循环肿瘤细胞的显微操作用于下游分子分析及转移潜能评估

摘要

本文介绍了一种整合性工作流程，用于鉴定循环肿瘤细胞（CTCs）的表型和分子特征。我们将活细胞免疫染色与单个及成簇CTCs的机器人显微操作相结合，并利用基于单细胞的技术进行后续分析，评估其定植转移的能力。

摘要

血源性转移是导致 大多数癌症相关死亡与循环肿瘤细胞（CTCs）在远端部位成功形成新肿瘤有关。CTCs在患者血液中以单个细胞（单个CTCs）或多种细胞聚集物（CTC簇及CTC-白细胞簇）的形式存在，其中后者具有更强的转移能力。除计数外，对CTCs进行表型和分子分析对于解析其生物学特性并识别可靶向的脆弱环节至关重要。本文详细描述了一种包含CTC免疫染色与显微操作的工作流程， 离体 培养以评估 单个细胞的增殖与存活能力，以及 体内 转移形成实验。此外，我们提供了一种将循环肿瘤细胞（CTC）簇解离为单个细胞并研究簇内异质性的实验方案。通过这些方法，例如，我们可精确量化单个CTC以及CTC簇内单个细胞的存活能力和增殖潜能，从而观察到簇内细胞在存活和增殖方面表现更优 离体 与单个CTC相比，CTC细胞团具有更强的特性。总体而言，我们的工作流程提供了一个在单细胞水平上解析CTC特征的平台，旨在识别与转移相关的通路，并更深入地理解CTC生物学。

引言

远处器官转移的临床表现为癌症进展的最终阶段，导致超过90%的癌症相关死亡¹。 从局部肿瘤发展为转移性疾病是一个多步骤过程，通常由循环肿瘤细胞（CTC）介导^2,3,4。这些细胞从原发性肿瘤脱落进入血液循环，并被运输至远处器官，在那里可能穿出血管并形成转移病灶^5,6。尽管实体瘤可释放相对大量的CTC，但大多数CTC注定会死亡，原因包括循环中的高剪切力、失巢凋亡介导的细胞死亡、免疫攻击，或适应异源微环境的能力有限⁷。因此，建立能够解析具有转移播种能力的CTC分子特征的工具至关重要。近期的临床前和临床研究表明，单个CTC及CTC簇的存在和数量与多种实体瘤患者的不良预后相关^{8,9,10,11,12....}

方案

所有涉及患者血液样本的操作均在获得参与者签署的知情同意书后进行。操作按照伦理与机构审查委员会（瑞士西北/中部伦理委员会[EKNZ]）批准的方案EKNZ BASEC 2016-00067和EK 321/10执行，并符合《赫尔辛基宣言》的要求。

所有涉及动物的实验操作均遵循机构及州级指导原则（已批准的小鼠实验方案编号 #2781，巴塞尔城市州动物卫生办公室）。

1. 患者样本制备

1. 开始前，确保使用无菌溶液和材料，以在整个操作过程中维持无菌状态。
2. 从乳腺癌患者体内抽取7.5 mL外周血，注入10 mL EDTA采血管中。
3. 将含有血液的采血管在室温（RT）下置于摇床中，以每分钟40次振荡（osc/min）的频率短暂孵育（不超过1小时）。
4. 采用选定的CTC分离方法富集单个CTC及CTC细胞簇^21,22,23,25，并将CTC释放至1×DPBS溶液中。
   注意：根据所选CTC富集技术的不同，样本中可能残留白细胞和红细胞 。应调整释放压力，以保持CTC细胞簇的结构完整性。

结果

本方案可实现循环肿瘤细胞（CTC）的单个分离，既可从单个CTC中分离，也可从CTC细胞簇中分离。来自患者或荷瘤小鼠的CTC可通过现有的CTC富集方法从全血中富集，随后使用针对癌症相关标志物（如EpCAM，绿色）和白细胞特异性标志物（如CD45，红色）的抗体进行染色（图1A）。染色后的CTC样本随后转移至显微操作工作站，对单个细胞进行挑选，将其沉积到PCR管或多孔板中，并进行后续分析，包括单细胞测序、体外培养或体内实验（图1B）。

该方法的可靠性取决于手动挑选细胞时对靶细胞的准确识别。使用抗EpCAM抗体对细胞悬液进行活细胞免疫染色，可使癌细胞可视化，从而与CD45阳性事件（最可能为白细胞）实现精确区分（图2A）。当CellCelector经.......

讨论

对循环肿瘤细胞（CTCs）进行分子表征有望加深我们对转移过程的理解，并指导新型抗转移疗法的开发。本文详细描述了可用于CTC显微操作及后续分析的实验方案，包括基于单细胞的功能检测、基因表达分析以及用于评估转移潜能的体内移植实验²⁰。

在本实验方案的诸多关键步骤中，对循环肿瘤细胞（CTC）富集产物进行显微操作旨在从相对异质的细胞悬液中获得单细胞分辨率，从而实现最高水平的纯度，并提升后续功能或分子分析的质量。例如，单个CTC的挑取已使我们及他人能够从分子层面以及转移起始能力评估的角度，研究CTC的异质性（如单个CTC、CTC细胞簇以及CTC-白细胞簇之间的差异）。尽管我们通常更倾向于采用允许实验人员手动分离CTC的细胞挑取方案（即根据各个目标细胞的特性提供更高灵活性），但目前已有自动化解决方案可用于辅助细胞挑取，并在受控良好的实验中加速CTC的分离过程。

在循环肿瘤细胞（CTC）分析背景下进行单细胞显微操作时，时间是一个极为关键的限制因素。由于本方案旨在对活细胞进行操.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗人 EpCAM-AF488	Cell Signaling Technology	CST5198	克隆：VU1D9
1X DPBS	Invitrogen	14190169	无钙，无镁
6 孔超低吸附培养板	Corning	3471
抗人 CD45-BV605	Biolegend	304041	克隆：HI30
抗人 EGFR-FITC	GeneTex	GTX11400	克隆：ICR10
抗人 HER2-AF488	Biolegend	324410	克隆：24D2
抗小鼠 CD45-BV605	Biolegend	103139	克隆：30-F11
BD Vacutainer K2EDTA	BD	366643	用于人血液采集
Cell Celector	ALS	CC1001	核心单元
CellD 软件	ALS		版本 3.0
Cultrex PathClear 低生长因子 BME，2 型	R&D Systems	3533-005-02
1.3 mL K3EDTA 微量离心管	Sarstedt	41.3395.005	用于小鼠血液采集
PCR 管	Corning	PCR-02-L-C
RLT Plus	Quiagen	1053393
SUPERase  In RNase 抑制剂	Thermo Fisher	AM2696	1 U/µL