本文介绍了制备包含外侧膝状体核的急性脑切片以及对视网膜-膝状体和皮层-膝状体突触功能进行电生理研究的实验方案。该方案可在同一急性脑切片中高效地研究高释放概率和低释放概率的突触特性。
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摘要
摘要
外侧膝状体是视觉信息传递的第一个中继站。该丘脑核团中的中继神经元整合来自视网膜神经节细胞的输入，并将其投射至视觉皮层。此外，这些中继神经元还接收来自皮层自上而下的兴奋性输入。这两种主要的兴奋性输入在多个方面存在差异。每个中继神经元仅接收少数几个视网膜-膝状体突触的输入，这些突触为具有多个释放位点的大型终末，因此来自视网膜神经节细胞的兴奋作用相对较强。相比之下，皮层-膝状体突触结构较为简单，释放位点较少，突触强度较弱。这两种突触在短时程突触可塑性方面也有所不同。视网膜-膝状体突触具有较高的递质释放概率，因而表现出短时程抑制。相反，皮层-膝状体突触的释放概率较低。皮层-膝状体纤维在进入外侧膝状体之前需穿过丘脑网状核。由于丘脑网状核位于外侧膝状体的头侧，而视束位于其腹外侧，因此可通过细胞外刺激电极分别刺激皮层-膝状体或视网膜-膝状体突触。这使得外侧膝状体成为研究两种具有显著不同特性的兴奋性突触同时作用于同一类型神经元的理想脑区。本文介绍了一种在急性脑片上记录中继神经元活动，并对视网膜-膝状体和皮层-膝状体突触功能进行详细分析的方法。文章包含制备外侧膝状体急性脑片的逐步操作流程，以及分别刺激视束和皮层-膝状体纤维以记录中继神经元活动的具体步骤。
引言
外侧膝状体核的中继神经元整合视觉信息并将其传递至视觉皮层。这些神经元通过视网膜-膝状体突触接收来自神经节细胞的兴奋性输入，该输入为中继神经元提供了主要的兴奋性驱动。此外，中继神经元还通过皮层-膝状体突触接收来自皮层神经元的兴奋性输入。同时，中继神经元还接收来自局部中间神经元以及丘脑网状核的GABA能神经元的抑制性输入1。丘脑网状核位于丘脑与皮层之间，形如屏障，所有从皮层投射至丘脑以及反向投射的纤维均必须穿过丘脑网状核2。
视网膜丘脑投射输入与皮层丘脑投射输入表现出不同的突触特性3,4,5,6,7,8。视网膜丘脑投射形成具有多个释放位点的大型终末9,10。相比之下，皮层丘脑投射则具有仅含单一释放位点的小型终末7。此外，尽管视网膜丘....
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方案
所有实验均经莱茵兰-普法尔茨州政府动物实验监督委员会批准。
1. 溶液
- 解剖液
- 为减少兴奋性毒性，制备一种基于胆碱的溶液用于解剖过程，配方如下（单位为 mM）：87 NaCl、2.5 KCl、37.5 氯化胆碱、25 NaHCO3、1.25 NaH2PO4、0.5 CaCl2、7 MgCl2 和 25 葡萄糖。解剖液应在实验前一周内配制。
- 记录液
- 制备人工脑脊液（ACSF），配方如下（单位为 mM）：125 NaCl、25 NaHCO3、1.25 NaH2PO4、2.5 KCl、2 CaCl2、1 MgCl2 和 25 葡萄糖。加入 50 µM D-APV 和 10 µM SR 95531 氢溴酸盐，分别用于阻断 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体和 GABAA 受体。
- 细胞内液
- 制备细胞内液，配方如下（单位为 mM）：35 Cs-葡萄糖酸盐、100 CsCl、10 HEPES、10 EGTA 和 0.1 D-600（甲氧维拉帕米盐酸盐）。用 C....
