用于转化性肿瘤免疫学（I-O）研究的人源外周血单个核细胞（PBMC）移植人源化异种移植模型

摘要

我们描述了一种基于人外周血单个核细胞（PBMC）的人源化异种移植小鼠模型，用于转化性肿瘤免疫学研究。该方案可作为建立和表征类似模型以评估免疫肿瘤学疗法的通用指南。

摘要

近年来，免疫肿瘤学（I-O）疗法的发现与发展代表了癌症治疗领域的一个里程碑。然而，治疗方面仍面临诸多挑战。稳健且与疾病相关的动物模型是持续开展临床前研究与开发的重要资源，有助于应对一系列额外的免疫检查点。本文中，我们描述了一种基于人外周血单个核细胞（PBMC）的人源化异种移植模型。百济神州研发的处于临床后期阶段的人源化抗PD-1抗体BGB-A317（替雷利珠单抗）被用作实例，以阐述该平台的建立、模型特征分析以及药物疗效评估。这些人源化小鼠能够支持大多数测试的人源肿瘤的生长，从而可在人类免疫系统与人类肿瘤并存的背景下评估I-O疗法。该模型一旦建立，具有相对节省时间和成本的优势，且通常可获得高度可重复的结果。我们建议，本文所述方案可作为建立人PBMC与肿瘤重建小鼠模型用于I-O研究的通用指南。

引言

免疫肿瘤学（I-O）是癌症治疗领域中迅速发展的学科。近年来，研究人员开始认识到通过调节免疫系统功能来攻击肿瘤的治疗潜力。免疫检查点阻断疗法在多种癌症类型中已展现出令人鼓舞的疗效，包括黑色素瘤、肾细胞癌、头颈部癌、肺癌、膀胱癌和前列腺癌^1,2。与直接杀伤 癌细胞的靶向治疗不同，I-O 疗法通过增强机体免疫系统来攻击肿瘤³。

迄今为止，已建立了多种相关的免疫肿瘤学动物模型。这些模型包括：1）同源小鼠体内的小鼠肿瘤细胞系或肿瘤同种移植；2）由基因工程小鼠（GEM）或致癌物诱导产生的自发性肿瘤；3）在具有功能性小鼠免疫系统的背景下，敲入人类药物靶点的嵌合型基因工程小鼠；以及4）重建人类免疫系统并移植了人类癌细胞或患者来源的异种移植瘤（PDX）的小鼠。上述每种模型均具有明显的优点和局限性，相关内容已在其他文献中被广泛描述和综述⁴。

人源化免疫缺陷小鼠模型在转化性免疫-肿瘤学（I-O）研究中日益被视为具有临床相关性的方法。该模型通常通过以下两种方式建立：1）移植成人免疫细胞（例如外周血单个核细胞（PMBC））^5,6，或 2）移植造血干细胞（HSC），例如来自脐带血或胎儿肝脏的HSC^7,8。这些人源化小鼠能够支持人类肿瘤的生长，从而可在人类免疫系统与人类肿瘤并存的背景下评估I-O疗法的效果。尽管具有诸多优势，但人源化小鼠在I-O研究中的应用通常受到若干因素的限制，例如模型构建周期较长以及成本较高。

本文介绍了一种基于人外周血单个核细胞（PBMC）的模型，该模型可广泛应用于转化性免疫肿瘤学（I-O）研究。该模型在疗效研究中具有较高的可重复性，且相对节省时间和成本。本实验室已将其用于评估多种正处于临床前和临床开发阶段的免疫肿瘤治疗药物。百济神州研发的人源化抗PD-1抗体BGB-A317（替雷利珠单抗）⁹ 作为实例，用于阐述该模型的建立、表征及其在抗肿瘤疗效分析中的潜在应用。

