本文介绍一种利用近红外染料结合免疫组织化学与高分辨率扫描，检测脑区蛋白质的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
神经科学是研究脑内细胞如何介导各种功能的学科。测量神经元和胶质细胞中的蛋白质表达对于神经科学研究至关重要，因为细胞功能由细胞内蛋白质的组成和活性决定。本文描述了如何将免疫细胞化学与近红外高分辨率扫描相结合，以对不同脑区的蛋白质表达进行半定量分析。该技术可用于在同一脑区内检测单种或两种蛋白质的表达。通过这种方式测量蛋白质，可获得实验干预后蛋白质表达的相对变化、学习与记忆的分子特征、分子通路中的活性变化，以及多个脑区内的神经活动情况。结合适当的蛋白质选择和统计分析，还可确定脑区之间的功能连接性。鉴于免疫细胞化学技术在实验室中易于实施，将其与近红外高分辨率扫描结合使用，可显著提升神经科学家在系统水平上研究神经生物学过程的能力。
引言
神经科学研究旨在探讨脑内细胞如何介导特定功能1。这些功能可能是细胞层面的，例如胶质细胞如何在中枢神经系统中发挥免疫作用，也可能涉及实验研究，旨在阐明背侧海马体中神经元活动如何实现空间导航。从广义上讲，细胞功能由细胞中表达的蛋白质及其活性决定2。因此，检测脑细胞中蛋白质的表达水平和/或活性对于神经科学研究至关重要。
目前有多种技术可用于检测脑内蛋白质的表达，包括体内方法，如用于受体密度检测的正电子发射断层扫描3，以及用于小肽检测的微透析技术4。更常见的是使用离体方法来研究蛋白质的功能与表达水平，这些方法包括质谱技术5、蛋白质印迹法（Western blot）和酶联免疫吸附测定（ELISA）6，以及免疫细胞化学技术7。免疫细胞化学技术在神经科学领域被广泛应用。该技术利用一抗来识别目标蛋白质（或抗原，例如c-Fos），再通过标记的二抗识别蛋白质-一抗复合物（图1）。为了能够检测蛋白质-一抗-二抗复合物，二抗通常偶联有氧化酶类，如辣根过氧化物酶（HRP），从而在细胞内形成可在光学显微镜下观察到的沉淀物7。二抗也可偶联荧光化学物质（即荧光素），在受到激发时发出荧光，用于检测蛋白质-一抗-二抗复合物7。此外，有时一抗本身已直接偶联还原剂或荧光物质，从而无需使用二抗7（图1）。
有趣的是，许多免疫细胞化学方法能够实现脑细胞中蛋白质的可视化，但无法对特定细胞或脑区中的蛋白质含量进行定量。利用光学显微镜检测还原反应产生的沉淀物，可以实现神经元和胶质细胞的可视化，但该方法无法用于定量细胞或特定脑区中的蛋白质表达水平。理论上，荧光显微镜可用于此类定量，因为荧光二抗所发射的光信号可反映蛋白质-一抗-二抗复合物的量。然而，脑组织中的自发荧光会干扰荧光显微镜对脑组织蛋白质表达水平的定量分析8。因此，脑组织荧光图像所发射的光信号极少被用于脑内蛋白质表达的定量。
通过结合高分辨率扫描，许多上述问题可以利用近红外免疫细胞化学技术加以解决9,10。本文介绍了如何将近发射光谱范围内的荧光染料与免疫细胞化学技术相结合，并配合高分辨率扫描（例如 10–21 µm），以获得清晰的图像，从而实现对不同脑区蛋白质的半定量分析。
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方案
本方案已获得特拉华大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。本方案使用约55–75日龄的雄性Sprague Dawley大鼠。
1. 脑组织提取与样本制备
- 将大鼠置于异氟烷麻醉诱导舱中进行麻醉，直至大鼠对足部夹捏刺激无反应。
- 使用断头器迅速断头处死大鼠。
- 沿颅骨从后向前切开皮肤，并将其从颅骨顶部剥离清除。
- 使用咬骨钳小心去除颅骨后部，然后用小型解剖剪沿颅骨中线剪开，操作过程中始终向上顶起颅骨顶部，以避免损伤脑组织。
- 使用咬骨钳将颅骨左右两半逐步剥离，以暴露脑组织。
- 用小型刮匙插入脑组织下方，切断神经，小心抬起脑组织，并将其置于经干冰冷却的异戊烷（温度至少为 -20 °C）中速冻。随后将脑组织保存于 -80 °C 超低温冰箱中，直至切片。
- 在恒温冷冻切片机（温度维持在 -9 °C 至 -12 °C）中将脑组织按目标区域切成 30–50 µm 的切片。将切片直接贴附于载玻片上，并存放于 -80 °C 超低温冰箱中，待进行免疫细胞化学检测时使用。
注意：本实验方案中感兴趣脑区为海马和杏仁核。
2. 单重免疫组织化学反应
注意：对于双重免疫组织化学反应，其操作步骤与单重免疫组织化学反应相同，区别在于本反应使用来自不同宿主的两种一抗（例如兔源和鼠源），而对应的二抗则应均来自同一宿主（例如山羊抗兔和山羊抗小鼠）。此外，两种二抗必须具有不同的发射光谱，且这些光谱需与高分辨率扫描仪兼容。例如，一种二抗的发射光谱峰值为680 nm，另一种二抗为800CW（发射光谱峰值为780 nm）。
- 从冰箱中取出载玻片，室温平衡30分钟。
- 在通风橱内，用含4%多聚甲醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下固定脑组织1−2小时。
- 用0.1 M三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）清洗载玻片三次，每次10分钟。通过将载玻片置于温和去垢剂（例如0.01%去垢剂）中孵育30−60分钟，以通透细胞膜。
- 用TBS清洗载玻片三次，每次15分钟。
- 将针对目标蛋白的一抗用PBS按适当浓度稀释。例如，为检测即刻早期基因c-Fos，可将兔源抗c-Fos一抗稀释至1:500浓度。
- 用移液器将一抗溶液直接加至脑组织上（每张3英寸×1英寸载玻片约200 µL）。
- 加盖盖玻片，使脑组织在载玻片上与一抗稀释液孵育，可在室温下孵育1−2小时，或在4 °C下过夜（约17小时）。
- 移除盖玻片，用含少量去垢剂的TBS（例如0.01%去垢剂，"TBS-T"）清洗载玻片四次，每次15分钟。
