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DNA酶依赖性分析rRNA的2'-O-甲基化

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DOI：

10.3791/59700

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2019年9月16日

 , 
1School of Biosciences, University of Birmingham

本文内容

摘要

本文介绍一种依赖脱氧核酶（DNAzyme）的RNA切割实验方案。该方法可实现对RNA 2’-O-甲基化的快速且位点特异性的分析，可用于对snoRNA活性进行初步或主要评估。

摘要

导向盒C/D型核仁小RNA（snoRNA）可催化核糖体RNA和核小RNA的2’-O-甲基化。然而，在高等真核生物中，大量snoRNA可能非特异性地识别其他RNA分子，并对多个靶点进行2’-O-甲基化。本文提供了一种快速且低成本的位点特异性2’-O-甲基化分析方法的分步操作指南，该方法采用一种已建立的、使用短DNA寡核苷酸（称为DNA酶，DNAzymes）的技术。这些DNA片段包含催化序列，可在RNA的特定共识位点进行切割，同时具有可变的同源臂，用于引导DNA酶靶向特定RNA序列。当RNA切割位点邻近的核苷酸发生2’-O-甲基化时，DNA酶的活性将受到抑制。因此，DNA酶仅受限于被切割序列的共识序列，是快速分析snoRNA介导的RNA 2’-O-甲基化的理想工具。我们以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中由snoRNA snR13和snR47指导的25S核糖体RNA的2’-O-甲基化为例，展示了该技术的简便性，并提供了基于DNA酶检测方法的详细实验方案。

引言

RNA 修饰在基因表达调控中发挥着重要作用。由 C/D 盒和 H/ACA 盒小核仁 RNA（snoRNA）分别引导的 RNA 2’-O-甲基化和假尿苷化，能够保护 RNA 免受降解，并稳定其高级结构1,2,3。目前已鉴定的 snoRNA 靶标主要存在于核糖体 RNA（rRNA）和小核 RNA（snRNA）中。然而，在高等真核生物中，可能存在数百种功能尚未明确的 snoRNA，其中部分 snoRNA 可能识别多种 RNA1,4,5,6,7。因此，能够识别和分析 snoRNA 引导的修饰的方法，是揭示细胞过程调控机制的重要工具。

可通过生物信息学方法鉴定由C/D盒snoRNA引导的潜在2’-O-甲基化位点，并利用多种实验技术加以验证，包括RNase H介导的切割，以及依赖于低浓度脱氧核苷三磷酸（dNTPs）条件下逆转录反应的位点特异性或全基因组范围方法8,9,10,11。这些技术灵敏度高，但操作繁琐且成本较高，因此可能不适用于初步或快速检测。其中一种最简单且低成本的鉴定2’-O-甲基化位点的方法是DNA酶依赖性RNA切割法12。DNA酶是一类短的单链、具有催化活性的DNA分子，能够特异性地在RNA的特定位置进行内切酶样切割。其结构包含一个保守且具有催化活性的核心序列，以及位于5’和3’端的结合臂，这些结合臂由可变序列组成，设计用于通过Watson-Crick碱基配对与目标RNA杂交（图1）。因此，5’和3’结合臂可将催化核心递送至RNA上的特定位点。当切割位点上游紧邻的核苷酸发生2’-O-甲基化修饰时，DNA酶介导的切割反应会被抑制12,13。这一特性使得DNA酶成为分析潜在或已知RNA 2’-O-甲基化位点的非常实用的工具。

有两种类型的脱氧核酶用于RNA修饰分析12。10-23脱氧核酶的活性序列（图1A）由15个核苷酸（5’RGGCTAGCTACAACGA3’）组成，可在靶向的RNA嘌呤-嘧啶（RY）二核苷酸周围形成一个环状结构，并催化这两个核苷酸之间的断裂。RNA上的嘌呤（R）不与脱氧核酶发生碱基配对，且脱氧核酶上的2’-O-甲基化会抑制切割反应。10-23脱氧核酶的结合臂通常为10至15个核苷酸长。第二类脱氧核酶8-17脱氧核酶（图1B）含有14个核苷酸的催化序列（5’TCCGAGCCGGACGA3’）。其中核苷酸C2、C3和G4分别与C9、G10和G11配对，形成一个短的茎环结构。8-17脱氧核酶可在任何鸟嘌呤上游切割RNA，该鸟嘌呤与脱氧核酶活性序列的第一个胸腺嘧啶不完全配对。鸟嘌呤上游的RNA核苷酸不与脱氧核酶碱基配对，其2’-O-甲基化会阻碍切割反应。8-17脱氧核酶需要约20个核苷酸长度的同源臂，以引导脱氧核酶靶向特定序列。

