KSHV感染细胞中特定基因产物的定量荧光原位杂交（FISH）与免疫荧光（IF）检测

摘要

我们介绍一种利用荧光原位杂交（FISH）技术在裂解感染的人类细胞中可视化多种疱疹病毒RNA的实验方案，适用于悬浮或贴壁细胞。该方案包含荧光信号的定量分析，以生成核质比，并可扩展用于通过免疫荧光（IF）同时可视化宿主和病毒蛋白。

摘要

通过仔细研究和定量分析特定的RNA和蛋白质，可以获得机制层面的深入认识。利用荧光原位杂交（FISH）和免疫荧光（IF）技术，可以捕捉这些生物分子在特定时间点于细胞内的相对位置。在疱疹病毒裂解性感染过程中，病毒会劫持宿主细胞，优先表达病毒基因，从而引起细胞形态以及生物分子行为的变化。裂解活动集中在细胞核内的“病毒复制区室”（即核内病毒工厂），这些结构只能通过FISH和IF技术加以识别。本文介绍了一种适用于卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）感染细胞（包括贴壁细胞和悬浮细胞）的RNA FISH与IF联合检测的可调节实验方案。该方法包括特异性反义寡核苷酸探针的设计、双RNA FISH、RNA FISH与IF共染、以及荧光强度的定量计算等步骤。该方案已成功应用于多种细胞类型，包括未感染细胞、潜伏感染细胞、裂解期细胞、时间进程实验，以及经抑制剂处理的细胞，用于分析来自人类宿主和KSHV的特定RNA与蛋白质在时空上的动态分布与功能活动。

引言

在裂解期（活跃期）中，疱疹病毒会劫持宿主细胞，导致细胞形态以及生物分子定位发生变化，从而产生病毒颗粒。这一过程的核心是细胞核，在此处双链DNA病毒基因组被复制并包装进一种称为衣壳的蛋白质外壳中¹。首先，病毒表达自身编码的蛋白质，劫持宿主细胞的合成机制，并抑制非必需宿主基因的表达，这一过程被称为宿主关断效应。这些活动主要集中在细胞核内特定的、不含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的区域，称为病毒复制区室，其组成包括宿主和病毒的蛋白质、RNA以及病毒DNA²。细胞结构被彻底改造，以为病毒复制区室提供空间和资源，进而支持病毒衣壳的组装。一旦衣壳离开细胞核，其在细胞质中如何被包膜形成具有膜结构的病毒颗粒（即病毒体）的过程尚不明确。深入了解裂解期中宿主与病毒生物分子的定位及其空间动态变化，有助于更深入揭示病毒复制区室的结构组织、宿主关断效应、病毒体出核途径以及其他与疱疹病毒感染和复制相关的过程机制。

目前检测和研究这些变化的最佳方法是分别利用免疫荧光（IF）和荧光原位杂交（FISH）技术对感染细胞中的蛋白质和RNA进行可视化观察。结合时间序列实验使用这些技术，可揭示生物分子在裂解期关键时间点的定位，即获得时空数据。FISH和IF可与其他生物化学技术相互补充，例如细胞过程抑制实验（如抑制病毒DNA复制）、实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）、RNA测序、Northern印迹、质谱分析、Western印迹以及病毒DNA生成分析，这些技术能够提供关于细胞活动更全面的信息。

我们开发了RNA FISH技术，用于检测特定基因的RNA产物，并结合一种计算分析方法，可定量计算特定基因产物的核质比。样品制备方法改进自Steitz及其同事早期的文献^3,4，操作相对简便，适用于贴壁细胞和悬浮细胞。该方案还可灵活用于多种RNA FISH策略的联合检测（双标记RNA FISH），或RNA FISH与免疫荧光（IF）策略的联合使用。尽管特定FISH策略的开发具有挑战性，但本文概述了提高成功率的建议。此处描述的数据分析方法在使用荧光微球和强效的区室边界标记物时具有定量性，可为显微图像提供更深入的洞察，消除观察偏倚。该详细方案专为卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）感染的潜伏期和裂解期细胞设计，也可用于未感染细胞或其他疱疹病毒感染细胞⁵。所述定量方法适用于大多数细胞中核质转运或细胞亚区室间重定位的研究。

