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方法文章

视网膜-外侧膝状体及皮层-外侧膝状体突触功能的电生理学研究

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DOI：

10.3791/59680

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2019年8月7日

 ,  ,  , 
1Institute of Pathophysiology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

本文内容

摘要

本文介绍了制备包含外侧膝状体核的急性脑切片以及对视网膜-膝状体和皮层-膝状体突触功能进行电生理研究的实验方案。该方案可在同一急性脑切片中高效地研究高释放概率和低释放概率的突触特性。

摘要

外侧膝状体是视觉信息传递的第一个中继站。该丘脑核团中的中继神经元整合来自视网膜神经节细胞的输入，并将其投射至视觉皮层。此外，这些中继神经元还接收来自皮层自上而下的兴奋性输入。这两种主要的兴奋性输入在多个方面存在差异。每个中继神经元仅接收少数几个视网膜-膝状体突触的输入，这些突触为具有多个释放位点的大型终末，因此来自视网膜神经节细胞的兴奋作用相对较强。相比之下，皮层-膝状体突触结构较为简单，释放位点较少，突触强度较弱。这两种突触在短时程突触可塑性方面也有所不同。视网膜-膝状体突触具有较高的递质释放概率，因而表现出短时程抑制。相反，皮层-膝状体突触的释放概率较低。皮层-膝状体纤维在进入外侧膝状体之前需穿过丘脑网状核。由于丘脑网状核位于外侧膝状体的头侧，而视束位于其腹外侧，因此可通过细胞外刺激电极分别刺激皮层-膝状体或视网膜-膝状体突触。这使得外侧膝状体成为研究两种具有显著不同特性的兴奋性突触同时作用于同一类型神经元的理想脑区。本文介绍了一种在急性脑片上记录中继神经元活动，并对视网膜-膝状体和皮层-膝状体突触功能进行详细分析的方法。文章包含制备外侧膝状体急性脑片的逐步操作流程，以及分别刺激视束和皮层-膝状体纤维以记录中继神经元活动的具体步骤。

引言

外侧膝状体核的中继神经元整合视觉信息并将其传递至视觉皮层。这些神经元通过视网膜-膝状体突触接收来自神经节细胞的兴奋性输入，该输入为中继神经元提供了主要的兴奋性驱动。此外，中继神经元还通过皮层-膝状体突触接收来自皮层神经元的兴奋性输入。同时，中继神经元还接收来自局部中间神经元以及丘脑网状核的GABA能神经元的抑制性输入1。丘脑网状核位于丘脑与皮层之间，形如屏障，所有从皮层投射至丘脑以及反向投射的纤维均必须穿过丘脑网状核2。

视网膜丘脑投射输入与皮层丘脑投射输入表现出不同的突触特性3,4,5,6,7,8。视网膜丘脑投射形成具有多个释放位点的大型终末9,10。相比之下，皮层丘脑投射则具有仅含单一释放位点的小型终末7。此外，尽管视网膜丘脑突触仅占中继神经元上所有突触的5−10%，却能高效地驱动中继神经元产生动作电位3,8,11。而皮层丘脑突触则通过调控中继神经元的膜电位，起到调节视网膜丘脑传递的作用12,13。

这两种主要的兴奋性输入在功能上也有所不同。其中一个显著差异是视网膜丘脑突触表现出短期抑制，而皮层丘脑突触则表现出短期易化3,5,8。短期可塑性是指突触在数毫秒至数秒的时间内重复激活时，其突触强度发生改变的现象。突触释放概率是介导短期可塑性的重要因素。初始释放概率较低的突触，由于突触前Ca2+的累积，导致在重复活动后释放概率增加，从而表现出短期易化。相反，具有高释放概率的突触通常因可立即释放的囊泡耗竭而表现出短期抑制14。此外，突触后受体的脱敏也参与了一些高释放概率突触的短期可塑性过程8,15。高释放概率以及α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA）受体的脱敏共同导致了视网膜丘脑突触显著的短期抑制。相反，低释放概率则是皮层丘脑突触短期易化的基础。

在小鼠中，视束从尾外侧进入背外侧膝状体核（dLGN），而皮质-膝状体纤维则从嘴腹侧进入dLGN。这两种输入之间的距离使得研究人员能够分别研究投射到同一细胞上的两种截然不同的兴奋性输入的特性。本文在先前报道的一种制备急性脑切片的方法基础上进行了改进，该方法可同时保留视网膜-膝状体和皮质-膝状体纤维3。随后，我们描述了对中继神经元进行电生理记录，并利用细胞外刺激电极分别刺激视网膜-膝状体和皮质-膝状体纤维的方法。最后，我们提供了一套用于向中继神经元灌注生物胞素并进行后续解剖学分析的实验方案。