本文提供了一种利用10-23和8-17 DNA酶依赖性方法分析酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）核糖体RNA中2’-O-甲基化的分步实验方案12,13（图1C）。该方案可轻松适用于其他生物体和RNA种类，可用于快速进行位点特异性的RNA 2’-O-甲基化的初步或深入分析。

方案

1. 菌株、培养基和缓冲液配方

  1. 准备酵母（S. cerevisiae) 培养基，具体如下：YP（1% w/v 酵母提取物，2% w/v 细菌蛋白胨），以及 20% w/v 的葡萄糖和半乳糖储备液
  2. 按如下方法配制醋酸钠（NaAc）-EDTA（AE）缓冲液：50 mM NaAc pH 5.3 和 10 mM EDTA。
  3. 配制10-23 DNAzyme 4×孵育缓冲液，成分为：24 mM Tris（pH 8.0）、60 mM NaCl；以及10-23 DNAzyme 4×反应缓冲液：200 mM Tris（pH 8.0）和600 mM NaCl。
  4. 配制8-17 DNAzyme 2×反应缓冲液，具体如下：200 mM KCl，800 mM NaCl，100 mM HEPES（pH 7.0），15 mM MgCl₂2，以及 15 mM MnCl2.
  5. 按如下方法配制10×MOPS缓冲液：200 mM MOPS、50 mM NaAc、1 mM EDTA，pH 7.0；以及1.5×上样变性缓冲液：50% v/v 甲酰胺、20% v/v 甲醛、1.5× MOPS缓冲液。
  6. 获取 S. cerevisiae 菌株，BY4741（MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0); GAL1::SNR13 （与BY4741相同但 GAL1::SNR13:KANmX); GAL1::SNR47 （与BY4741相同但 GAL1::SNR47:HIS3mX）可用于此分析的任何其他酵母菌株。

2. 脱氧核酶设计

  1. 使用合适的数据库查找感兴趣的RNA序列或假定的甲基化位点。对于S. cerevisiae的snoRNA靶标，使用酵母snoRNA数据库：http://people.biochem.umass.edu/fournierlab/snornadb/mastertable.php14
  2. 为找到感兴趣的甲基化位点（例如snR13依赖性位点），选择“snR13”，并记录修饰核苷酸的位置（例如25S rRNA中由snR13引导的A2281）。
  3. 使用合适的数据库查找修饰核苷酸上下游的序列。对于S. cerevisiae，使用酿酒酵母基因组数据库：https://www.yeastgenome.org/
  4. 搜索目标基因名称，例如RDN25（编码25S rRNA）。
  5. 在“sequence”选项卡中，当使用10-23 DNAzyme检测时，选择甲基化位点上游（5’臂）和下游（3’臂）各10-15个核苷酸；当使用8-17 DNAzyme时，则选择甲基化位点上游（5’臂）和下游（3’臂）各20个核苷酸。
  6. 设计5’臂和3’臂的互补序列。
  7. 用5’臂和3’臂的互补序列分别从两侧连接10-23或8-17 DNAzyme的催化序列。
  8. 向供应商订购该DNAzyme作为常规DNA寡核苷酸。

3. S. cerevisiae 生长条件

注意：使用酿酒酵母（S. cerevisiae）BY4741菌株的衍生株，其中SNR13或SNR47小核仁RNA（snoRNA）的表达由可诱导的GAL1启动子驱动。为诱导或抑制其合成，需将细胞培养在含半乳糖的培养基中（启动GAL1依赖性转录）或含葡萄糖的培养基中（抑制GAL1依赖性转录）。作为对照，使用野生型菌株（BY4741）分别在半乳糖或葡萄糖培养基中培养。