方案

1. 设计荧光原位杂交（FISH）反义寡核苷酸以检测特异性疱疹病毒转录本

1. 从目标 RNA 序列中选择 25 至 40 个核苷酸长度的片段，并将其设计为反义序列。一个成功的 FISH 策略可包含一个至十个或更多的不同反义寡核苷酸。在选择序列时，请考虑以下因素：
   1. 如果目标 RNA 包含独特的重复区域，则应利用这一特征，设计靶向该重复序列的反义寡核苷酸。
      注：Tycowski 及其同事⁵ 提供了针对恒河猴疱疹病毒（rhesus rhadinovirus, RRV）多聚腺苷酸化核 RNA（PAN RNA）应用此策略的示例。
   2. 如果目标 RNA 包含已知的蛋白质结合位点或茎环结构，则应设计避开这些区域的寡核苷酸。
   3. 根据实验目的，考虑是否包含内含子序列，并决定是否为此设计反义寡核苷酸。
2. 对选定的反义序列进行简单的计算分析，以确保结合特异性并减少反义寡核苷酸的聚集。
   1. 序列的 GC 含量应约为 50%（富含鸟嘌呤和胞嘧啶），熔解温度应在 60 至 70 °C 范围内。
   2. 使用序列分析工具筛选不会发生自二聚化或形成熔解温度高于 37 °C（即杂交温度）发夹结构的序列。
   3. 使用 NCBI BLASTn（美国国家生物技术信息中心核酸局部比对搜索工具）对所选序列在宿主和病毒转录组中进行“相似性较低”设置下的比对搜索。该搜索可鉴定出不太可能与其他宿主或病毒转录本结合的独特反义寡核苷酸。
      注：若转录组数据不可用，可使用基因组序列进行 BLAST 搜索。理想情况下，应使用实验中所用感染细胞中分离出的病毒序列进行搜索，因为野生型毒株往往具有多样性，并可能包含来自不同实验室毒株的序列组合。
3. 订购经计算验证为独特且可能与目标 RNA 结合的反义序列对应的纯化 DNA 寡核苷酸。寡核苷酸无需引入特殊修饰。
4. 通过 FISH 和 Northern 印迹实验检测所设计的反义寡核苷酸的结合特异性。
   1. 使用与实验病毒相同宿主物种的未感染细胞系（例如 293T），并尽可能使用相同细胞类型，转染一个在强启动子（如 CMV，巨细胞病毒）驱动下表达目标 RNA 的质粒，以及一个空载体（例如 pcDNA3）。同时使用阳性对照进行转染，例如共转染 GFP（绿色荧光蛋白）质粒（如 pmaxGFP）或携带 GFP 的载体。
      注：应避免使用通过疱疹病毒 Epstein-Barr 病毒（EBV）永生化的细胞系，因为疱疹病毒之间存在序列相似性。
   2. 按照本方案所述方法，使用反义寡核苷酸对两组细胞进行第 3 节所述的 FISH 操作。通过比较单独、成对或成组反义寡核苷酸的 FISH 实验结果，判断哪些为有效候选序列。使用 FISH 实验的阳性对照，例如 U2 snRNA（小核 RNA）FISH，其在每个人类细胞核中约有 500,000 个拷贝⁶（表 1）。
   3. 在含有目标 RNA 的细胞中，荧光信号应具有特异性和强强度。设计额外的反义寡核苷酸以增强信号，并排除非特异性结合的反义寡核苷酸。信号强度必须显著高于背景和自发荧光水平。
   4. 通过 Northern 印迹实验验证结合特异性。