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方案

所有实验均经莱茵兰-普法尔茨州政府动物实验监督委员会批准。

1. 溶液

  1. 解剖液
    1. 为减少兴奋性毒性，制备一种基于胆碱的溶液用于解剖过程，配方如下（单位为 mM）：87 NaCl、2.5 KCl、37.5 氯化胆碱、25 NaHCO3、1.25 NaH2PO4、0.5 CaCl2、7 MgCl2 和 25 葡萄糖。解剖液应在实验前一周内配制。
  2. 记录液
    1. 制备人工脑脊液（ACSF），配方如下（单位为 mM）：125 NaCl、25 NaHCO3、1.25 NaH2PO4、2.5 KCl、2 CaCl2、1 MgCl2 和 25 葡萄糖。加入 50 µM D-APV 和 10 µM SR 95531 氢溴酸盐，分别用于阻断 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体和 GABAA 受体。
  3. 细胞内液
    1. 制备细胞内液，配方如下（单位为 mM）：35 Cs-葡萄糖酸盐、100 CsCl、10 HEPES、10 EGTA 和 0.1 D-600（甲氧维拉帕米盐酸盐）。用 CsOH 将 pH 值调节至 7.3。过滤后分装，将储备液保存于 -20 °C，直至使用。

2. 解剖

  1. 准备两个切片室，其中一个加入100 mL的解剖液，另一个加入100 mL的记录液。将两个烧杯放入37 °C水浴中，并用碳氧混合气（carbogen）鼓泡至少15分钟，以在解剖前充分氧合溶液。
  2. 取一个塑料烧杯，加入250 mL接近冰温（但未结冰）的解剖液。使用前至少用碳氧混合气鼓泡15分钟。
  3. 取一个塑料培养皿（100 mm × 20 mm），用于进行脑组织解剖，加入冷的解剖液。将一片滤纸放入培养皿盖内。
  4. 将振动切片机（vibratome）的解剖腔室预冷。
  5. 使用2.5%异氟烷对小鼠进行麻醉，例如在小鼠笼内完成。当小鼠对尾部夹捏无反应时，迅速在延髓颈交界处剪断头部，并将头部浸入培养皿底部的冰冻解剖液中。
  6. 从尾侧向鼻侧切开头皮，并用手指将其向两侧拉开以暴露颅骨。为取出前脑，首先沿前后中线切开颅骨，然后分别沿冠状缝和人字缝再进行两次切割（图1A）。
  7. 移除冠状缝与人字缝之间的颅骨，暴露大脑半球。用精细刀片切除嗅球，并将前脑与中脑分离（图1B）。使用薄刮铲将脑组织从颅骨中取出，置于培养皿盖内的滤纸上。
    注意：步骤2.6和2.7应尽快完成，以减少细胞死亡。
  8. 为在脑切片中保持外侧膝状体背侧核（dLGN）的感觉输入和皮层输入完整性，需以3−5°的角度进行矢状旁切以分离两个半球（图1C、D）。将两个半球的内侧-外侧切面置于滤纸上吸干，然后以10−25°的角度将其粘附于切片台上（图1E）。
  9. 将切片台置于金属缓冲托盘中央，并轻轻将剩余的冰冻解剖液倒入缓冲托盘中。操作时需格外小心，避免液体冲击力导致粘附的脑组织脱落（图1F）。
  10. 将缓冲托盘放入盛有冰块的托盘中，以维持解剖过程中的低温环境。使用剃刀刀片以0.1 mm/s的速度和1 mm的振幅切出250 µm厚的脑片。
  11. 将切片转移至孵育室中，置于充氧的解剖液中，在34 °C下孵育约30分钟，随后将切片转移至记录液中，在34 °C下继续恢复30分钟。
  12. 恢复完成后，将切片孵育室从水浴中取出，切片在室温（RT）下保存，直至用于后续实验。