方案

涉及人类受试者的研究中进行的所有操作均符合百济神州的伦理标准和/或国家研究委员会的伦理要求，以及1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版或同等伦理标准。研究中所有个体参与者均签署知情同意书。涉及动物的研究中进行的所有操作均经百济神州内部审查委员会批准。本方案已针对人源化NOD/SCID小鼠中BGB-A317（替雷利珠单抗）的评估进行了专门调整。

1. 建立基于人外周血单个核细胞的模型

1. 使用环磷酰胺对NOD/SCID小鼠进行骨髓消融：最佳剂量的确定
   1. 购买6-8周龄的雌性NOD/SCID小鼠。
      注意： 本研究中使用的所有小鼠均为雌性。
   2. 用生理盐水配制不同剂量（50、100 和 150 mg/kg）的环磷酰胺（CP）。用含 0.8% 吐温-80 的生理盐水配制双硫仑（DS），浓度为 125 mg/kg。
      注意：配制不同浓度的环磷酰胺（CP），以便对接受不同剂量CP的小鼠给予相同体积的药物溶液。
   3. 每天一次，连续两天，对动物进行环磷酰胺（i.p.）和丹参（p.o.）处理。每次给予环磷酰胺后2小时，给予丹参（p.o.）。
      注意：  DS 可降低 CP 在小鼠中的泌尿系统毒性，且已有建议指出，CP 与 DS 联用相比单独使用 CP 会导致更持久的中性粒细胞减少症¹⁰ CP的给药方案可能需要在实际研究之前预先确定，并且发现在不同的免疫缺陷型小鼠品系之间存在轻微差异。
   4. 在第0天（给药前1小时）从眶静脉窦采集血样，并立即转移至预置有EDTA-K抗凝剂的试管中，置于冰上^st 剂量），第2天（给药后24小时）^nd 剂量）以及第4天（第二次给药后72小时）^nd 剂量
   5. 通过FACS检测CP和DS处理后的骨髓消融效果。使用大鼠抗小鼠CD11b（M1/70）、大鼠抗小鼠Ly6C（HK1.4）和大鼠抗小鼠Ly6G（1A8）  用于CD11b的设门⁺ Ly6G^高 中性粒细胞，CD11b⁺Ly6C^高 作为单核细胞^11,12.
   6. 每天记录小鼠的体重和健康状况，持续一周。环磷酰胺（CP）和葡聚糖硫酸钠（DS）的最佳剂量确定为在不引起小鼠严重毒性的情况下，导致中性粒细胞和单核细胞最大程度耗竭的给药方案。
2. 人源PBMC移植与肿瘤移植：模型建立
   1. 根据制造商说明书，通过密度梯度离心法从健康供体分离人外周血单个核细胞（PBMCs）。
   2. 按照步骤1.1.2和1.1.3所述，用CP和DS对小鼠进行预处理，以提高移植效率。
   3. 在第二次给予CP和DS后20至24小时，注射人肿瘤细胞系，如A431细胞（ATCC，2.5 × 10⁶) 和 5 × 10⁶ 分离的PBMCs（混悬于含50% Matrigel的200 μL磷酸盐缓冲液（PBS）中），或肿瘤组织碎片（3 × 3 × 3 mm）³，总体积为200 μL PBS（含50% Matrigel）中，并加入200 μL的5 × 10⁶ 将PBMCs（每侧100 μL，接种于移植瘤组织碎片的左右两侧）皮下注射至动物右侧 flank 部位。
   4. 每周测量原发肿瘤体积两次，并记录，持续4-6周。
      注意： 当小鼠体重减轻超过20%或肿瘤体积达到2,000 mm³时，将实施安乐死。³ 或肿瘤已发生溃疡。
   5. 在二氧化碳气体麻醉箱中处死小鼠。使用眼科剪从处死的小鼠中完整取出肿瘤组织，用于组织学和免疫组化（IHC）分析。检测这些组织中人源 CD8、PD-1 和 PD-L1 的表达情况。参见实验方案第 4 步。