2. 寡核苷酸和细胞的制备

1. 根据制造商说明，使用末端转移酶将反义寡核苷酸标记上地高辛（DIG）-dUTP；若结合能力强，也可直接用荧光核苷酸（如Alexa Fluor 594-5-dUTP）进行标记。标记完成后无需额外纯化。将标记好的寡核苷酸储存于-20 °C，可保存数年；若为直接标记，需用锡箔纸包裹以防止光漂白。
   警告：标记溶液中含有毒物质二甲基砷酸钾（potassium cacodylate）。操作标记反应时应佩戴手套。
   注意：为节约资源，可在一次反应中同时标记多种不同的反义寡核苷酸。本方案采用3'端标记法。内部标记较为困难，因为化学基团（如DIG或荧光染料）可能被卡住或无法进入DNA聚合酶的活性位点。可使用直接标记的反义寡核苷酸以及抗DIG免疫荧光法（搭配不同荧光染料，例如FITC（荧光素）或Alexa Fluor 488 与 Alexa Fluor 594）对两种不同的RNA进行实验。
2. 将细胞接种至八孔板上。
   注意：八孔板可在减少珍贵试剂（如抗体）用量的同时进行多个并行实验。替代方案为使用六孔组织培养板搭配无菌的标准盖玻片（22 mm × 22 mm），或使用圆形盖玻片与24孔组织培养板。对于这两种替代方案，本方案中提及的体积应分别增加10–15倍（例如，杂交液用量为1.75 mL）和4倍（例如，杂交液用量为600 µL）。
   1. 对于贴壁的裂解期细胞，使用1×胰蛋白酶/PBS在37 °C、5% CO₂条件下处理10分钟以悬浮细胞，并稀释至60%汇合度。
      注意：FISH实验中使用的贴壁细胞系包括293T、iSLK.219⁷和iSLK-BAC36细胞⁸。
   2. 向无菌八孔板的每个孔中加入200 µL细胞悬液，在37 °C、5% CO₂条件下培养12–24小时以促进贴壁生长。根据细胞生长速度或对胰蛋白酶敏感性适当调整条件。
      注意：目标是使细胞在载玻片上均匀分布并牢固贴附。若裂解期细胞较为脆弱，建议在细胞贴壁后再诱导进入裂解期。基于iSLK细胞的实验结论具有局限性⁹。
   3. 对于裂解期悬浮细胞，先在组织培养超净台中用1:10稀释的聚-L-赖氨酸处理八孔板5分钟，随后于室温下晾干过夜，或在65 °C下烘干1小时。将浓度为1 × 10⁶ 个细胞/mL的裂解期细胞悬液800 µL加入孔板中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育30分钟至1小时。
      注意：悬浮细胞会沉降形成单层，并黏附于聚-L-赖氨酸表面，因此与贴壁细胞相比，过量细胞不会造成显著影响。对于易形成葡萄串状聚集的裂解期细胞，应尽可能通过轻柔涡旋或化学方法将其分散。但需说明的是，作者在处理裂解期BJAB-RRV-GFP细胞时，上述建议方法效果不佳。若悬浮细胞贴附效果差，可考虑延长聚-L-赖氨酸孵育时间或提高其浓度。