  1. 在适当的培养基和条件下培养酵母菌株。为分析 GAL1::SNR13 和 GAL1::SNR47 菌株以及相应的野生型菌株，将细胞在 50 mL 含 2% 葡萄糖（YPD）或半乳糖（YPGal）的 YP 培养基中，于 30 °C 培养至对数生长中期。
  2. 在 4 °C 下以 1,000 xg 离心 3 分钟。
  3. 弃去上清液，保留沉淀。
  4. 用液氮速冻细胞沉淀，并在 -80 °C 保存。
    注意：液氮可能导致严重的低温灼伤。操作时务必穿戴防护服并采取安全防护措施。
    备注：细胞沉淀可在 -80 °C 保存长达 1 个月。如需暂停，可在本步骤中断实验流程。

4. RNA 提取15

注意：采用最适宜的方法分离 RNA。对于酵母 S. cerevisiae，可使用热酚法提取 RNA。

  1. 加入 1 mL 冰冷的水，重悬沉淀，并将重悬的细胞转移至 1.5 mL 微量离心管中。
  2. 在 4 °C 条件下，以 20,000 ×g 离心 10 秒，弃去上清液。
  3. 加入 400 µL AE 缓冲液，重悬细胞。
    注意：步骤 4.4–4.15 除非另有说明，均在室温下进行。
  4. 加入 40 µL 10% SDS 和 400 µL 酸性苯酚（pH 4.5）。
    注意：苯酚具有毒性，应在通风橱中操作。使用苯酚时务必穿戴实验服、防护手套和护目镜。废液应按照机构规定进行处理。
  5. 涡旋振荡 20 秒，充分混匀。
  6. 在 65 °C 孵育 10 分钟。每 2 分钟轻轻打开并关闭管盖以释放压力，并翻转管子 2–3 次以混匀两相。
  7. 将离心管转移至 -80 °C，孵育 10 分钟。
  8. 在实验台上解冻离心管，并在室温下以 20,000 ×g 离心 5 分钟。
  9. 将上层液体转移至另一新管中，该管内含有 400 µL 酸性苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）。注意不要搅动中间相。
    注意：氯仿具有毒性，应在通风橱中操作。使用氯仿时务必穿戴实验服、防护手套和护目镜。废液应按照机构规定进行处理。
  10. 涡旋振荡 30 秒，充分混匀，然后在室温下以 20,000 ×g 离心 10 分钟。
  11. 将上层液体（约 400 µL）转移至另一新管中，该管内含有 400 µL 氯仿。
  12. 涡旋振荡 30 秒，充分混匀，然后在室温下以 20,000 ×g 离心 5 分钟。
  13. 将上层液体（约 300–350 µL）转移至另一新管中，该管内含有 1 mL 乙醇和 40 µL 7.5 M 醋酸铵（NH4AC）。通过轻轻翻转管子数次进行混匀。
  14. 在 -80 °C 孵育 2 小时，或在 -20 °C 过夜。
    注意：此处可暂停实验流程。
  15. 在 4 °C 条件下以 20,000 ×g 离心 10 分钟。管底将可见少量白色 RNA 沉淀。
  16. 用移液器小心吸除乙醇，避免扰动沉淀。
  17. 加入 1 mL 70% 乙醇，在室温下以 20,000 ×g 离心 5 分钟。
  18. 用移液器吸除 70% 乙醇。
  19. 以 20,000 ×g 离心 15 秒，然后用 2–20 µL 移液器吸除残留的乙醇。
  20. 将离心管敞口置于实验台上 5 分钟，使 RNA 沉淀干燥。
    注意：RNA 沉淀干燥后颜色会由白色变为透明。
  21. 用 30 µL 无 RNase/DNase 的 H2O 重悬 RNA 沉淀，立即将离心管置于冰上，并使用微量分光光度计测定 RNA 浓度。
  22. 将样品在 -20 °C 冻存。
    注意：RNA 可在 -20 °C 保存长达 1 个月，或在 -80 °C 保存长达 1 年。此处可暂停实验流程，或直接进入下一步。