3. 电生理学

  1. 使用硼硅酸盐玻璃毛细管和拉制仪制备电极。记录电极的电阻应维持在 3−4 MΩ。刺激电极采用相同的拉制程序制备，但在拉制后需轻微折断尖端以增大直径。用细胞内液和生物胞素填充记录电极，而刺激电极则用记录液填充。
  2. 将脑片放入记录室，并在室温下持续灌注含氧的记录液。检查所有脑片，选择视束结构完整的脑片进行实验。
  3. 使用配备红外差分干涉（IR-DIC）视频显微镜的直立显微镜观察脑片和细胞。
    注：中继神经元可通过其较大的胞体和更多的初级树突（从胞体发出的分支）与中间神经元相区分。中间神经元呈双极形态，胞体较小。
  4. 在用记录电极进行细胞封接前，先将刺激电极放置于脑片上。为研究视网膜-丘脑突触，将刺激电极直接置于视束上，此处为视网膜神经节细胞轴突纤维的聚集区域（图 2A）。为分析皮层-丘脑突触，则将刺激电极置于丘脑网状核，该核团位于背外侧膝状体（dLGN）的嘴侧腹方（图 2B）。
  5. 当记录电极浸入记录液后，施加 5 mV 的电压阶跃以监测电极电阻。将保持电位设为 0 mV，并校正偏移电位，使保持电流为 0 pA。
  6. 在向细胞靠近时，对记录电极施加正压。当电极与细胞膜直接接触时，释放正压，并将保持电位设为 -70 mV。施加轻微负压，使细胞膜贴附于玻璃电极，形成吉欧姆封接（电阻 >1 GΩ）。补偿电极电容后，通过施加负压脉冲破膜进入全细胞模式。
  7. 为研究突触功能，通过刺激电极施加 0.1 ms 的电流脉冲（约 30 µA）。若未观察到突触反应，可能需要更换刺激电极。在移动刺激电极位置时需格外小心，避免丢失已记录的细胞。
    注：在 图 2 所示的示例记录中，通过以 30 ms 的刺激间隔连续两次刺激视束或皮层-丘脑纤维来研究突触短时程可塑性。配对脉冲比（PPR）通过将第二次兴奋性突触后电流（EPSC）的幅度除以第一次 EPSC 的幅度（EPSC2/EPSC1）计算得出。每种刺激方案重复 20 次，EPSC 幅度由 20 次扫描的平均电流测量获得。每次重复之间的时间间隔至少为 5 s，以避免重复刺激引起的短时程可塑性效应。
  8. 通过施加 5 mV 电压阶跃持续监测串联电阻。仅选用串联电阻小于 20 MΩ 的细胞进行数据分析。

4. 生物胞素标记

  1. 保持全细胞记录构型至少5分钟，以允许生物胞素扩散至远端树突。
  2. 记录结束后，轻柔地将电极从细胞中移出，避免破坏细胞体。
    注意：若在同一脑片上记录多个细胞，其细胞体之间应保持足够距离，确保成像时不同细胞的树突互不干扰。
  3. 准备一个24孔细胞培养板，每孔加入300 µL的4%多聚甲醛（PFA）。注意避免PFA污染任何将与待记录脑片接触的物品。
  4. 使用橡胶吸管将脑片从记录槽转移至含PFA的培养板中，并在4 °C下固定过夜。操作过程中应始终防止吸管被PFA污染。
    警告：操作PFA时务必佩戴手套，并在通风橱中进行。
  5. 脑片经PFA固定过夜后，弃去PFA，替换为磷酸盐缓冲液（PBS）。将脑片置于4 °C的PBS中保存，以备后续处理（保存时间不超过2周）。
  6. 用新鲜PBS清洗脑片3次，每次10分钟。
  7. 将脑片置于封闭液（含0.2%非离子型表面活性剂和5%牛血清白蛋白的PBS溶液）中，在旋转摇床上室温孵育2小时，以阻断非特异性结合位点。
  8. 弃去封闭液，将脑片置于含链霉亲和素-Alexa 568（按1:1,000比例稀释于封闭液中）的溶液中，在旋转摇床上4 °C孵育过夜。
  9. 弃去抗体溶液，在旋转摇床上用PBS室温清洗脑片3次，每次10分钟。封片前用自来水冲洗脑片。
  10. 将来自同一只小鼠的脑片置于同一张载玻片上，确保染色的细胞位于脑片的上表面。用纸巾吸去脑片周围的水分，然后静置晾干约15分钟。
  11. 在每片脑片上滴加两滴封片介质，盖上盖玻片，避免产生气泡。
  12. 使用共聚焦显微镜观察后，将标记好的脑片置于4 °C保存。

