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利用原子力显微镜测量植物细胞和植物组织的机械特性及膨压

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DOI：

10.3791/59674

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2019年7月15日

 ,  , 
1SFR Biosciences, Université de Lyon, 2Laboratoire de Reproduction et Développement des Plantes, Université de Lyon, ENS de Lyon, UCBL, INRA, CNRS

本文内容

摘要

本文介绍了原子力显微镜（AFM）作为细胞和组织的纳米及微米级压痕工具的应用。该仪器可同时获取样品的三维表面形貌及其力学特性，包括细胞壁的杨氏模量以及膨压。

摘要

本文介绍了利用原子力显微镜对植物组织进行压痕实验，以获取其力学特性的方法。通过使用两种不同的显微镜在压痕模式下操作，我们展示了如何测量弹性模量，并利用该参数评估细胞壁的力学性质。此外，我们还解释了如何评估膨压。原子力显微镜的主要优势在于其具有非侵入性、相对快速（5~20 分钟），并且几乎任何表面较为平整的活体植物组织均可在无需预处理的情况下进行分析。其分辨率可以非常高，具体取决于探针尺寸以及单位面积内的测量次数。该方法的一个局限性在于，仅能直接获取表层细胞的信息。

引言

原子力显微镜（AFM）属于扫描探针显微镜（SPM）家族，其探针尖端半径通常仅为几个纳米，用于扫描样品表面。该技术并非通过光学或电子方法来探测表面，而是通过探针与样品表面之间的相互作用力实现检测。因此，该技术不仅可用于样品表面的形貌表征（三维分辨率可达几个纳米），还可用于测量各种类型的相互作用力，如静电作用力、范德华力或接触力。此外，探针还可用于在生物样品表面施加作用力，并测量由此产生的形变——即所谓的"压痕"，以确定其力学性质（例如杨氏模量、黏弹性特性）。

在研究发育过程机制时，必须考虑植物细胞壁的力学特性1,2,3。事实上，在发育过程中，这些特性受到严格调控，特别是细胞壁软化是细胞生长所必需的。原子力显微镜（AFM）可用于测量这些特性，并研究其在不同器官、组织或发育阶段之间的变化方式。