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结果
包含视网膜-外侧膝状体通路和皮层-外侧膝状体通路的 dLGN 脑片制备在 4 倍物镜下显示（图 2）。视网膜神经节细胞的轴突在视束中成束走行（图 2）。刺激电极分别置于视束以诱导视网膜-外侧膝状体突触介导的电流（图 2A），或置于丘脑网状核以诱导皮层-外侧膝状体突触介导的电流（图 2B）。值得注意的是，来自皮层神经元至外侧膝状体神经元的轴突从皮层投射至丘脑，需经过丘脑网状核。因此，通过刺激丘脑网状核可激活皮层-外侧膝状体突触。
以30 ms的刺激间隔刺激视束时，AMPA受体介导的兴奋性突触后电流（EPSCs）的双脉冲比值低于1；而以相同刺激间隔刺激皮质-膝状体纤维时，该比值则高于1（
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讨论
我们描述了一种基于先前发表方法3的改进方案，该方法允许在同一脑片上同时研究高释放概率的视网膜丘脑外膝状突触和低释放概率的皮层丘脑外膝状突触。这一点非常重要，因为这两种输入通路相互作用，共同调节视觉信号的传递：视网膜丘脑输入是中继神经元的主要兴奋性驱动，而皮层丘脑输入则起到调节作用，通过影响中继神经元的状态来调控视网膜丘脑信号传递的增益。正如预期，我们观察到由于释放概率不同，视网膜丘脑突触和皮层丘脑突触表现出不同的短期可塑性。此外，AMPA受体的脱敏也导致了视网膜丘脑突触中显著的抑制效应9,15,16。我们最近的研究表明，短期抑制受到CKAMP44的调控16，CKAMP44是CKAMP家族的一种AMPA受体辅助蛋白，可减缓AMPA受体从脱敏状态恢复的速度18,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由德国研究基金会（DFG）在合作研究中心（SFB）1134 "功能复合体"（J.v.E. 和 X.C.）以及研究基金 EN948/1-2（J.v.E.）的资助下完成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 放大器 | HEKA Elektronik | EPC 10 USB 双膜片钳放大器 | |
| 生物胞素 | Sigma-Aldrich | B4261-250MG | |
| CaCl2 | EMSURE | 1.02382.1000 | |
| 氯化胆碱 | Sigma-Aldrich | C1879-1KG | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CsCl | EMSURE | 1.02038.0100 | |
| Cs-葡萄糖酸盐 | 自制 | 由于无市售的Cs-葡萄糖酸盐，我们自行制备 | |
| D-600 | Sigma-Aldrich | M5644-50MG | 甲氧维拉帕米盐酸盐 |
| D-APV | Biotrend | BN0085-100 | NMDA受体拮抗剂 |
| 显微镜用数码相机 | Olympus | XM10 | |
| EGTA | SERVA | 11290.02 | |
| 氟烷 | Abbvie | 2594.00.00 | 异氟烷 |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | 49159-1KG | |
| HEPES | ROTH | 9105.2 | |
| 高电流刺激隔离器 | World Precision Instruments | A385 | |
| KCl | EMSURE | 1.04936.1000 | |
| MgCl2 | EMSURE | 1.05833.0250 | |
| 显微操作器 | Luigs & Neumann | SM7 | |
| 显微镜 | Olympus | BX51 | |
| 封片剂 | ThermoFisher Scientific | P36930 | Prolong Gold Invitrogen |
| NaCl | ROTH | 3957.1 | |
| NaH2PO4 | EMSURE | 1.06346.1000 | |
| NaHCO3 | EMSURE | 1.06329.1000 | |
| 移液管 | Hilgenberg | 1807502 | |
| 拉制仪 | Sutter | P-1000 | |
| 剃须刀片 | Personna | 60-0138 | |
| 半自动振动切片机 | Leica Biosystems | VT1200S | |
| SR 95531 氢溴酸盐 | Biotrend | AOB5680-10 | GABAA受体拮抗剂 |
参考文献
- Guido, W. Development, form, and function of the mouse visual thalamus. Journal of Neurophysiology. 120, 211-225 (2018).
- Guillery, R. W., Feig, S. L., Lozsadi, D. A. Paying attention to the thalamic reticular nucleus. Trends in Neurosciences. 21, 2....
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