2. PBMC 供体筛选

1. 由于从不同个体采集的外周血单个核细胞（PBMC）存在预期差异，需对一组PBMC供体进行筛选。根据步骤1.2所述方案，将A431细胞与来自不同供体的PBMC共同注射。
   注意：本研究中筛选了50多名健康PBMC供体，以获得足够数量的合适供体。计划采用本方案的研究人员可根据自身实验设计自行决定所需筛选的健康PBMC供体数量。
2. 每周两次使用游标卡尺测量肿瘤体积，监测肿瘤生长情况。
   注意：肿瘤生长速率可能因不同供体来源的PBMC而有所差异。
3. 当肿瘤组织平均体积达到200–500 mm³时，收集肿瘤组织，并进行组织学和免疫组织化学（IHC）分析。检测人源CD8、PD-1和PD-L1的表达情况。详细实验方案见步骤4。
4. 选择能够引起中等程度肿瘤生长（接种后14天肿瘤体积>200 mm³）且PD-1、PD-L1和CD8表达相对较高（IHC平均评分>2）的PBMC供体。IHC评分的详细方案见步骤4。

3. 人类癌细胞系和PDX筛选

1. 根据步骤1.2中所述的程序筛选细胞系和PDX模型，以评估肿瘤生长率、肿瘤的人源PD-L1表达以及免疫细胞浸润情况。
   注意： 作者已筛选了30多种人类癌细胞系以及20多种不同类型癌症的PDX模型。所选肿瘤模型的数据见结果部分。

4. 免疫组织化学（IHC）

1. 按照步骤1.2.5所示收获，并将肿瘤组织浸入福尔马林中固定。将固定后的组织脱水并包埋于石蜡中。将固定组织切成3 μm切片，置于多聚赖氨酸包被的载玻片上。
2. 用二甲苯脱蜡三次，每次 7 分钟。通过梯度乙醇水化切片：100% 乙醇两次，每次 3 分钟，随后依次为 90%、80% 和 70% 乙醇，每次 3 分钟。用去离子水冲洗₂O三次，并从载玻片上除去多余液体。
3. 将切片放入容器中，加入10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）或Tris-EDTA缓冲液（pH 9.0）覆盖。将容器置于微波炉中加热3分钟。随后在95 °C水浴中煮沸30分钟，然后冷却至室温。用去离子水冲洗₂O三次，并从载玻片上吸除多余液体。
4. 用含3%牛血清白蛋白的PBS溶液封闭切片，孵育1小时，并使用0.3% H₂O₂ 在PBS溶液中孵育10分钟。4 °C下过夜孵育抗人CD8（EP334）、PD-1（NAT105）和PD-L1（E1L3N）抗体，随后加入HRP偶联的2^nd 室温下孵育抗体1小时。将DAB（3,3'-二氨基联苯胺）底物滴加至切片上，通过显微镜观察棕色显色情况，控制反应时间（数秒至数分钟）。
5. 将载玻片依次浸入0.5%盐酸酒精和0.5%氨水各5秒，然后依次浸入80%、90%和100%乙醇中各3分钟，最后用三次更换的二甲苯中各浸泡5分钟，取出后用中性树胶封片。在显微镜下观察DAB产生的棕褐色信号以检测抗体。
   注意： 通过在高倍物镜（20x，40x）下对肿瘤浸润性白细胞（TIL）中人CD8和PD-1的表达进行5分制免疫组化评分（IHC评分，范围0–4）进行评估。0分：无表达；1分：弱强度/少于20%细胞；2分：弱至中等强度/20%–50%细胞；3分：中等至强强度/50%–80%细胞；4分：强强度/超过80%细胞。肿瘤细胞内人PD-L1染色采用经调整的5分制评分系统（IHC评分，范围0–4），因其信号相对弥散。0分：无表达；1分：弱强度/少于10%细胞；2分：弱至中等强度/10%–30%细胞；3分：中等强度/30%–50%细胞；4分：强强度/超过50%细胞。

