通过对流增强递送将抗体递送至小鼠脑内

摘要

对流增强递送（CED）是一种通过直接灌注大范围脑组织实现治疗药物有效递送至脑内的方法。该操作需要使用导管和优化的注射程序。本方案描述了将抗体通过 CED 递送至小鼠脑内的方法学。

摘要

对流增强递送（CED）是一种神经外科技术，利用导管系统实现大脑大范围区域的有效灌注。该方法通过绕过血脑屏障（BBB），提供了一种安全的给药途径，可用于递送难以穿透血脑屏障的治疗药物，或避免因全身暴露而产生不良反应（例如由于毒性）的药物。CED需要优化导管设计、注射方案以及灌注液的性质。本方案描述了如何将含有最多20 µg抗体的溶液递送至小鼠尾状壳核。内容包括阶梯式导管的制备、体外测试，以及采用梯度递增注射程序在小鼠中实施CED的操作步骤。该方案可轻松调整以适应其他灌注体积，并可用于递送多种示踪剂或药理学活性/非活性物质，包括化疗药物、细胞因子、病毒颗粒和脂质体。

引言

血脑屏障（BBB）形成了一道半透性边界，将中枢神经系统（CNS）与血液循环分隔开来。然而，在多种疾病（如脑肿瘤、阿尔茨海默病（AD）或帕金森病（PD）等）背景下，将治疗药物递送至中枢神经系统是必要的¹。这一点在新疗法的开发中尤为重要，特别是当待测药物表现出较差的血脑屏障通透性，或其全身暴露可能引发严重毒性时^1,2。一些临床使用的抗体就同时具有这些特性。解决这一问题的方法之一是将治疗药物直接递送至血脑屏障后方。

对流增强给药（convection-enhanced delivery, CED）是一种神经外科技术，可实现对大脑较大体积区域的有效灌注。该技术通过在目标区域外科植入一个或多个导管来实现。在药物输注过程中，导管开口处形成压力梯度，从而驱动灌注液在脑组织中的弥散^3,4。因此，灌注范围主要由输注时间决定，而非由扩散系数决定^2,4,5。与传统的基于扩散的脑内注射方法相比，该方法可在更大范围的脑组织中实现更均匀的药物分布^2,6。同时，这种给药方式对组织的损伤风险较低²。因此，CED 可用于安全有效地递送传统化疗药物以治疗中枢神经系统（CNS）肿瘤，也可用于递送免疫调节剂、激动性或拮抗性抗体，适用于多种其他 CNS 疾病的治疗^2,7,8,9。目前，CED 正在帕金森病、阿尔茨海默病以及高级别胶质瘤的治疗中进行临床试验^2,7,8,10,11。

导管设计和注射方案是影响对流增强输送（CED）效果的最重要因素之一^{10,12,13,14,15,16}。此外，输注液需要具备特定的理化性质，包括适中的颗粒大小、阴离子电荷以及低组织亲和力^10,17。这些参数中的每一项都可能需要根据靶向脑区的组织学特征进行相应调整^2,10,17。

本文描述了将抗体溶液对小鼠尾状壳核（纹状体）进行对流增强输送（CED）的方法学。此外，该方案还包括在实验室条件下制备阶梯式导管、体外测试导管性能以及实施CED操作的完整流程。

文献中存在多种导管设计，其差异体现在套管的形状、所用材料以及导管开口数量上^{12,15,18,19,20,21,22}。我们使用一种阶梯式导管，其由一段熔融石英毛细管构成，该毛细管从钝端金属针头中突出1 mm。这种导管设计可在研究实验室中方便地制备，并且在体外测试中，当使用物理参数类似于体内脑实质的琼脂糖块进行评估时，能够稳定地获得良好的对流增强输送（CED）结果²³。

此外，我们采用梯度递增给药方案，在体内输注5 µL灌注液。在此方案中，注射速率从0.2 µL/min逐步增加至最高0.8 µL/min，从而最大限度地减少灌注液沿导管反流的可能性以及组织损伤的风险¹⁶。采用该方案，我们已成功在11分30秒内将最多20 µg抗体溶于5 µL PBS中给予小鼠。

该方案可轻松调整以适用于其他输注体积或注射多种不同物质，例如化疗药物、细胞因子、病毒颗粒或脂质体^{2,10,14,18,22}。若所用输注液的理化性质与磷酸盐缓冲盐水（PBS）或人工脑脊液（aCSF）中的抗体溶液存在显著差异，建议增加额外的验证步骤。在导管组装、验证及对流增强输送（CED）过程中，我们所描述的所有步骤均使用安装在常规立体定位仪框架上的带有钻孔和注射单元的立体定位机器人。该操作也可通过连接可编程微量输注泵的手动立体定位仪完成，该泵可驱动文中所述的玻璃微量注射器。