本文中，我们描述了如何利用原子力显微镜（AFM）测量细胞壁的力学性质和膨压。这两种应用分别在两台不同的原子力显微镜上进行，并在下文中详细介绍。

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方案

1. 细胞壁力学性质的测量

注意：展示了拟南芥（Arabidopsis）雌蕊发育过程的示例。

  1. 生物样本的制备
    1. 根据已发表的拟南芥发育阶段标准，采集第9至10阶段的闭合花蕾（长约0.5 mm）4在双目镜下，使用精细镊子小心打开花蕾，检查其发育阶段，并采集位于花朵中心的雌蕊群。
    2. 将雌蕊置于直径为5 cm的小型培养皿盖中央的双面胶带上。
      注意： 作为替代方法，也可使用生物相容性胶水，以更高效地固定样品进行压痕操作。
    3. 迅速加入水，直至完全覆盖样品。这可以避免样品脱水，并减少探针与样品之间的黏附。或者，可将样品浸入液体培养基中，例如拟南芥茎尖培养基。5.
  2. 原子力显微镜校准
    1. 设定悬臂梁弹簧常数 k 足够高以使样品表面发生变形达到所需的压痕深度，但又不能过高以避免灵敏度下降。
      注意： 作为粗略的经验法则，若已知样品的杨氏模量，可据此选择弹簧常数的数量级 k≈E * δ，其中 δ 是所需的缩进。
    2. 使用一个 R 400 nm 球形末端探针 15 µm 探针-悬臂间距
      注意： 尖端半径与横向分辨率直接相关。通常情况下，对生物材料进行压痕测试时，应选择圆化尖端（R 大于10-20 nm）或胶体探针。由于小尺寸胶体探针的针尖末端与悬臂之间的距离较小，可能接触样品表面，因此使用时较为困难。
    3. 打开软件，并在实验开始前至少2-3小时将探头水平放置：这将使探头充分达到热平衡，避免因温度变化引起的悬臂与激光之间的相对移动。如果显微镜配备了CellHesion模块（可扩展Z轴压电陶瓷的可用范围至 100 µm 而不是 15 µm），启动其控制器，然后在启动软件时选择 CellHesion 模式。
    4. 将悬臂安装在玻璃块上，并将玻璃块安装在探头头部。在探针尖端滴加数微升超纯水，以避免探针浸入水中时产生气泡。
    5. 放置一个硬质样品（洁净的载玻片或蓝宝石），并加入 30-50 µL 超纯水。
      注意： 此处所述的校准程序有时被称为接触式校准。首先，在刚性且平坦的表面上获取力曲线，然后记录热激发悬臂梁的振荡谱，以计算其弹簧常数。其他校准方案也存在，将在讨论段落中简要介绍。
    6. 将样品置于载物台上（注意将Z轴电机提升至足够高度）。利用光学图像将激光大致对准悬臂。
      1. 沿悬臂梁的主轴移动激光，同时监测光电二极管上的和信号。
        注意： 当使用标准悬臂时，应获得大于 0.5 V 的总和。
      2. 沿另一个方向移动激光，使总和信号最大化，从而将激光定位在悬臂的中部。这将最大限度地减少侧向与垂直偏转之间的串扰。
    7. 偏转灵敏度的测量
      注意： 光电二极管读取激光位移并输出以伏特为单位的信号。为了能够以公制单位测量偏转量，必须测定偏转灵敏度。
      1. 将仪器设置在 接触 → 力谱学设置一个 相对设定点 至 2 V， Z轴长度 至 0.5 µm，以及 提高速度 到 2 µm/s (采样率 至10000 Hz）并选择 Z 闭环.
      2. 打开 校准管理器 选择力曲线的接触部分（应为线性部分）进行线性拟合：斜率的倒数即为悬臂梁的偏转灵敏度。此时，光电二极管的读数已以公制单位完成校准。
    8. 弹簧常数的测定。在 校准管理器，选择 弹簧常数 进行热谱采集。若需更长时间平均信号，请选择 ∞ 符号。热激发悬臂梁的功率谱可能显示多个峰；在最低频率处的峰周围绘制选区以进行拟合。
      注意： 若在液体中进行热调谐，共振峰将比标称值更宽，且其频率降低。
  3. 力谱实验的设置与数据采集
