | 3010# | |
| IV型胶原酶 | 西格玛-奥德里奇 | C5138#-1G | |
| 复方氯胺酮注射液 | 中国沈阳兽药厂 | 盐酸氯胺酮：0.3g/2ml，盐酸赛拉嗪：0.3g/2ml，盐酸非那西汀：1mg/2ml | |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐） | 生命技术公司 | D1306# | |
| DMEM | 生命技术公司 | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf 带盖微量离心管（1.5mL） | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm 细胞培养皿 | 康宁 | 353003# | |
| 胎牛血清 | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| 镊子 | 上海医疗器械有限公司 中国 | ||
| 肝素钠 | 江苏万邦生化医药集团有限责任公司 中国 | ||
| 碘酊 | 桂林立丰医疗器械有限公司 中国 | ||
| 小型猪（巴马或五指山） | 康益生态农业有限公司 中国 | ||
| Mshot 显微镜 | 广州麦景科技有限公司 | M152 | |
| 培养皿（150 x 15 mm） | Biologix集团 | 66-1515# | |
| 青霉素/链霉素 | 生命技术公司 | 15070063# | |
| 带通气盖的矩形斜颈细胞培养瓶 ?T25? | 康宁 | 3289# | |
| 剪刀 | 上海医疗器械有限公司 中国 | ||
| 血清移液管（10ml） | JET Biofil | GSP010010# | |
| 无菌巴斯德吸管 | GeneBrick | GY0025# | |
| 无菌注射器滤器（0.22µm） | 默克密理博 | SLGV033RS# | |
| 手术刀 | 上海医疗器械有限公司 中国 | 22# | |
| 外科缝合线 | 上海浦东金环医疗用品有限公司 | 5-0# | |
| 注射器?5mL? | 圣光医用仪器有限公司 中国 | ||
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红 | GIBCO | 25200056# | |
| 75% 医用酒精 | 桂林立丰医疗器械有限公司 中国 | ||
| 20 x PBS 溶液（pH 7.4，无核酸酶） | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | B540627# | |
| 医用消毒剂 84 液 | 四川省益佳时医疗科技有限公司 | 450ml/瓶 |
参考文献
- Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
- Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution? Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
- Cooper, D. K., Ekser, B., R....
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重印与许可