5. 细胞成像与重建

  1. 使用共聚焦显微镜扫描切片，并利用配套软件进行分析。
  2. 在561 nm波长下激发荧光。
  3. 采用数值孔径（NA）为0.7的油浸物镜对切片进行成像。
  4. 将目标细胞调整至视野中央，并应用2.5倍放大倍率。
  5. 对Z轴堆栈数据集进行重建，以扫描整个神经元，参数如下：图像格式 = 2,550 × 2,550像素，扫描频率 = 400 Hz，Z层数 = 40。体素尺寸约为0.1211 × 0.1211 × 1.8463 µm³。
  6. 使用神经元重建软件（例如NeuronStudio）半自动追踪神经元。图3B展示了一个三维追踪的中继神经元示例。

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结果

包含视网膜-外侧膝状体通路和皮层-外侧膝状体通路的 dLGN 脑片制备在 4 倍物镜下显示（图 2）。视网膜神经节细胞的轴突在视束中成束走行（图 2）。刺激电极分别置于视束以诱导视网膜-外侧膝状体突触介导的电流（图 2A），或置于丘脑网状核以诱导皮层-外侧膝状体突触介导的电流（图 2B）。值得注意的是，来自皮层神经元至外侧膝状体神经元的轴突从皮层投射至丘脑，需经过丘脑网状核。因此，通过刺激丘脑网状核可激活皮层-外侧膝状体突触。

以30 ms的刺激间隔刺激视束时，AMPA受体介导的兴奋性突触后电流（EPSCs）的双脉冲比值低于1；而以相同刺激间隔刺激皮质-膝状体纤维时，该比值则高于1（

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讨论

我们描述了一种基于先前发表方法3的改进方案，该方法允许在同一脑片上同时研究高释放概率的视网膜丘脑外膝状突触和低释放概率的皮层丘脑外膝状突触。这一点非常重要，因为这两种输入通路相互作用，共同调节视觉信号的传递：视网膜丘脑输入是中继神经元的主要兴奋性驱动，而皮层丘脑输入则起到调节作用，通过影响中继神经元的状态来调控视网膜丘脑信号传递的增益。正如预期，我们观察到由于释放概率不同，视网膜丘脑突触和皮层丘脑突触表现出不同的短期可塑性。此外，AMPA受体的脱敏也导致了视网膜丘脑突触中显著的抑制效应9,15,16。我们最近的研究表明，短期抑制受到CKAMP44的调控16，CKAMP44是CKAMP家族的一种AMPA受体辅助蛋白，可减缓AMPA受体从脱敏状态恢复的速度18,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由德国研究基金会（DFG）在合作研究中心（SFB）1134 "功能复合体"（J.v.E. 和 X.C.）以及研究基金 EN948/1-2（J.v.E.）的资助下完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
放大器 HEKA ElektronikEPC 10 USB 双膜片钳放大器
生物胞素Sigma-AldrichB4261-250MG
CaCl2EMSURE1.02382.1000
氯化胆碱Sigma-AldrichC1879-1KG
共聚焦激光扫描显微镜Leica MicrosystemsTCS SP5
CsClEMSURE1.02038.0100
Cs-葡萄糖酸盐自制由于无市售的Cs-葡萄糖酸盐，我们自行制备 
D-600 Sigma-AldrichM5644-50MG甲氧维拉帕米盐酸盐
D-APV Biotrend BN0085-100NMDA受体拮抗剂
显微镜用数码相机OlympusXM10
EGTASERVA11290.02
氟烷Abbvie2594.00.00异氟烷
葡萄糖Sigma-Aldrich49159-1KG
HEPESROTH9105.2
高电流刺激隔离器World Precision InstrumentsA385
KClEMSURE1.04936.1000
MgCl2EMSURE1.05833.0250
显微操作器Luigs & NeumannSM7
显微镜OlympusBX51
封片剂 ThermoFisher ScientificP36930Prolong Gold Invitrogen
NaClROTH3957.1
NaH2PO4EMSURE1.06346.1000
NaHCO3EMSURE1.06329.1000
移液管Hilgenberg1807502
拉制仪Sutter P-1000
剃须刀片 Personna 60-0138
半自动振动切片机Leica  BiosystemsVT1200S
SR 95531 氢溴酸盐 Biotrend AOB5680-10GABAA受体拮抗剂 

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