5. DNA酶消化

  1. 10-23 DNAzyme 消化
    1. 在 1.5 mL 离心管中，将 5 µg RNA、200 pmol 10-23 DNAzyme（100 μM 储存液 2 µL）和 2.5 µL 4x 10-23 孵育缓冲液混合，总体积为 10 µL，配制孵育混合液。将离心管置于冰上。
    2. 将离心管转移至设定为 95 °C 的干式加热块中，孵育 3 分钟。
    3. 立即将离心管转移至冰上，孵育 5 分钟。
    4. 短暂离心，然后将离心管放回冰上。
    5. 加入 20 U RNase 抑制剂（例如 0.5 µL RiboLock RNase 抑制剂）。
    6. 将离心管置于设定为 25 °C 的干式加热块中，孵育 10 分钟。
    7. 同时，在 1.5 mL 离心管中配制反应混合液：将 5 µL 4x 10-23 反应缓冲液与 4 µL 300 mM MgCl2 和 1 µL H2O 混合。将该离心管置于设定为 37 °C 的干式加热块中。
    8. 将孵育混合液转移至设定为 37 °C 的干式加热块中，加入 10 µL 预热的反应混合液。
    9. 在 37 °C 下孵育反应 1 小时。
    10. 将离心管转移至冰上，继续进行步骤 5.3.1。
  2. 8-17 DNAzyme 消化
    1. 在 1.5 mL 微量离心管中加入 5 µg RNA，总体积为 6 µL。将离心管置于冰上。
    2. 在 1.5 mL 微量离心管中加入 400 pmol 8-17 DNAzyme（100 μM 储存液 4 µL）。将离心管置于冰上。
    3. 将离心管转移至设定为 95 °C 的干式加热块中，孵育 2 分钟。
    4. 将 RNA 样品转移至冰上。
    5. 短暂离心 DNAzyme 管 5 秒，并在 25 °C 下孵育 10 分钟。
    6. 同时，在 1.5 mL 离心管中加入 10 µL 2x 8-17 反应缓冲液，并在 25 °C 下孵育。
    7. 通过将 10 µL 预热的 2x 反应缓冲液加入 DNAzyme 管中，配制反应混合液。
    8. 将 14 µL 反应混合液转移至 RNA 管中，并加入 20 U RNase 抑制剂。
    9. 在 25 °C 下孵育反应 2 小时。
    10. 将离心管转移至冰上，继续进行 RNA 纯化（步骤 5.3.1）。
  3. RNA 纯化
    1. 向反应管中加入 350 µL 水和 400 µL 氯仿，涡旋振荡 30 秒充分混匀，然后在室温下以 20,000 xg 离心 5 分钟。
    2. 将上层相（约 300–350 µL）转移至另一新管中，该管内已含有 1 mL 乙醇、40 µL 7.5 M NH4AC 和 1 µL 糖原（10 µg/µL）。通过轻轻翻转离心管数次进行混匀。
    3. 在 -80 °C 下孵育 2 小时，或在 -20 °C 下过夜孵育。
      注意：此处可暂停操作。
    4. 重复步骤 4.15 至 4.21。
    5. 用 10 µL 无 RNase/DNase 的 H2O 重悬 RNA 沉淀，并立即将离心管置于冰上。
    6. 将样品在 -20 °C 下冷冻。
      注意：RNA 可在 -20 °C 下保存长达一个月，在 -80 °C 下保存长达一年。此处可暂停操作，或继续进行 RNA 电泳。

