用于转化性肿瘤免疫学（I-O）研究的人源外周血单个核细胞（PBMC）移植人源化异种移植模型

摘要

我们描述了一种基于人外周血单个核细胞（PBMC）的人源化异种移植小鼠模型，用于转化性肿瘤免疫学研究。该方案可作为建立和表征类似模型以评估免疫肿瘤学疗法的通用指南。

摘要

近年来，免疫肿瘤学（I-O）疗法的发现与发展代表了癌症治疗领域的一个里程碑。然而，治疗方面仍面临诸多挑战。稳健且与疾病相关的动物模型是持续开展临床前研究与开发的重要资源，有助于应对一系列额外的免疫检查点。本文中，我们描述了一种基于人外周血单个核细胞（PBMC）的人源化异种移植模型。百济神州研发的处于临床后期阶段的人源化抗PD-1抗体BGB-A317（替雷利珠单抗）被用作实例，以阐述该平台的建立、模型特征分析以及药物疗效评估。这些人源化小鼠能够支持大多数测试的人源肿瘤的生长，从而可在人类免疫系统与人类肿瘤并存的背景下评估I-O疗法。该模型一旦建立，具有相对节省时间和成本的优势，且通常可获得高度可重复的结果。我们建议，本文所述方案可作为建立人PBMC与肿瘤重建小鼠模型用于I-O研究的通用指南。

引言

免疫肿瘤学（I-O）是癌症治疗领域中迅速发展的学科。近年来，研究人员开始认识到通过调节免疫系统功能来攻击肿瘤的治疗潜力。免疫检查点阻断疗法在多种癌症类型中已展现出令人鼓舞的疗效，包括黑色素瘤、肾细胞癌、头颈部癌、肺癌、膀胱癌和前列腺癌^1,2。与直接杀伤 癌细胞的靶向治疗不同，I-O 疗法通过增强机体免疫系统来攻击肿瘤³。

迄今为止，已建立了多种相关的免疫肿瘤学动物模型。这些模型包括：1）同源小鼠体内的小鼠肿瘤细胞系或肿瘤同种移植；2）由基因工程小鼠（GEM）或致癌物诱导产生的自发性肿瘤；3）在具有功能性小鼠免疫系统的背景下，敲入人类药物靶点的嵌合型基因工程小鼠；以及4）重建人类免疫系统并移植了人类癌细胞或患者来源的异种移植瘤（PDX）的小鼠。上述每种模型均具有明显的优点和局限性，相关内容已在其他文献中被广泛描述和综述⁴。

人源化免疫缺陷小鼠模型在转化性免疫-肿瘤学（I-O）研究中日益被视为具有临床相关性的方法。该模型通常通过以下两种方式建立：1）移植成人免疫细胞（例如外周血单个核细胞（PMBC））^5,

方案

涉及人类受试者的研究中进行的所有操作均符合百济神州的伦理标准和/或国家研究委员会的伦理要求，以及1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版或同等伦理标准。研究中所有个体参与者均签署知情同意书。涉及动物的研究中进行的所有操作均经百济神州内部审查委员会批准。本方案已针对人源化NOD/SCID小鼠中BGB-A317（替雷利珠单抗）的评估进行了专门调整。

1. 建立基于人外周血单个核细胞的模型

1. 使用环磷酰胺对NOD/SCID小鼠进行骨髓消融：最佳剂量的确定
   1. 购买6-8周龄的雌性NOD/SCID小鼠。
      注意： 本研究中使用的所有小鼠均为雌性。
   2. 用生理盐水配制不同剂量（50、100 和 150 mg/kg）的环磷酰胺（CP）。用含 0.8% 吐温-80 的生理盐水配制双硫仑（DS），浓度为 125 mg/kg。
      注意：配制不同浓度的环磷酰胺（CP），以便对接受不同剂量CP的小鼠给予相同体积的药物溶液。
   3. 每天一次，连续两天，对动物进行环磷酰胺（i.p.）和丹参（p.o.）处理。每次给予环磷酰胺后2小时，给予丹参（p.o.）。
      注意：  DS 可降低 CP 在小鼠中的泌尿系统毒性，且已有建议指出，CP 与 DS 联用相比单独使用 ....