方案

本文所述所有方法均已获得瑞士州立兽医办公室的批准，许可证编号为 ZH246/15。

1. 阶梯导管的制备

1. 制备用于导管步骤的熔融石英管
   1. 将内径为0.1 mm、壁厚为0.0325 mm的熔融石英毛细管切割成30 mm长。
   2. 检查毛细管是否有裂纹，并使用显微拉针仪对管端进行热抛光，以确保毛细管开口表面光滑。
2. 金属针内管的固定
   1. 在10 μL上安装一个27 G针头 注射器并将其放入立体定位机器人中。
   2. 使用机器人将注射器移至硬质表面，并用针尖接触该表面。该位置应在软件中记录或保存，因为其将作为设定导管步长的参考平面。
   3. 将针头抬起，以便将熔融石英毛细管置入针头内部
   4. 将熔融石英毛细管插入针头，使毛细管从针头端伸出20 mm。
   5. 使用移液器将2 μL高黏度氰基丙烯酸酯粘合剂均匀涂抹在毛细管上，从金属针端开始，至毛细管下端上方10 mm处结束，如图所示 图2.
   6. 使用立体定位机器人，将针头缓慢下降，直至金属针尖位于参考平面之上1 mm处。这样，熔融石英毛细管将被固定在金属针管内，并从金属针尖端形成1 mm的台阶。清除金属针末端多余的胶水，以避免台阶变钝。 
   7. 等待15分钟使胶水凝固，然后将带有导管的注射器从立体定位机器人上取下。 在显微镜下检查导管尖端，确认在该步骤中所有多余的胶水已被清除。
3. 使用琼脂糖块测试阶梯导管
   1. 在常规凝胶托盘中配制0.6%的琼脂糖PBS溶液，待其聚合。将琼脂糖切成约20 mm × 20 mm的块状。使用前将琼脂糖块浸没于PBS中保存。
   2. 手动将10 μL过滤后的0.4%台盼蓝溶液注入步进导管注射器中。
   3. 使用立体定位机器人，以0.2 μL/min的速度注入1 μL液体，以评估导管固定过程中阶梯部位的密封性。台盼蓝溶液应仅出现在导管尖端。用纸巾将其擦去。
   4. 将琼脂糖块放入立体定位机器人中，并校准机器人，使导管尖端相对于琼脂糖块表面进行定位参考。
   5. 设定CED的注射参数。
      1. 对于5 µL的注射体积，采用以下步骤：以0.2 µL/min注射1 µL，然后以0.5 µL/min注射2 µL，再以0.8 µL/min注射2 µL。根据具体实验方案，通过按比例调整各步骤的持续时间，相应调节最终注射体积。
      2. 为将溶液注入小鼠尾状壳核（纹状体），应在前囟前方1 mm、外侧1.5–2 mm处，以3.5 mm深度进行注射。
      3. 注射后，将导管留置2分钟，然后以1 mm/min的速度缓慢撤出，以确保液体在脑内充分扩散，并在拔出导管过程中封闭注射通路。
         注意： 根据所使用的特定立体定向机器人，所有参数均可编程到单个脚本中。示例脚本可作为 补充材料。.
   6. 开始CED程序，将5 μL的台盼蓝溶液注入琼脂糖块中。
   7. 评估台盼蓝在琼脂糖中的弥散形态以及沿导管路径是否存在泄漏。台盼蓝应形成一个椭球形或圆形的弥散区域，中心位于导管尖端周围，直径至少为1 mm。金属针尖端上方不应有明显的反流现象。
   8. 放置一块新的琼脂糖凝胶，以0.2 µL/min的速度注入1 µL，以评估导管是否被琼脂糖堵塞。注射开始后，台盼蓝应立即从导管尖端形成云雾状扩散。
   9. 评估注射器中剩余体积是否为 3 µL。任何差异可能表明导管连接处或注射器活塞存在液体泄漏。
   10. 如果所有测试注射均成功，导管密封良好、无弯曲，且除导管尖端外无其他部位出现台盼蓝溶液，则用去离子水冲洗导管₂O (dH₂O）直至无法观察到台盼蓝残留，随后按以下步骤清洗十次：70% 乙醇和 100% 乙醇，再用 70% 乙醇和去离子水冲洗。
   11. 在干燥条件下保存导管。