5. 人源化PBMC-NOD/SCID异种移植模型中的体内药效学和药代动力学研究

1. 按照步骤1.1.3的指示对NOD/SCID小鼠进行预处理。简言之，每天一次腹腔注射（i.p.）100 mg/kg的CP，并口服（p.o.）125 mg/kg的DS，连续给药2天。
2. 第二次给药后20至24小时，在动物右前 flank 皮下（s.c.）注射指定数量的人源癌细胞和2.5–5 × 10⁶个PBMCs（总体积为200 μL，含50% Matrigel的细胞混合物）。
   注意：在单次研究中，每只小鼠所使用的PBMC数量应保持一致。然而，由于每次实验时分离获得的总PBMC数量存在差异，作者在不同研究中分别采用了2.5 × 10⁶、4 × 10⁶或5 × 10⁶个PBMC。尽管所给予的PBMC数量存在2倍差异，可能影响人源化程度，但作者在评估测试免疫疗法的抗肿瘤疗效时未观察到显著差异。
3. 对于PDX模型的移植，将肿瘤组织碎片（3 × 3 × 3 mm³）皮下注射至动物右前 flank。在移植肿瘤碎片的左右两侧，分别皮下注射100 μL的PBMC悬液（共200 μL，含5 × 10⁶个PBMC，每侧100 μL）。
   注意：PDX肿瘤组织使用Matrigel溶液进行移植，方法与细胞系模型所述相同。
4. 在细胞接种当天，将动物随机分组，并按照预定的研究方案进行处理。 在不同肿瘤模型中，评估候选药物（本例为BGB-A317，腹腔注射，每周一次）在指定剂量下的抗肿瘤活性。
   注意：三种人源癌细胞系（即A431（表皮样癌）、SKOV3（卵巢癌）和SK-MES-1（肺癌）），以及两个PDX模型（即BCLU-054（肺癌）和BCCO-028（结肠癌）），均被认为是该人源化小鼠模型中用于免疫-肿瘤（I-O）疗法评估的良好肿瘤模型。
5. 使用游标卡尺每周测量两次原位肿瘤体积。
   注意：在本研究中，PBMC移植后约4–6周可观察到体重下降现象，因此允许有1–2个月的时间窗口用于治疗效果评估。
6. 为进行肿瘤浸润免疫细胞的药效动力学分析，将肿瘤组织切成小块，加入I型胶原酶（1 mg/mL）和DNase I（100 μg/mL），在含5%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基中37 °C消化30分钟。将消化后的组织通过40 μm细胞筛网，获得单细胞悬液。
7. 用冰浴FACS缓冲液（PBS，含1% FBS）洗涤细胞，并将细胞浓度调整为1 × 10⁷个细胞/mL，置于96孔圆底板中。通过离心洗涤细胞后，加入20 μg/mL人IgG，4 °C封闭30分钟，随后在4 °C下用抗人CD3（HIT3a）、CD8（OKT8）和PD-1（MIH4）抗体孵育染色30分钟。然后将染色后的样本进行流式细胞术检测，并使用guavaSoft 3.1.1软件进行分析。 

结果

按照本文所述步骤，成功建立了基于外周血单个核细胞（PBMC）的人源化异种移植模型。简言之，通过流式细胞术分析环磷酰胺（CP）和白消安（DS）处理后NOD/SCID小鼠中性粒细胞和单核细胞群体的变化，评估CP的骨髓清除效果（图1）。确定100 mg/kg CP联合125 mg/kg DS为最佳剂量，后续研究均采用该方案，因其可最大程度地耗竭中性粒细胞和单核细胞，同时不引起小鼠严重毒性反应。随后，进行人PBMC移植及肿瘤移植。通过免疫组化（IHC）证实了肿瘤微环境中存在人源免疫细胞浸润（图2）。

通过体内筛选一组PBMC供体，以确保肿瘤微环境中具有相对较高的免疫细胞浸润水平以及可接受的肿瘤生长速率（第2节，图3A）。同时，筛选了30多种人类癌细胞系以及20多种不同类型癌症的PDX模型，以评估肿瘤生长速率、肿瘤PD-L1表达水平及免疫细胞浸润情况（第3节）。代表性结果如