- 加盖盖玻片，在室温下用二抗孵育脑切片2小时。
注意：二抗必须按正确稀释比例配制，稀释液应包含TBS、去垢剂和1.5%同源血清。例如，1:2,000稀释的 goat 二抗应含有1.5% goat 血清和0.05%去垢剂。 - 用TBS-T清洗载玻片四次，每次20分钟，然后再用TBS清洗四次，每次20分钟。
- 在避光条件下室温干燥载玻片过夜。载玻片干燥后即可用于成像。
3. 成像
- 将载玻片放置在近红外扫描界面上，组织面向下。可使用选择工具一次成像一张或多张玻璃载玻片。
- 使用最高质量设置对载玻片进行成像，偏移量为 0 nm，分辨率为 21 µm。扫描时间通常为 13−19 小时，具体时长取决于所使用的扫描设备。
- 将图像导入图像分析软件（例如 ImageStudio），以查看并标记用于半定量蛋白质分析。
4. 蛋白质表达分析
- 打开图像分析软件，选择图像被扫描进入的工作区。
- 在图像分析软件中打开已扫描的图像以查看扫描结果，并调整所显示的波长、对比度、亮度和放大倍数，但不得修改原始图像或总定量发射信号。
- 确定用于定量的关键区域，选择页面顶部的分析选项卡，然后选择绘制矩形（或绘制椭圆/手绘），在需要定量的区域上绘制一个矩形。
- 要查看矩形的尺寸，选择屏幕左下角的形状，然后选择右下角的列，添加高度和宽度列以确定形状大小。
注意：在进行定量比较时，控制形状大小至关重要。建议在目标定量位置内使用相同尺寸的形状，以准确获取该区域发射信号的采样数据。 - 随后为每个形状命名并重复上述操作。当所有区域均完成采样后，可汇总并分析来自列选项卡的数据。
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结果
在使用高分辨率扫描进行免疫组织化学实验之前，应验证实验方案的有效性。可通过验证实验实现，即用同一动物的脑切片分别孵育一抗和二抗、仅二抗，或不加一抗和二抗。此类验证实验的结果如图2所示。在该反应中，我们检测了背侧海马和杏仁核中的即刻早期基因c-Jun。只有在脑组织同时施加了一抗和二抗的情况下，才观察到c-Jun的表达。
图3 显示了杏仁核核团中的双重蛋白质检测。在本实验中，我们在同一脑组织样本中检测了α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA）受体的GluR1亚基以及N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体的NR2A亚基，从而能够分析杏仁核各亚核团中AMPA/NMDA受体的比例。该比值是学习与记忆的神经生物学标志物11,1...
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讨论
本文展示的结果表明，近红外免疫细胞化学结合高分辨率扫描可用于获取脑组织中蛋白质表达的半定量测量数据。该方法还可用于在同一脑区同时标记两种蛋白质。我们此前曾使用近红外免疫组织化学技术测量多个脑区的即刻早期基因表达9,10。即刻早期基因可作为神经元活动的指标。我们还对这些蛋白质表达的半定量测量数据进行了统计分析，从而能够将即刻早期基因（IEGs）表达水平相关的脑区进行归类。我们利用这一方法评估功能连接性，研究应激如何影响情绪学习与记忆过程中恐惧环路内各节点之间的功能连接9,10。我们展示了如何通过高分辨率扫描结合近红外免疫细胞化学技术测量AMPA/NMDA比值（学习与记忆的标志性指标）13。类似的技术也可用于检测总蛋白和磷酸化蛋白，以确定分子信号通路，这通常通过Western印迹法实现14。然而，该方法需要从厚脑切...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本报告中的研究由美国国立普通医学科学研究所（NIGMS）向DK提供的目标资助（1P20GM103653）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 脑组织提取 | |||
| 麻醉诱导室 | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| 小型剪颅器 | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| 弗里德曼咬骨钳 | Fine Science Tools | 16000-14 | 用于去除颅骨后部 |
| 精细解剖剪 | Fischer Scientific | 08-951-5 | 用于沿颅骨中线向上剪开 |
| 微型刮匙 | Fischer Scientific | 21-401-5 | 用于挖出脑组织 |
| 玻璃显微镜载片 | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| 免疫组织化学反应 | |||
| Trion X-100 | 用作温和去垢剂，在多聚甲醛固定后使细胞通透；也可与宿主血清及二抗联合使用作为温和去垢剂 | ||
| Tween-20 | 在TBS中加入少量作为去垢剂 ，盖玻片与一抗孵育后配制TBS-T缓冲液 | ||
| Licor Odyssey 扫描仪 | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio 软件 | Licor Biotechnology Inc. |
参考文献
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- Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , Academic Press/Elsevier. (2009).
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重印与许可