    1. 将样品置于原子力显微镜（AFM）载物台上，并将探头置于样品上方。
      注意： 确保探头已充分缩回，以避免针尖与样品表面发生硬性接触。
    2. 让悬臂梁热平衡几分钟。
    3. 在 QI 模式，采用一种方法接近 设定值 50 nN的力
    4. 设置 Z 轴长度为 4 µm 以及将扫描区域设置为 80 x 80 µm2 像素数量为40 x 40。在 高级成像设置 面板，将模式设为恒定速度。设定伸出和缩回速度为 200 µm/s 和 采样率 至 25 kHz。
    5. 开始扫描，并使用这种快速低作用力扫描方式检查样品是否移动。确认扫描区域无碎片或偏转的细胞，并定位一个尽可能平坦的感兴趣区域以进行测量。
      注意： 为了准确评估实际样品倾斜角度，应将线性调平设置为 关闭 或用于 恒定压痕轴与表面之间过大的倾斜角度将影响测得的杨氏模量5.
    6. 确定感兴趣区域后，选择一个40 x 40至60 x 60 µm2 其周围并增加像素数量以达到2像素/µm. 增加 设定值 至500 nm，以获得100-200 nm的压痕深度。如有必要，在实验开始时调整此值。减小Z轴长度至 2 µm. 降低伸出和缩回速度至 100 µm/s 并增加 采样率 至 50 kHz。
    7. 开始扫描并保存输出结果（通常由图像文件和数据文件组成）。
    8. 测量日结束时，取下探针架，并用超纯水和70%乙醇轻轻冲洗。
    9. 干燥并取下悬臂。若需使用同一探针进行后续实验，可考虑采用湿法清洗方案对其进行清洗，并在条件允许的情况下，随后进行等离子体氧处理。2 处理。切勿让悬臂和/或针尖夹 holder 上的水干燥，以避免盐结晶。
  4. 数据分析（适用于 6.x 数据处理软件版本）
    1. 打开数据处理软件并加载数据文件。
    2. 点击 使用此地图进行批量处理 单击按钮，以便在地图的所有曲线上使用相同的分析参数。
    3. 在 加载预设流程，选择 赫兹拟合.
    4. 使用第一个选项卡来验证或更改校准参数。
    5. 在第二个选项卡中，从基线中移除一个偏移量（或一个偏移量加一个倾斜量），使其平均值为 0。
    6. 在第三个标签页中，通过将接触点（POC）位置视为从延伸曲线上设定值下降过程中首次穿过0力的点，来估算其位置。
    7. 标签 垂直尖端位置 通过从测得的高度中减去悬臂偏转来计算探针尖端的移动。在此步骤中，使用 未平滑高度 （原始数据）用于以下拟合，通过勾选相应的复选框。
    8. 在 弹性拟合 选项卡中，选择合适的拟合模型。如果回缩曲线中未观察到或仅观察到微弱的黏附现象（对应于设定点力的10%以下，或在选定压痕深度下的最大平均作用力），则 模型类型 应设置为赫兹-斯内登（Hertz/Sneddon）模型，并使用延伸曲线进行拟合。在黏附力较强的情况下，应优先选用DMT模型（即Derjaguin-Muller-Toporov模型），并对回缩曲线进行拟合（有关可用接触模型及相关公式的详细信息，请参阅仪器手册）。
      1. 根据名义针尖形状设置针尖几何参数。此处， 尖端形状 是球体且 尖端半径 是 400 nm。
      2. 设置 泊松比 至0.5，这在生物材料中是常规做法（对应于不可压缩材料）。
    9. 最多可适配特定压痕深度默认情况下，拟合在整个曲线上进行。如果需要拟合至特定压痕深度，首先勾选 移位曲线 复选框；此操作将根据新确定的基线值和POC值调整曲线的原点。
      1. 添加第二个 弹性拟合 通过点击主窗口上的图标来执行常规操作。
      2. 再次设置所有拟合参数，并指定在 X 分钟 所需的压痕深度。根据需要添加多个步骤（2到3步即可），以优化压痕位置（POC）的确定，进而提高计算所得压痕深度的准确性。此时可保存该过程。
    10. 点击 保留并应用于全部 对地图上的所有曲线重复上述步骤。
    11. 保存结果。将获得一张图像和一个 .tsv 文件。