讨论

近年来，人们对癌症发生和发展的认识取得了显著进展，研究重点集中在全面理解肿瘤细胞及其相关间质。利用宿主免疫机制可能对癌细胞产生更强的抑制作用，这代表了一种极具前景的治疗策略。具有完整小鼠免疫系统的小鼠模型，如同系移植模型和基因工程小鼠（GEM）模型，已被广泛用于研究检查点介导的免疫反应。这些模型的疗效评估在很大程度上依赖于针对小鼠靶点的替代性抗体^13,14。然而，人与小鼠免疫系统之间存在固有的差异，且某些人类靶点在小鼠模型中缺失，这些因素限制了免疫-肿瘤（I-O）抗肿瘤效应的临床前研究^15,16。因此，迫切需要建立同时包含人类免疫细胞和人类肿瘤的稳健小鼠模型，这将显著提升新型免疫-肿瘤治疗药物的转化研究与开发进程。

本文描述了一种基于人外周血单个核细胞（PBMC）的异种移植小鼠模型，该模型有望广泛应用于转化性免疫-肿瘤学（I-O）研究。PBMC供体以...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>PBMC 分离 / 细胞培养
Histopaque-1077	Sigma	10771	细胞分离
DMEM	康宁	10-013-CVR	细胞培养
DPBS	康宁	21-031-CVR	细胞培养
FBS	康宁	35-076-CV	细胞培养
青霉素-链霉素，液体	Gibco	15140-163	细胞培养
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红	Gibco	25200-114	细胞培养
Matrigel	康宁	356237	CDX 接种
<强>FACS 分析
牛胰脱氧核糖核酸酶 I	Sigma	DN25	样品制备
I型胶原酶	Sigma	C0130	样品制备
抗小鼠/人 CD11b (M1/70) 抗体	BioLegend	101206	FACS
抗小鼠 Ly-6C（HK1.4）抗体	BioLegend	128008	FACS
抗小鼠 Ly-6G（1A8）抗体	BioLegend	127614	FACS
抗人CD8（OKT8）抗体	Sungene Biotech	H10082-11H	FACS
抗人CD279（MIH4）抗体	eBioscience	12-9969-42	FACS
抗人CD3（HIT3a）抗体	4A Biotech	--	FACS
Guava easyCyte 8HT 台式流式细胞仪	Millipore	0500-4008	FACS
<强>肿瘤/人源肿瘤异种移植（PDX）植入/给药/测量
环磷酰胺	J&K	货号#419656，CAS#6055-19-2	体内功效
二硫仑	J&K	货号#591123，CAS#97-77-8	体内功效
注射器	BD	300841	CDX 接种
皮下注射针头（14 G）	上海莎麦迪科 & 塑料仪器有限公司	0.7*32 TW SB	PDX接种
游标卡尺（MarCal）	Mahr	16ER	肿瘤测量
IVC独立通气笼具	凌云博济有限公司	IVC-128	动物实验设施
<强>免疫组织化学
Leica ASP200 真空组织处理仪	Leica	ASP200	免疫组织化学
Leica RM2235 手动旋转切片机，用于常规切片	Leica	RM2235	免疫组织化学
Leica EG1150 H 加热型石蜡包埋模块	Leica	EG1150 H	免疫组织化学
Ariol-临床IHC和FISH扫描仪	Leica	Ariol	免疫组织化学
抗人CD8（EP334）抗体	ZSGB-Bio	ZA-0508	免疫组织化学
抗人PD1 [NAT105]抗体	Abcam	ab52587	免疫组织化学
抗人PD-L1（E1L3N）抗体	细胞信号技术公司	13684S	免疫组织化学
Polink-2 plus 聚合物 HRP 检测系统	ZSGB-Bio	PV-9001/9002	免疫组织化学