3. 病毒RNA的固定、免疫荧光（可选）、杂交与可视化

1. 移除培养基和多余的细胞。在整个实验过程中，使用真空抽吸法去除溶液，使用微量移液器轻柔地添加溶液。
   注意：可通过在玻璃巴斯德吸管前端套上一个200 µL的移液枪头来降低真空吸力。每次洗涤步骤之间应更换新的移液枪头，以防止交叉污染。每个洗涤步骤都必须迅速完成，因为细胞绝不能干燥。
2. 立即在冰上用预冷的4%多聚甲醛/PBS（磷酸盐缓冲盐水）固定细胞30分钟。用200 µL预冷至4 °C的1× PBS洗涤细胞三次，每次在室温或冰上孵育5分钟。
   1. 在冰上用200 µL预冷的0.5% Triton-X/PBS（磷酸盐缓冲盐水）对固定后的细胞进行透化处理10分钟，或在4 °C下用750 µL预冷的70%乙醇处理1小时（最小）至7天（最大）。
      注意：在固定时点收集蛋白、总RNA和基因组DNA样本，以确保图像与生化检测结果之间的一致性。除非另有说明，本实验方案中的所有洗涤步骤均以相同方式进行。70%乙醇可松动腔室与载玻片之间的粘合，便于后续分离，并显著延长实验暂停时间。尽管如此，仍需使用石蜡膜包裹腔室载玻片以减少蒸发，并每隔约8小时检查各腔室中乙醇的液面高度。70%乙醇还能使细胞变平，从而获得更清晰的图像；而Triton-X不会使细胞脱水，也不会改变细胞的形态尺寸。
3. 小心移除腔室，防止载玻片破裂。如果实验包括使用多克隆一抗对病毒或宿主蛋白进行免疫荧光（IF）检测，则应在进行RNA FISH前按以下步骤完成IF。如果免疫荧光使用的是单克隆一抗，则应在第3.11步之后再按第3.3.1步所述进行免疫荧光。
   注意：应使用全新的移除工具或残留粘合剂极少的厂家提供工具，轻柔地取下腔室，以防载玻片破裂。使用70%乙醇作为透化试剂处理4小时可显著降低破裂风险。若发生破裂，可在未受影响的腔室继续实验流程，并注意密封不完全的载玻片氧化速率更高（即储存寿命更短）。
   1. 用预冷的1× PBS冲洗细胞，并在4 °C下用预冷的4% BSA（牛血清白蛋白）/1× PBS封闭30分钟。
      注意：在整个实验过程中使用BSA可减少非特异性标记。
   2. 去除封闭液，将细胞与1:200或其他稀释比例的多克隆一抗在0.1% BSA/1× PBS中于4 °C孵育1小时，然后用1× PBS洗涤三次。
      注意：检测SSB/ORF6（病毒单链DNA结合蛋白）的一抗¹⁰以1:200稀释比例使用。
   3. 将细胞与带有荧光标记的二抗在4 °C孵育1小时，该二抗的荧光应与FISH检测抗体兼容。用1× PBS洗涤三次后，用4%多聚甲醛/1× PBS固定10–15分钟，并如前所述使用Triton-X或70%乙醇进行透化处理，然后进入FISH步骤。用锡箔纸覆盖载玻片以保护荧光信号，防止光漂白。
4. 用2× SSC（柠檬酸钠-氯化钠缓冲液）洗涤细胞一次，然后每腔室加入45 µL杂交液，杂交液组成为：50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、2× SSC、0.1% BSA、500 µg/mL鲑精DNA、125 µg/mL E. coli tRNA和1 mM 钒酰核糖核苷复合物。在湿润室中37 °C孵育1小时，湿润室可使用直径150 mm的培养皿并放入湿润的无菌擦拭纸制成。
   注意：杂交液应至少在使用前1小时新鲜配制。先将硫酸葡聚糖溶于水中，频繁涡旋并置于37 °C水浴中孵育使其充分溶解。
5. 计算使每腔室35 µL杂交液中寡核苷酸终浓度约为25 µM。根据需要调整反义寡核苷酸的浓度。加入蒸馏水使寡核苷酸变性体系总体积达到10 µL。
   注意：标记反应完成后，寡核苷酸保存于淬灭液中，其组分为：0.18 M 二甲胂酸钾、23 mM Tris-HCl、0.23 mg/mL BSA、4.5 mM CoCl₂、18 mM EDTA、2.7 mM K-磷酸盐、6.8 mM KCl、45 µM 2-巯基乙醇、0.02% Triton X-100和2%甘油。这些浓度足够高，加水稀释后变性液的浓度接近1× TE（10 mM Tris-HCl和1 mM EDTA），这是标准的寡核苷酸变性缓冲液。
6. 将DIG和/或Alexa Fluor 594标记的寡核苷酸在95 °C变性5分钟。然后向每份变性后的寡核苷酸中加入35 µL新鲜杂交液。若进行双重FISH，两组反义寡核苷酸可同时变性并杂交。
7. 去除预杂交液，将含标记寡核苷酸的杂交液加至细胞上。在37 °C湿润室中避光孵育过夜，锡箔纸包裹以保护荧光标记的寡核苷酸。
   注意：孵育时间应不少于10小时，不超过24小时。
8. 次日，在37 °C下用2× SSC洗涤两次，每次10分钟；然后在25 °C下用1× SSC洗涤两次，每次10分钟。
9. 在冰上用预冷的4%多聚甲醛/1× PBS固定细胞10–15分钟。然后用PBS洗涤三次，并在4 °C下用预冷的70%乙醇透化1小时，或用预冷的0.5% Triton-X/1× PBS透化10分钟。
10. 在4 °C下用预冷的0.1% BSA/1× PBS中1:200稀释的抗DIG-FITC抗体孵育细胞1小时。去除抗体溶液后，用1× PBS洗涤三次。
11. 在4 °C下用预冷的4%多聚甲醛/1× PBS固定10–15分钟，然后用1× PBS洗涤三次。若需使用单克隆一抗对宿主或病毒蛋白进行免疫荧光检测，则应先对细胞进行透化，再执行第3.3.1步所述IF流程。否则直接进入DAPI染色步骤。
12. 在冰上用含0.4 µg/mL DAPI的预冷0.5% Triton-X/1× PBS孵育细胞15分钟，然后用1× PBS洗涤三次。
13. 使用荧光微球（可选）和封片剂封片，然后用透明指甲油将盖玻片密封至载玻片上。
14. 使用共聚焦显微镜在完成实验后1小时至1周内以630倍放大倍数采集图像。多层涂抹指甲油以密封盖玻片，通过降低氧化速率延长荧光团寿命。
    注意：不要使用含DAPI的封片剂。采集图像时，应在每张图像上添加比例尺，以便后续定量分析。荧光微球可作为不同载玻片及样品制备间荧光强度的对照¹¹。为进行第4步的二维（2D）定量分析，应采集细胞中段层面的图像。