2. 膨压的测定

注意：展示了经除草醚处理的拟南芥花序分生组织的示例。

  1. 生物样本制备
    1. 按照已发表的方法，从添加极性生长素运输抑制剂1-N-萘基邻苯二甲酸（NPA）的培养基中生长的体外苗上，采集经微管去聚合药物oryzalin处理的拟南芥花序分生组织（IM）6.
    2. 采用以下两种方案之一安装免疫标记样本
      1. 长期监测：将样品置于含有拟南芥茎尖培养基（ACM）的培养皿中培养7,8 以及0.1%植物保存混合物（PPM）以防止污染。将IM尖端悬于ACM表面之上，并用一滴2%琼脂糖支撑IM基部。
      2. 用于快速溶液更换的测量：将样品固定在含有少量粘性胶泥的培养皿中，并用生物相容性胶水迅速密封胶泥与样品基底之间的缝隙。待胶水固化（少于2分钟）后，将样品浸入含有0.1% PPM的液态ACM中。
        注意： 固定样品底座时，确保样品表面未被琼脂糖或胶水覆盖。对膨压进行原子力显微镜（AFM）测量时，需要样品稳定固定，此前的固定方法已可提供可接受的稳定性。根据样品类型，也可采用其他固定方法，如双面胶带、多聚赖氨酸等。
  2. 原子力显微镜校准
    1. 打开原子力显微镜采集软件并选择 PeakForce QNM（大振幅） 测量模式
    2. 按照 2.1 至 2.6 步所述相同原理进行校准。
    3. 在 检查参数 窗口，设置 扫描尺寸 0。在 斜坡 窗口，设置 坡道尺寸 在200 nm和500 nm之间， 触发阈值 2 V 和 5 V 之间 样本数量 至 2048 或更高。
    4. 将悬臂针尖与校准样品对齐，然后单击 方法.
    5. 接触后，前往 斜坡 窗口并点击按钮 连续梯度在线性区间的曲线上，通过点击 更新灵敏度 按钮。重复多次测量偏转灵敏度，并通过打开选项卡手动使用测量平均值更新校准 检测器 从菜单中 校准.
    6. 收回原子力显微镜探头，并取下校准样品。
      注意： 建议通过选择选项卡完全缩回原子力显微镜探头 阶段 → 初始化 以防止更换样品时发生意外的硬性接触。
  3. 力谱实验的设置与数据采集
    1. 如果样本尚未浸没，则用含有PPM的液态ACM将其浸没。
    2. 在采集软件中，按如下方式设置测量参数：
      1. 在 检查参数 窗口，设置 弹簧常数 至悬臂梁的标称弹簧常数或步骤2.8中测定的弹簧常数。本示例中设为42 N/m。
      2. 设置 尖端半径 400 nm
      3. 设置 样品泊松比 至0.5，因为水主要贡献于膨压。
      4. 设置 样本/谱系 至128以确保快速采集。
      5. 设置 扫描速率 至 0.2 Hz。
      6. 设置 扫描尺寸 至 1 µm.
        注意： 减小扫描速率和扫描尺寸可有效防止原子力显微镜扫描过程中引发的样品损伤。每次更换样品时，建议降低这两个参数。
      7. 在 斜坡 窗口，设置 坡道尺寸 到 5 µm.
        注意： 建议将斜坡尺寸设置得大于预期的压痕深度，以获得更佳的基线数据。
      8. 设置 触发阈值 至最大值
      9. 设置 样本数量 至4608。
      10. 可选地，在 显微镜 → 接合参数 标签，为防止因接触导致的样品严重损伤，请降低以下参数。设置 峰值力接触设定值 至 0.3 V（默认 0.5 V）。设置 调节内增益 至 0.5（默认 0.75）。设置 SPM 接合步骤 至 4 µm 默认 15 µm).
    3. 将样品放置并调整至原子力显微镜探头下方，缓慢接近，直至悬臂浸入液体但未与样品表面接触。
      注意： 接近时，轻轻向液态ACM表面吹气，直至悬臂与液面之间形成液桥。这通常可避免发生硬接触。
    4. 小心地手动接近样品。当探针接近样品表面时，点击 方法.
    5. 接触后，逐渐增加 扫描尺寸 和/或 扫描速率 直到达到理想的平衡状态，同时不损坏样品和/或悬臂。
      注意： 扫描尺寸受样品表面曲率和粗糙度的限制。在经秋水仙酰胺处理的IM样本中，50 x 50 µm2 扫描区域可在扫描速率为0.3 Hz时实现。
    6. 扫描过程中，确认测量区域是否符合要求。必要时重新定位。确认无误后，点击按钮 指哪打哪 启动点选窗口。