6. RNA 电泳

  1. 用1% SDS喷洒电泳设备（电泳槽、制胶托盘、梳子），静置15分钟，然后用大量ddH2O冲洗。
  2. 将1.5 g琼脂糖加入127.5 mL ddH2O中，通过微波加热使其溶解。
  3. 向琼脂糖溶液中加入15 mL 10× MOPS缓冲液和7.5 mL 37%甲醛（总体积为150 mL）。
    注意：甲醛具有毒性，应在通风橱中操作。使用甲醛时务必穿戴实验服、防护手套和护目镜。废液应按照机构规定进行处理。
  4. 向琼脂糖溶液中加入适量所选凝胶染料（例如，15 µL SYBR Safe DNA凝胶染料）。充分混匀后将琼脂糖倒入制胶托盘中。
  5. 立即在凝胶中插入梳子。
  6. 在通风橱中静置45分钟。若使用对光敏感的凝胶染料，需用铝箔覆盖托盘。
  7. 配制600 mL 1× MOPS缓冲液。
  8. RNA样品制备
    1. 在1.5 mL离心管中，加入10 µL经消化和纯化的RNA样品、5 µL样品变性缓冲液和0.5 µL 6×上样染料。
      注意：甲酰胺具有毒性，应在通风橱中操作。使用甲酰胺时务必穿戴实验服、防护手套和护目镜。废液应按照机构规定进行处理。
    2. 将RNA样品在70 °C孵育5分钟，随后转移至冰上，继续孵育5分钟。
    3. 上样前短暂离心收集样品。
  9. 将凝胶放入电泳槽中，并加入1× MOPS缓冲液至覆盖凝胶。将每个样品的全部体积（15 µL）上样至凝胶中，在80 V电压下电泳，直至溴酚蓝迁移至凝胶长度的2/3处。
  10. 使用适合检测所选凝胶染料的成像仪对凝胶进行成像（例如，紫外透射仪）。

结果

最近在snoRNA成熟的研究背景下，已证明DNA酶依赖性切割在rRNA修饰分析中的应用价值13。该DNA酶依赖性检测方法被用于证明，S. cerevisiae中pre-snoRNA 5’端前体加工的缺失会影响25S和18S rRNA的2’-O-甲基化水平13。

在此，我们使用了一种可诱导的snoRNA转录系统，以展示该技术的有效性和简便性。Box C/D snR13引导25S rRNA上两个位点的甲基化，包括腺嘌呤2281（图2A）。该核苷酸后接尿嘧啶，构成10-23 DNA酶可切割的共识二核苷酸（RY）。Box C/D snR47也在25S rRNA上引导两个核苷酸的甲基化（图2B）。第2220位的腺嘌呤后接鸟嘌呤残基，该二核苷酸可被8-17 DNA酶切割。为了诱导或抑制snR13或snR47 snoRNA的合成，我们将可诱导的GAL1启动子插入SNR13或SNR47基因的上游，并在含有半乳糖（GAL1依赖性转录开启）或葡萄糖（GAL1依赖性转录关闭）的培养基中培养细胞。随后，将来自GAL1::SNR13细胞的RNA与设计用于在snR13依赖性位点（即核苷酸2281与2282之间）切割25S rRNA的10-23 DNA酶共同孵育（图2C）。来自GAL1::SNR47菌株的RNA则用靶向snR47依赖性位点（即核苷酸2220与2221之间）的8-17 DNA酶处理（图2D）。作为对照，将野生型BY4741菌株在半乳糖或葡萄糖上生长时提取的RNA分别与两种DNA酶共同孵育。DNA酶处理后的RNA电泳结果显示，从在半乳糖（GAL）上生长的GAL1::SNR13和GAL1::SNR47菌株中提取的25S rRNA保持完整（图3A、B；第3道）。相比之下，从在葡萄糖（GLC）上生长的GAL1::SNR13和GAL1::SNR47细胞中分离的RNA被相应的DNA酶消化（图3A,B；第4道）。在这两种情况下，25S rRNA条带减少，并观察到5’和3’端的切割产物（A和B）。这表明，在GAL1::SNR13和GAL1::SNR47菌株中，当以半乳糖作为碳源且这些snoRNA表达时，25S rRNA在snR13或snR47引导的位点发生了2’-O-甲基化。当在葡萄糖条件下关闭snR13或snR47的表达时，25S rRNA缺乏甲基化，从而允许DNA酶依赖性切割。在野生型样品中未观察到RNA降解（图3A、B；第1和第2道），因为该菌株中snR13和snR47的表达不依赖于半乳糖/葡萄糖。因此，rRNA正常甲基化，对DNA酶活性具有抗性。

