KSHV感染细胞中特定基因产物的定量荧光原位杂交（FISH）与免疫荧光（IF）检测

摘要

我们介绍一种利用荧光原位杂交（FISH）技术在裂解感染的人类细胞中可视化多种疱疹病毒RNA的实验方案，适用于悬浮或贴壁细胞。该方案包含荧光信号的定量分析，以生成核质比，并可扩展用于通过免疫荧光（IF）同时可视化宿主和病毒蛋白。

摘要

通过仔细研究和定量分析特定的RNA和蛋白质，可以获得机制层面的深入认识。利用荧光原位杂交（FISH）和免疫荧光（IF）技术，可以捕捉这些生物分子在特定时间点于细胞内的相对位置。在疱疹病毒裂解性感染过程中，病毒会劫持宿主细胞，优先表达病毒基因，从而引起细胞形态以及生物分子行为的变化。裂解活动集中在细胞核内的“病毒复制区室”（即核内病毒工厂），这些结构只能通过FISH和IF技术加以识别。本文介绍了一种适用于卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）感染细胞（包括贴壁细胞和悬浮细胞）的RNA FISH与IF联合检测的可调节实验方案。该方法包括特异性反义寡核苷酸探针的设计、双RNA FISH、RNA FISH与IF共染、以及荧光强度的定量计算等步骤。该方案已成功应用于多种细胞类型，包括未感染细胞、潜伏感染细胞、裂解期细胞、时间进程实验，以及经抑制剂处理的细胞，用于分析来自人类宿主和KSHV的特定RNA与蛋白质在时空上的动态分布与功能活动。

引言

在裂解期（活跃期）中，疱疹病毒会劫持宿主细胞，导致细胞形态以及生物分子定位发生变化，从而产生病毒颗粒。这一过程的核心是细胞核，在此处双链DNA病毒基因组被复制并包装进一种称为衣壳的蛋白质外壳中¹。首先，病毒表达自身编码的蛋白质，劫持宿主细胞的合成机制，并抑制非必需宿主基因的表达，这一过程被称为宿主关断效应。这些活动主要集中在细胞核内特定的、不含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的区域，称为病毒复制区室，其组成包括宿主和病毒的蛋白质、RNA以及病毒DNA²。细胞结构被彻底改造，以为病毒复制区室提供空间和资源，进而支持病毒衣壳的组装。一旦衣壳离开细胞核，其在细胞质中如何被包膜形成具有膜结构的病毒颗粒（即病毒体）的过程尚不明确。深入了解裂解期中宿主与病毒生物分子的定位及其空间动态变化，有助于更深入揭示病毒复制区室的结构组织、宿主关断效应、病毒体出核途径以及其他与疱疹病毒感染和复制相关的过程机制。

目前检测和研究这些变化的最佳方法是分别利用免疫荧光（IF）和荧光原位杂交（FISH）技术对感染细胞中的蛋白质和RNA进行可视化观察。结合时间序列实验使用这些技术，可揭示生物分子在裂解期关键时间点的定位，即获得时空数据。FISH和IF可与其他生物化学技术相互补充，例如细胞过程抑制实验（如抑制病毒DNA复制）、实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）、RNA测序、Northern印迹、质谱分....

方案

1. 设计荧光原位杂交（FISH）反义寡核苷酸以检测特异性疱疹病毒转录本

1. 从目标 RNA 序列中选择 25 至 40 个核苷酸长度的片段，并将其设计为反义序列。一个成功的 FISH 策略可包含一个至十个或更多的不同反义寡核苷酸。在选择序列时，请考虑以下因素：
   1. 如果目标 RNA 包含独特的重复区域，则应利用这一特征，设计靶向该重复序列的反义寡核苷酸。
      注：Tycowski 及其同事⁵ 提供了针对恒河猴疱疹病毒（rhesus rhadinovirus, RRV）多聚腺苷酸化核 RNA（PAN RNA）应用此策略的示例。
   2. 如果目标 RNA 包含已知的蛋白质结合位点或茎环结构，则应设计避开这些区域的寡核苷酸。
   3. 根据实验目的，考虑是否包含内含子序列，并决定是否为此设计反义寡核苷酸。
2. 对选定的反义序列进行简单的计算分析，以确保结合特异性并减少反义寡核苷酸的聚集。
   1. 序列的 GC 含量应约为 50%（富含鸟嘌呤和胞嘧啶），熔解温度应在 60 至 70 °C 范围内。
   2. 使用序列分析工具筛选不会发生自二聚化或形成熔解温度高于 37 °C（即杂交温度）发夹结构的序列。
   3. 使用 NCBI BLASTn（美国国家生物技术信息中心核酸局部比对搜索工具）对所选序列在宿主和病毒转录组中进行“相似性较低....