    7. 在开始扫描记录前，选择一个有助于清晰识别细胞轮廓的合适图像通道。通常，峰值力误差（Peak force error）、DMT 模量（DMT Modulus）、对数DMT模量（LogDMT Modulus）或耗散（Dissipation）是合适的选择。指定保存路径和文件名，然后点击 下一次扫描时开始斜坡上升 开始记录。
      注意： 在您指定的文件名后会自动添加一个点和三位数字（例如 .000）。每次保存扫描重复时，该数字自动递增1。
    8. 扫描完成后，软件界面将自动跳转至 斜坡 窗口。单击扫描图像以指定缩进位置。
      注意： 在记录压痕之前，最好先选择若干标记点，通过点击执行测试性压痕 仅斜坡，如果需要更改参数（对于 斜坡大小，压电位置，等）。压痕深度需大于细胞壁厚度（理想情况下通过透射电子显微镜单独测定）。
    9. 每个细胞选择至少三个靠近其中心的位置进行压痕测试，每个位点重复压痕三次。这样每个细胞可获得至少九条力-曲线用于后续分析。当对压痕位点的分布满意后，点击 斜坡与捕获力-压痕曲线将自动保存至指定目录。
    10. 当斜坡扫描完成后，移动至另一位置进行晶片测量，或收回扫描头并更换样品。
    11. 完成后，按照步骤 1.3.8 和 1.3.9 清洁悬臂。
  4. 数据分析
    1. 在分析软件中打开 *.mca 文件。该文件显示了每条力曲线在扫描图像上的位置。如有需要，可预先选择用于分析的力曲线。
    2. 打开一个待分析的力曲线文件，通常为以下格式 x0000y.00z其中，x 为保存目录中指定的文件名，y 和 z 则为自动记录的编号，分别表示压痕序列号和扫描编号。
    3. 点击 基线校正 按钮并拖动力曲线上的蓝色虚线，直到 延长源基线起点 和 延长源基线停止 分别为 0% 和 80%。点击 执行.
      注意： 或者， 延长源基线停止 可设置为不同的数值，只要仍在基线范围内且未超过接触点即可。
    4. 点击 箱型滤波器 按钮并点击 执行 以平滑力曲线。
    5. 点击 压痕 按钮
      1. 在 输入 窗口，设置 活性曲线 到 延伸.
      2. 设置 拟合方法 至 线性化模型 和 包含黏附力 到 是.
      3. 设置 最大作用力拟合边界 至99%并 最小力配合边界 至75%。
      4. 设置 拟合模型 至 刚度 （线性）
        注意： 该装置将计算表观刚度 k 用于膨压推导。在此示例中，拟合边界反映了一个约 1.5 µm 压痕深度
    6. 力曲线可批量分析。点击 运行历史 按钮，指定报告目录，并添加所有需要相同处理的其他力曲线。确认无误后，单击 运行默认情况下，拟合结果将被保存为 *.txt 文件。
    7. 当 k 是批量拟合，点击 历史 → 5 次缩进 返回到压痕窗口。
      1. 改变 最大作用力拟合边界 至10%并 最小力配合边界 至 0%
      2. 设置 拟合模型 到 赫兹 （球形）。
        注：这将计算细胞壁的杨氏模量 E 用于膨压推导。在此示例中，拟合边界反映的是采用球形探针的赫兹（Hertzian）拟合，范围约为 0.4 µm 压痕深度
    8. 重复步骤 2.4.6，进行批量拟合 E.
    9. 打开 *.00z 文件（z 为自动记录的扫描编号），以显示不同的扫描通道。在 高度 通道窗口，单击 部分 按钮。这将允许测量样品表面曲率，该曲率是推导膨压所必需的。
      1. 沿一个细胞的长轴画一条线，将虚线边界移至细胞边缘，并记录 半径 值 r1重复此步骤以获取短轴的半径 r2. 计算细胞表面的平均曲率 κM 和高斯曲率 κG 使用双半径测量法，具体如下：
        物理学中串联电阻的κM方程；用于电路分析的公式展示。 和 气体电导率方程，公式：kG=1/(r1*r2)，与物理学研究相关。 
    10. 推导膨压 P 使用已发表的薄壳模型9 如下所示：
      静力平衡方程：P=4Et²κᵢ²/3f；复杂数学公式；用于教学。 
      与
      机械系统中静态平衡的数学公式，展示平衡方程。
      其中，t 表示通过电子显微镜等方法测定的细胞壁厚度。
      注意： 膨压的推导是一个需要迭代的拟合过程。通常进行四次迭代即可获得稳定的结果，但也可进行更多次迭代（例如100次）。
    11. 计算平均值 E, k 和 P 每个细胞。同时，记录细胞内变异（如标准差）以供文档备案。