2. 抗体溶液在小鼠脑内的对流增强递送

注意：根据当地动物福利法规，可在此操作中使用多种类型的麻醉剂、镇痛剂和抗生素。本方案描述了注射麻醉的使用方法。也可通过在立体定位仪上安装鼻罩来使用吸入式麻醉剂，如异氟烷。此外，我们建议将抗生素加入饮水中以预防感染。

1. 手术准备
   1. 准备麻醉剂和解毒剂溶液。可使用包含芬太尼（0.05 mg/kg）、咪达唑仑（5 mg/kg）和美托咪啶（0.5 mg/kg）的三组分麻醉剂，用无菌dH₂O稀释后对小鼠进行安全麻醉。我们采用两步苏醒程序，使用两种解毒剂溶液：第一种包含氟马西尼（0.5 mg/kg）和丁丙诺啡（0.1 mg/kg），溶于无菌dH₂O中（第一种解毒剂溶液）；第二种包含阿替美唑（2.5 mg/kg），溶于无菌dH₂O中（第二种解毒剂溶液）。
   2. 准备含有卡洛芬（5.667 mg/kg）的镇痛溶液，并用无菌dH₂O稀释。
   3. 清洁立体定位架、加热垫以及立体定位机器人各部件。请注意，并非机器人的所有部件均可清洁而不造成损坏。有关清洁和使用前准备的详细信息，请参阅机器人使用手册。
   4. 将步进导管与注射器组装，并用dH₂O、70%乙醇和100%乙醇多次冲洗，随后再用70%乙醇和dH₂O冲洗。最后用PBS或其他缓冲液（如人工脑脊液）冲洗注射器，以用于制备颅内注射溶液。在整个操作过程中，注射器的推杆应能顺畅自由地移动。
   5. 使用立体定位架对立体定位机器人软件进行校准。
   6. 通过确认机器人臂可自由移动、注射泵已正确连接且能够无干扰地执行CED程序，来测试立体定位机器人软件。测试内容包括机器人运动、梯度注射、2分钟等待步骤以及导管回撤速度。所有参数应符合第1.3.5点中预设的CED程序。
   7. 将钻头装入钻机中。建议在使用前对钻头进行灭菌处理。
   8. 使用PBS或其他缓冲液（如aCSF）配制抗体溶液。单次CED程序可注射5 µL中含有1至20 µg抗体的溶液。其他体积和蛋白量应在实验前进行测试。请注意，使用高黏度溶液可能导致导管堵塞。
   9. 手动将稀释后的抗体装入注射器中。
2. 通过CED向纹状体注射抗体
   1. 称量小鼠体重，并根据体重将三组分麻醉剂溶液腹腔注射。记录注射时间。将小鼠转移至配有加热垫的独立笼具中。
   2. 观察小鼠，判断镇静开始时间。一旦小鼠停止活动，立即在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止手术期间角膜干燥。完全镇静通常在注射三组分麻醉剂后10–15分钟开始。
   3. 通过夹趾反射测试检查疼痛反应，以确认动物已完全麻醉。
   4. 使用毛发修剪器剃除头部毛发。
   5. 用浸有碘溶液的棉签对皮肤进行消毒。 以环形方式擦拭皮肤三次。
   6. 使用手术刀沿颅骨中线做10 mm长的皮肤切口，切口终点位于眼睛水平位置。
   7. 使用鼻夹和耳杆将小鼠固定在立体定位架上。确保颅骨表面水平并牢固固定。这不仅对准确的解剖定位至关重要，也有助于避免在钻孔和CED过程中颅骨倾斜。
   8. 将注射器安装至立体定位机器人上。
   9. 在参考点处使钻头与导管尖端对齐。必须在软件中精确确定钻头与注射器之间的相对位置，以确保注射可在脑部目标解剖区域进行。
   10. 使用镊子牵拉皮肤，定位颅骨表面的前囟点（bregma）。
   11. 使用钻头尖端在软件中对前囟点进行参考定位。
   12. 将钻头移至前囟点前方1 mm、侧方2 mm处，钻出骨孔。注意不要损伤硬脑膜。
   13. 将注射器移至骨孔上方。
   14. 从注射器中推出0.5–1 μL液体，以确保导管内无气泡残留。
   15. 启动第1.3.5点所述的CED程序。观察颅骨表面是否有液体从注射部位反流的迹象，并监测动物的呼吸频率。
   16. CED程序结束后，导管从脑组织中撤出，此时启动注射泵，流速设为0.2 µL/min，以检查CED过程中是否发生导管堵塞。若未发生堵塞，应立即可见注射混合液从导管尖端滴出。
   17. 在重新使用或储存导管前，应在显微镜下目视检查导管步进部分是否有任何损伤或磨损迹象，并按第1.3.10步进行清洁。
3. 苏醒程序
   1. 轻柔地将小鼠从立体定位架上取下。
   2. 用无菌生理盐水清洗手术部位。
   3. 使用镊子将骨蜡填入骨孔中。
   4. 用细头镊子闭合皮肤，并用10 µL移液器在切口处涂抹外科胶水。等待15–30秒使胶水聚合。
   5. 皮下注射镇痛溶液。记录注射时间。
   6. 注射第一种解毒剂溶液。记录注射时间。
   7. 将小鼠转移至配有加热垫的独立笼具中，并监测其惊跳反射。
   8. 若在注射第一种解毒剂15分钟后小鼠仍未完全恢复意识，则通过皮下注射给予第二种解毒剂溶液。
   9. 在恢复期间持续监测动物状态。
   10. 术后1–2小时及次日检查是否有术后并发症。如有需要，可再次给予镇痛剂。
   11. 为预防感染，术后1周内向饮用水中添加磺胺多辛（终浓度0.08% w/v）和甲氧苄啶（终浓度0.016% w/v），供动物自由饮用。