4. 定量分析FISH和IF图像以突出亚细胞定位并确定荧光的核质比

1. 对组装好的多种荧光染色及合并图像进行图像分析，以确保一致性。使用图像采集时包含的比例尺来设定图像分析软件的标尺。
2. 为量化多个通道中的荧光强度，并参照细胞核DAPI染色，使用线条工具和轮廓分析（plot-profile）功能。然后在图像副本上用标记永久标示该线条，确保标记不会遮挡或影响观察者的判断。
   1. 建立指导线条绘制位置的标准，例如沿中心轴描绘一条能涵盖多种地形特征（如峰与谷）的轨迹，或避免穿过过度饱和区域的线条。
      注：这些线条轨迹展示的是细胞中原始荧光信号，因此仅适用于比较染色位置，而不适用于强度比较。若需在不同载玻片、处理方式或样本制备之间比较同一染色的强度，请在步骤3.13中将荧光微珠作为内参加入载玻片。荧光微珠必须在封片过程中添加，并使用相同的激发激光和光电倍增管（共聚焦）设置进行检测。
3. 为量化亚细胞定位的变化，计算经不同处理的细胞的核质比。
   1. 利用细胞核DAPI染色划定内边界，测量细胞核和细胞质的面积及原始荧光强度。应包括核内和胞质的对照，例如核内RNA（如KSHV PAN RNA）和胞质RNA（如宿主GAPDH mRNA）。此外，在三个类似细胞的区域测量背景强度，并计算每像素或每µm²的平均值。
      注：荧光强度值通常无单位，因此使用“单位”一词表示。
   2. 通过首先确定相同区域的平均背景值，再从该区域的原始强度中减去该个体化背景值，对细胞核和细胞质的原始强度值进行归一化处理。
      1. 例如，一个裂解期B细胞的细胞核面积为133.4 µm²，原始强度为75976单位，而相同荧光信号的背景强度为0.67单位/µm²。归一化的细胞核强度为
         