结果

根据本文所述步骤，成功建立了基于人外周血单个核细胞（PBMC）的人源化异种移植模型。简言之，通过流式细胞术分析环磷酰胺（CP）和白消安（DS）处理后NOD/SCID小鼠中性粒细胞和单核细胞群体的变化，评估CP的骨髓清除效应（图1）。确定100 mg/kg CP联合125 mg/kg DS为最佳剂量，后续研究均采用该方案，因其可在不引起小鼠严重毒性的情况下最大程度地耗竭中性粒细胞和单核细胞。随后进行人PBMC移植及肿瘤移植。通过免疫组化（IHC）证实了肿瘤微环境中存在人源免疫细胞浸润（图2）。

通过体内筛选一组PBMC供体，以确保肿瘤微环境中具有相对较高的免疫细胞浸润水平以及可接受的肿瘤生长速率（第2节，图3A）。同时，筛选了30多种人类癌细胞系以及20多种不同类型癌症的PDX模型，以评估肿瘤生长速率、肿瘤PD-L1表达水平及免疫细胞浸润情况（第3节）。代表性结果如

讨论

近年来，人们对癌症发生和发展的认识取得了显著进展，研究重点集中在全面理解肿瘤细胞及其相关间质。利用宿主免疫机制可能对癌细胞产生更强的抑制作用，这代表了一种极具前景的治疗策略。具有完整小鼠免疫系统的小鼠模型，如同系移植模型和基因工程小鼠（GEM）模型，已被广泛用于研究检查点介导的免疫反应。这些模型的疗效评估在很大程度上依赖于针对小鼠靶点的替代性抗体^13,14。然而，人与小鼠免疫系统之间存在固有的差异，且某些人类靶点在小鼠模型中缺失，这些因素限制了免疫-肿瘤（I-O）抗肿瘤效应的临床前研究^15,16。因此，迫切需要建立同时包含人类免疫细胞和人类肿瘤的稳健小鼠模型，这将显著提升新型免疫-肿瘤治疗药物的转化研究与开发进程。

本文描述了一种基于人外周血单个核细胞（PBMC）的异种移植小鼠模型，该模型有望广泛应用于转化性免疫-肿瘤学（I-O）研究。PBMC供体以.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>PBMC 分离 / 细胞培养
Histopaque-1077	Sigma	10771	细胞分离
DMEM	康宁	10-013-CVR	细胞培养
DPBS	康宁	21-031-CVR	细胞培养
FBS	康宁	35-076-CV	细胞培养
青霉素-链霉素，液体	Gibco	15140-163	细胞培养
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红	Gibco	25200-114	细胞培养
Matrigel	康宁	356237	CDX 接种
<强>FACS 分析
牛胰脱氧核糖核酸酶 I	Sigma	DN25	样品制备
I型胶原酶	Sigma	C0130	样品制备
抗小鼠/人 CD11b (M1/70) 抗体	BioLegend	101206	FACS
抗小鼠 Ly-6C（HK1.4）抗体	BioLegend	128008	FACS
抗小鼠 Ly-6G（1A8）抗体	BioLegend	127614	FACS
抗人CD8（OKT8）抗体	Sungene Biotech	H10082-11H	FACS
抗人CD279（MIH4）抗体	eBioscience	12-9969-42	FACS
抗人CD3（HIT3a）抗体	4A Biotech	--	FACS
Guava easyCyte 8HT 台式流式细胞仪	Millipore	0500-4008	FACS
<强>肿瘤/人源肿瘤异种移植（PDX）植入/给药/测量
环磷酰胺	J&K	货号#419656，CAS#6055-19-2	体内功效
二硫仑	J&K	货号#591123，CAS#97-77-8	体内功效
注射器	BD	300841	CDX 接种
皮下注射针头（14 G）	上海莎麦迪科 & 塑料仪器有限公司	0.7*32 TW SB	PDX接种
游标卡尺（MarCal）	Mahr	16ER	肿瘤测量
IVC独立通气笼具	凌云博济有限公司	IVC-128	动物实验设施
<强>免疫组织化学
Leica ASP200 真空组织处理仪	Leica	ASP200	免疫组织化学
Leica RM2235 手动旋转切片机，用于常规切片	Leica	RM2235	免疫组织化学
Leica EG1150 H 加热型石蜡包埋模块	Leica	EG1150 H	免疫组织化学
Ariol-临床IHC和FISH扫描仪	Leica	Ariol	免疫组织化学
抗人CD8（EP334）抗体	ZSGB-Bio	ZA-0508	免疫组织化学
抗人PD1 [NAT105]抗体	Abcam	ab52587	免疫组织化学
抗人PD-L1（E1L3N）抗体	细胞信号技术公司	13684S	免疫组织化学
Polink-2 plus 聚合物 HRP 检测系统	ZSGB-Bio	PV-9001/9002	免疫组织化学