总体而言，我们的实验表明，10-23（图3A）和8-17（图3B）DNA酶的切割活性与缺失box C/D类snR13或snR47小核仁RNA相关，明确表明这些小核仁RNA负责25S rRNA在特定位点的2’-O-甲基化。

DNAzyme切割过程示意图；序列、切割途径、实验工作流程步骤。
图1：DNAzyme及其RNA底物。（A）10-23 DNAzyme切割一个嘌呤-嘧啶（RY）RNA二核苷酸。RNA中的R不与DNAzyme配对，而Y与DNAzyme中的R碱基互补。RNA中嘌呤（R）的甲基化会抑制DNAzyme依赖性切割。（B）8-17 DNAzyme在鸟嘌呤上游切割RNA，该鸟嘌呤与DNAzyme催化序列中的第一个胸腺嘧啶不完全配对。鸟嘌呤前的核苷酸未配对，其甲基化可防止DNAzyme依赖性切割。RNA以灰色显示（甲基化位点除外），DNAzyme以紫色显示。N = 任意核苷酸，R = 嘌呤：腺嘌呤或鸟嘌呤，Y = 嘧啶：胞嘧啶或尿嘧啶；CH3- 表示RNA甲基化。DNAzyme活性序列内的碱基配对以虚线标记。蓝色闪电符号标记切割位点。（C）显示DNAzyme依赖性分析步骤的流程图。请点击此处查看该图的放大版本。

靶向snR13/snR47依赖性甲基化位点的脱氧核酶、基因序列分析、示意图。
图2：靶向25S rRNA中snR13和snR47依赖性甲基化位点的DNAzyme。（A, B）浏览器截图显示25S rRNA中的snR13依赖性甲基化位点（A）和snR47依赖性甲基化位点（B）。（C）围绕snR13依赖性甲基化位点（A2281）的25S rRNA序列，以及设计用于在A2281与U2282之间切割RNA的10-23 DNAzyme（以紫色显示）。A2281不与DNAzyme配对，而U2282与DNAzyme活性序列的第一个核苷酸形成配对（由蓝线标记）。蓝色闪电符号标记切割位点。（D）围绕snR47依赖性甲基化位点（A2220）的25S rRNA序列，以及设计用于在A2220与G2221之间切割RNA的8-17 DNAzyme（以紫色显示）。A2220不与DNAzyme杂交，而G2221与胸腺嘧啶（T）不完全配对（以虚线表示）。蓝色闪电符号标记切割位点。请点击此处查看该图的放大版本。

DNAzyme 处理凝胶电泳结果；25S 和 18S rRNA 条带；snR13、snR47 分析。
图 3：使用 10-23 和 8-17 DNAzyme 依赖性检测方法分析 25S rRNA 位点特异性 2’-O-甲基化。（A）使用 10-23 DNAzyme 分析 snR13 依赖性的 25S rRNA 甲基化。（B）使用 8-17 DNAzyme 分析 snR47 依赖性的 25S rRNA 甲基化。RNA 在变性琼脂糖凝胶中染色后进行可视化。裂解产物 A 和 B 用红色箭头标出。WT = 野生型菌株；GAL = 半乳糖，GLC = 葡萄糖。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

依赖脱氧核酶（DNAzyme）的消化可作为一种简单快速的方法，用于分析位点特异性的RNA 2’-O-甲基化12,13。当切割位点上游的核苷酸未被甲基化时，脱氧核酶即可切割RNA。与其他方法（如RNase H介导的消化、碱性降解，或在低浓度核苷酸条件下进行逆转录后结合定量PCR或测序）8,10,11,16相比，脱氧核酶方法仅需一条简单的DNA寡核苷酸以及分子生物学实验室中常见的基本试剂。此外，脱氧核酶还可用于类似地分析由H/ACA盒snoRNA介导的RNA假尿苷化12，这使其成为研究snoRNA靶标时的多功能工具。