   3. 将数值代入以下公式：
      
      注：该计算可校正亚细胞区域变化的影响。裂解诱导和药物处理可能分别导致细胞核增大或细胞整体尺寸改变。
   4. 为解释结果，绘制箱线图（box whisker plot）。若荧光信号分布均匀，比值接近零；若信号主要位于细胞核，则比值为正值；若信号主要位于细胞质，则比值趋向负值。

结果

本论文中详述的FISH和IF方法如图1所示，并通过荧光强度的线迹对结果进行了定量分析。此处呈现的结果为半定量性质，主要用于揭示定位信息，而非不同荧光染料之间强度的比较，因为实验的载玻片制备过程中未包含荧光微珠。图1还显示，潜伏期和裂解期KSHV感染细胞的胞质与细胞核区域及其比值存在差异。因此，在图2展示的核质比分析中对区域进行了控制。图2通过使用核内对照——病毒多聚腺苷酸化核（PAN）RNA，以及胞质对照——宿主GAPDH mRNA，验证了本文所述核质比计算方法的准确性。图3显示，在裂解期使用磷ono乙酸（Doxy + PAA）或西多福韦（Doxy + Cido）抑制KSHV DNA复制时，早期ORF59-58转录本的定位转变为以胞质为主。图中的显微图像及

讨论

本报告中所述的实验方案可适用于不同类型的细胞，包括双重 RNA FISH 以及结合单克隆和多克隆一抗的 RNA FISH 与免疫荧光（IF）联合检测步骤。尽管制备好的载玻片通常使用共聚焦显微镜进行成像，但通过提高抗体浓度并更换封片介质后，也可采用受激辐射损耗（STED）显微镜进行成像。为了对单个细胞进行更深入的分析，采用本方案制备的样品还可通过细胞分选仪或流式细胞仪进行分选、成像和分析，仅需进行适度调整，正如 Borah 及其同事所展示的那样¹⁶。然而，该方案不能用于活细胞成像。

所详述的定量方法可消除观察偏差，并用于验证潜在的核质移位现象。核质比还可精确定位生物分子从均匀分布转变为定位于特定亚细胞区域的时间点。本文展示的结果为半定量性质，而实验方案中概述了进一步增强定量可靠性的方法。核质比与线扫描分析（步骤4）的可靠性取决于使用荧光微球作为强度对照（步骤3.13）以及清晰的亚细胞标记物（例如核内Lamin A/C标记物）的应用。目前尚无明确的边界标记物可用于KSHV病毒复制区室。尽管如此，通过使用适当的标记物，该计算方法可推广至其他...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AlexaFluor594-5-dUTP	Life Technologies	C1100
抗DIG-FITC	Jackson Lab Immunologicals	200-092-156
兔源二抗AlexaFluor594单克隆抗体	Invitrogen	A-11037	山羊
抗SSB抗体	N/A	N/A	参见Chiou等，2002
BLASTn	NIH NCBI	N/A	免费序列比对软件
硫酸葡聚糖	Sigma Aldrich	D8906	分子生物学级
DIG-寡核苷酸末端标记试剂盒	Sigma Roche	#03353583910	第二代
八孔板载玻片	Nunc Lab Tek II	#154453	蓝色密封可增强表面张力，也可使用透明凝胶分隔。
甲酰胺	Sigma Aldrich	F9037	分子生物学级
GAPDH探针	Stellaris	SMF-2019-1	与本实验方案兼容，Quasar 670标记
ImageJ	NIH, Bethesda, MD	N/A	免费图像分析软件，[http:rsb.info.nih.gov/ij/]
OligoAnalyzer	IDT	N/A	免费寡核苷酸分析工具
pcDNA3	Invitrogen	A-150228
pmaxGFP	Amaxa	VDF-1012
聚-L-赖氨酸	Sigma Aldrich	P8920
末端脱氧核苷酸转移酶	Sigma Roche	#003333574001
钒酰核糖核苷复合物	NEB	S1402S
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	封片剂中的DAPI会散射光线，降低对比度。