结果

本论文中详述的FISH和IF方法如图1所示，并通过荧光强度的线迹对结果进行了定量分析。此处呈现的结果为半定量性质，主要用于揭示定位信息，而非不同荧光染料之间强度的比较，因为实验的载玻片制备过程中未包含荧光微珠。图1还显示，潜伏期和裂解期KSHV感染细胞的胞质与细胞核区域及其比值存在差异。因此，在图2展示的核质比分析中对区域进行了控制。图2通过使用核内对照——病毒多聚腺苷酸化核（PAN）RNA，以及胞质对照——宿主GAPDH mRNA，验证了本文所述核质比计算方法的准确性。图3显示，在裂解期使用磷ono乙酸（Doxy + PAA）或西多福韦（Doxy + Cido）抑制KSHV DNA复制时，早期ORF59-58转录本的定位转变为以胞质为主。图中的显微图像及

讨论

本报告中所述的实验方案可适用于不同类型的细胞，包括双重 RNA FISH 以及结合单克隆和多克隆一抗的 RNA FISH 与免疫荧光（IF）联合检测步骤。尽管制备好的载玻片通常使用共聚焦显微镜进行成像，但通过提高抗体浓度并更换封片介质后，也可采用受激辐射损耗（STED）显微镜进行成像。为了对单个细胞进行更深入的分析，采用本方案制备的样品还可通过细胞分选仪或流式细胞仪进行分选、成像和分析，仅需进行适度调整，正如 Borah 及其同事所展示的那样¹⁶。然而，该方案不能用于活细胞成像。

所详述的定量方法可消除观察偏差，并用于验证潜在的核质移位现象。核质比还可精确定位生物分子从均匀分布转变为定位于特定亚细胞区域的时间点。本文展示的结果为半定量性质，而实验方案中概述了进一步增强定量可靠性的方法。核质比与线扫描分析（步骤4）的可靠性取决于使用荧光微球作为强度对照（步骤3.13）以及清晰的亚细胞标记物（例如核内Lamin A/C标记物）的应用。目前尚无明确的边界标记物可用于KSHV病毒复制区室。尽管如此，通过使用适当的标记物，该计算方法可推广至其他.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AlexaFluor594-5-dUTP	Life Technologies	C1100
抗DIG-FITC	Jackson Lab Immunologicals	200-092-156
兔源二抗AlexaFluor594单克隆抗体	Invitrogen	A-11037	山羊
抗SSB抗体	N/A	N/A	参见Chiou等，2002
BLASTn	NIH NCBI	N/A	免费序列比对软件
硫酸葡聚糖	Sigma Aldrich	D8906	分子生物学级
DIG-寡核苷酸末端标记试剂盒	Sigma Roche	#03353583910	第二代
八孔板载玻片	Nunc Lab Tek II	#154453	蓝色密封可增强表面张力，也可使用透明凝胶分隔。
甲酰胺	Sigma Aldrich	F9037	分子生物学级
GAPDH探针	Stellaris	SMF-2019-1	与本实验方案兼容，Quasar 670标记
ImageJ	NIH, Bethesda, MD	N/A	免费图像分析软件，[http:rsb.info.nih.gov/ij/]
OligoAnalyzer	IDT	N/A	免费寡核苷酸分析工具
pcDNA3	Invitrogen	A-150228
pmaxGFP	Amaxa	VDF-1012
聚-L-赖氨酸	Sigma Aldrich	P8920
末端脱氧核苷酸转移酶	Sigma Roche	#003333574001
钒酰核糖核苷复合物	NEB	S1402S
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	封片剂中的DAPI会散射光线，降低对比度。