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结果

图1A 和 图1B 展示了实验方案中步骤1.3.4至1.3.6的结果截图，用于确定获取QI图谱的目标区域。值得注意的是，目标区域的选择应避免位于倾斜表面（即尽可能平坦）。实际上，正如Routier等5所指出的，如果压痕轴线不垂直于表面，则测得的杨氏模量可能被低估。这种效应在图1的C或D图右上角区域可见，其中细胞边界的某部分看起来比细胞其余部分更柔软。在分生组织中，这种效应引起的伪影会更加显著，因为在50 × 50 µm2的扫描区域内，局部倾斜角度很容易超过40°。在我们实验室中，目前正在开发一种基于Routier等5所述方法的算法，以校正此类伪影（论文在准备中）。图1C 和 图1...

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讨论

植物形态的形成主要由生长在时间和空间上的协调速率和方向决定。植物细胞被包裹在由多糖基质构成的刚性细胞壁中，该基质将细胞粘合在一起。因此，细胞扩张受到膨压对细胞壁的拉力与细胞壁抵抗该压力的刚度之间平衡的控制。为了理解发育背后的机制，有必要能够测量特定器官的不同组织或细胞中的细胞壁力学特性以及膨压。正如本文所展示的，原子力显微镜（AFM）是此情境下的首选方法。

该实验方案中有若干关键步骤。第一步是组织准备，此步骤应迅速完成以避免组织脱水。如果需要测量膨压，则这一点尤为关键。另一个非常重要的环节是将样品正确固定于基底上：样品不稳定可能导致明显的效应，例如肉眼容易观察到的宏观移动，或力-压痕曲线出现严重变形。此外，样品的振动或弯曲可能较难察觉，但会引入实验 artifacts。最后，另一个关键步骤涉及压痕参数的选择，这对实验结果的质量具有决定性作用。

在测量大范围区域（扫描尺寸超过 40–50 µm）的机械性能时，高度差异可能较大，导致难以准确追踪表面形貌，并在不接近 Z 压电驱动器量程极限的情况下完成力曲线采集。为克服这一问题，已使...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢PLATIM团队提供的技术支持，同时也感谢RDP实验室生物物理团队的Arezki Boudaoud及其成员给予的有益讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
培养基
1,000倍维甲素储备液用于制备ACM，具体成分见Stanislas等，2017。在高压灭菌后、倒平板前加入ACM中。
1-N-萘基邻苯二甲酸（NPA）Sigma-Aldrich/Merck132-66-1加入拟南芥培养基中，终浓度为10 μM。在高压灭菌后、倒平板前加入。
琼脂粉（Agar-agar）Sigma-Aldrich/Merck9002-18-0加入拟南芥培养基中，终浓度为1% w/v。
琼脂糖（Agarose）Merck Millipore9012-36-6用于制备固体ACM，终浓度为0.8% w/v。
Arabidopsis 培养基Duchefa BiochimieDU0742.0025用于拟南芥体外培养，11.82 g/L。
四水合硝酸钙Sigma-Aldrich/Merck13477-34-4加入拟南芥培养基中，终浓度为2 mM。
MURASHIGE & SKOOG 培养基Duchefa BiochimieM0221.0025基础盐混合物，用于制备ACM，2.2 g/L。
N6-苄基腺嘌呤（BAP）Sigma-Aldrich/Merck1214-39-7用于制备ACM，终浓度为555 nM。在高压灭菌后、倒平板前加入ACM中。
寡霉素（Oryzalin）Sigma-Aldrich/Merck19044-88-3用于寡霉素处理，终浓度为10 μg/mL。
植物保存混合液（PPM）Plant Cell Technology用于制备ACM，终浓度为0.1% v/v。在高压灭菌后、倒平板前加入ACM中。
氢氧化钾Duchefa Biochimie1310-58-3用于制备拟南芥培养基和ACM，调节pH至5.8。
蔗糖Duchefa Biochimie57-50-1用于制备ACM，终浓度为1% w/v。
原子力显微镜（AFM）工具
BioScope Catalyst BioAFMBruker本实验方案中用于测定膨压的原子力显微镜。
Nanowizard III + CellHesionJPK (Bruker)用于测定机械性能的原子力显微镜。
PatafixUHUD1620
参考弹性结构NanoIdea2Z00026
Reprorubber-Thin PourFlexbar16135生物相容性胶水。
球形AFM探针NanoandmoreSD-SPHERE-NCH-S-10用于测定机械性能的探针。

参考文献

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