DNA酶依赖性方法的适用范围仅受限于切割位点的共识序列17。10-23 DNA酶仅能用于分析RY二核苷酸中R位点的2’-O-甲基化，而8-17 DNA酶则可识别位于鸟嘌呤上游的核苷酸修饰。因此，诸如鸟嘌呤-腺嘌呤（GA）、腺嘌呤-腺嘌呤（AA）、嘧啶-腺嘌呤（YA）和嘧啶-嘧啶（YY）二核苷酸中第一个核苷酸的2’-O-甲基化等修饰则无法被检测。此外，还需考虑DNA酶依赖性切割效率较低的问题12。尽管某些DNA酶几乎能够完全切割RNA（图3B），但许多DNA酶仅能部分消化其靶标（图3B）。切割效率可能取决于切割位点周围的序列。例如，含有连续相同核苷酸的RNA区域可能影响DNA酶活性序列的正确结合位置。此外，形成强二级结构的RNA区域可能发生重新杂交，从而抑制DNA酶与靶序列的结合。为克服这些问题，可对10-23 DNA酶及其RNA底物进行反复的加热和冷却循环处理18。

我们采用DNA酶法来研究rRNA的2’-O-甲基化。也可  使用该技术分析其他RNA修饰，例如N6m⁶A（N6-甲基腺苷）19核糖体RNA由于含量丰富，可通过电泳进行分析，并在紫外光下直接观察其切割产物。然而，该方法不适用于丰度较低的RNA，如RNA聚合酶II生成的编码RNA（mRNA）和非编码RNA（ncRNA）。这类RNA通常无法通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中的RNA染色直接检测。在此类情况下，DNAzyme依赖性切割可通过Northern印迹法进行可视化，或通过PCR/定量PCR间接检测，也可利用能够区分2′-O-甲基化RNA与非甲基化RNA的聚合酶（例如KlenTaq DNA聚合酶）进行定量PCR分析。20,21.

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Maya Wilson 和 Aneika Leney 对本文手稿的审阅。本工作由惠康信托基金和英国皇家学会联合资助的亨利·戴尔爵士研究员项目（200473/Z/16/Z）支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学试剂
酸性酚SIGMAP4682
琼脂糖VWRA2114
乙酸铵SIGMAA1542
氯仿Fisher scientific10293850
无DNase/RNase水Fischer Scientific10526945
DNAzymeIntegrated DNA Technology定制寡核苷酸DNA
EDTASIGMAE9884
无水乙醇Fisher scientific10437341
甲醛SigmaF8775
甲酰胺sigmaF9037
半乳糖SIGMAG0750
上样缓冲液Thermo Fisher ScientificR0611
葡萄糖SIGMAG7021
糖原Thermo Fisher ScientificR0561
HEPESSIGMAH3375
异戊醇SIGMAW205702
KClSIGMAP9333
MgCl2SIGMAM8266
MnCl2SIGMA244589
MOPSSIGMAM1254
NaClSIGMAS7653
Oxoid蛋白胨（细菌培养用）Thermo Fisher ScientificLP0037
Oxoid酵母提取物粉末Thermo Fisher ScientificLP0021
RiboLock RNase抑制剂（40 U/µL）Thermo Fisher ScientificEO0382
SDSSIGMA74255
三水合乙酸钠SIGMAS8625
SYBR Safe DNA凝胶染料Thermo Fisher ScientificS33102
Tris碱SIGMATRIS-RO
名称公司货号备注
仪器设备
1.5 mL微量离心管Sarstedt
152VR5C01M -80°C超低温冰箱Thermo Fisher Scientific
250 mL锥形瓶Cole-Parmer
50 mL离心管Sarstedt
Combicup VX200涡旋振荡器Appleton Woods
DS-11微量分光光度计Denovix
电泳槽（20 cm托盘）SIGMA
FiveEasy F20 pH计Appleton Woods
凝胶成像系统Syngene
Heraeus Fresco 21微量离心机Fisher Scientific
Megafuge 8R离心机（配备适用于50 mL离心管的转子）Fisher Scientific
Mini Fuge Plus小型离心机Starlab
Mixer HC恒温金属浴Starlab
OLS26摇床水浴锅Grant
PowerPac电源供应器BioRad

参考文献

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DNAzyme RNA snoRNA RNA RNA RNA DNAzyme Saccharomyces cerevisiae
DNA酶依赖性分析rRNA的2'-O-甲基化
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