结果

该方案可实现阶梯导管的制备（图1) 用于实验室环境中 CED 手术操作。为控制导管可能出现的渗漏、沿针道反流及堵塞情况，我们建议将染料（如台盼蓝溶液）注入琼脂糖块中进行注射测试。 图3 显示注射后形成一团台盼蓝云雾状扩散 1 µL 在 0.5 µL/minu使用CED导管进行灌注（图 3A）。在导管步骤的起始阶段，针道内未见反流。此外，弥散的云雾状影像呈现出理想的球形形态。这与使用常规27 G钝端针所获得的结果形成对比。图3B)，可观察到明显的回流现象。

此外，CED 需要优化的注射程序。图4展示了使用本方案中所述的梯度递增程序将 2 µL 台盼蓝注入琼脂糖块（A）与以恒定速率 2 µL/分钟注射（B）的结果对比。即使使用 CED 导管，较高的注射速度也会迫使回流沿导管发生。

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讨论

对流增强递送（convection-enhanced delivery，即通过压力介导将药物输注到脑内）最早于20世纪90年代初被提出³。该方法有望在血脑屏障后以可控方式灌注大范围脑区²。然而，迄今为止，采用该方法的临床试验仍较少，部分原因是临床环境下的对流增强递送技术操作难度较高^24,25。近年来导管设计和输注程序的进步似乎已克服了这些技术难题^8,19。治疗性抗体在临床上的应用进展，包括免疫调节性检查点阻断剂的出现，亟待应用于中枢神经系统疾病治疗¹⁰。这一发展可通过在实验中采用对流增强递送技术（例如在小型啮齿类动物模型中）而得到显著推动。

小鼠中已有多种中枢神经系统疾病模型。这些模型包括用于多发性硬化症（M...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 μL 注射器	Hamilton	7635-01
27 G 钝头针	Hamilton	7762-01
琼脂糖	Promega	V3121
阿替美唑	Janssen
骨蜡	Braun	1029754
丁丙诺啡	Indivior Schweiz AG
卡洛芬	Pfizer AG
牙科钻头，钢制，ISO 009 规格	Hager & Meisinger	1RF009
乙醇 100%	Reuss-Chemie AG	179-VL03K-/1
芬太尼	Helvepharm AG
异硫氰酸荧光素标记葡聚糖，2000 kDa	Sigma Aldrich	FD2000S
氟马西尼	Labatec Pharma AG
甲醛	Sigma Aldrich	F8775-500ML
高黏度氰基丙烯酸酯胶水	Migros
碘溶液	Mundipharma
美托咪啶	Orion Pharma AG
微电极拉制仪	Narishige	MF-900
咪达唑仑	Roche Pharma AG
眼用软膏	Bausch + Lomb	Vitamin A Blache
PBS	ThermoFischer Scientific	10010023
与 Alexa Fluor 647 偶联的多克隆山羊抗大鼠 IgG (H+L) 抗体	Jackson Immuno
手术刀	Braun	BB518
石英毛细管，内径 0.1 mm，壁厚 0.0325 mm	Postnova	Z-FSS-100165
小鼠立体定位仪	Stoelting	51615
立体定位机器人	Neurostar	Drill and Injection Robot
蔗糖	Sigma Aldrich	S0389-500G
外用组织粘合剂	Zoetis	GLUture
台盼蓝	ThermoFischer Scientific	15250061
水	Bichsel	1000004