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方法文章

利用嗜热菌蛋白酶分离大鼠表皮与真皮以检测部位特异性炎症相关mRNA和蛋白质

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DOI：

10.3791/59708

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2021年9月29日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, Oklahoma State University Center for Health Sciences, 2Institute for Shock Physics, Washington State University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种分离表皮与真皮以评估炎症介质产生的实验方案。在发生炎症后，利用嗜热菌蛋白酶在 4 °C 条件下将大鼠后足掌的表皮与真皮分离。分离所得的表皮可用于通过 RT-PCR 进行 mRNA 分析，以及通过蛋白质印迹和免疫组织化学进行蛋白质检测。

摘要

在皮肤损伤、炎症和/或致敏过程中，需要简便且经济的技术来确定炎症介质和神经营养因子的部位特异性产生情况。本研究的目的是描述一种使用嗜热菌蛋白酶（thermolysin）进行表皮-真皮分离的方案，该蛋白酶在 4 °C 时具有活性。为说明该操作流程，采用 Sprague Dawley 大鼠，经麻醉后向其右侧后足掌注射角叉菜胶。注射后 6 小时和 12 小时，处死发生炎症的大鼠及未处理的对照大鼠，取后足无毛皮肤组织片段置于冰冷的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）中。随后，在含氯化钙的磷酸盐缓冲液（PBS）中，利用嗜热菌蛋白酶在基底膜处将表皮与真皮分离。接着用显微解剖镊固定真皮，轻柔地将表皮剥离。组织切片的甲苯胺蓝染色结果显示，表皮在基底膜处被干净地分离。所有角质形成细胞层均保持完整，表皮的钉突结构以及真皮乳头所形成的凹陷均清晰可见。采用定性及实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测神经生长因子（nerve growth factor）和白细胞介素-6（interleukin-6）的表达水平。最后通过蛋白质印迹法（Western blotting）和免疫组织化学染色检测神经生长因子的含量。本报告表明，低温条件下使用嗜热菌蛋白酶消化是一种有效的表皮与真皮分离方法，可用于炎症过程中 mRNA 和蛋白质变化的评估。

引言

由于炎症性真皮和表皮中存在多种不同类型的细胞，对皮肤来源的炎症介质和神经营养因子的检测可能受到限制1,2,3。近期已有综述总结了多种用于分离这两层组织或进行细胞解离以开展分析的酶学、化学、热力或机械技术4。酸、碱、中性盐和热处理可快速分离表皮与真皮，但常导致细胞及细胞外基质发生肿胀5,6。胰蛋白酶、胰酶、弹性蛋白酶、角蛋白酶、胶原酶、蛋白酶（pronase）、中性蛋白酶（dispase）和嗜热菌蛋白酶（thermolysin）等酶类已被用于表皮-真皮分离4,7。胰蛋白酶及其他广谱蛋白水解酶在37–40 °C条件下具有活性，但需严格监控以防止表皮层过度解离。中性蛋白酶（dispase）可在致密板（lamina densa）处切断表皮，但在低温条件下需要24小时才能完成分离4,8，而在37 °C时可缩短分离时间4,9。上述所有技术的一个局限性在于可能破坏组织形态，并导致mRNA和蛋白质完整性的丧失。

为了保持 mRNA 和蛋白质的完整性，皮肤分离操作应在低温下短时间内进行。在评估用于炎症研究的皮肤分离技术时，嗜热菌蛋白酶（thermolysin）是一种在低温条件下有效分离表皮与真皮的酶4。嗜热菌蛋白酶在 4 °C 具有活性，可切割基底膜透明层处的表皮半桥粒，使表皮与真皮在 1–3 小时内分离4,8,10。本报告的目的是优化嗜热菌蛋白酶在分离炎症大鼠表皮与真皮中的应用，以检测炎症介质和神经营养因子的 mRNA 及蛋白质水平。已有若干初步研究报告发表11,12,13,14,15。本文旨在描述一种使用嗜热菌蛋白酶进行皮肤分离的最佳技术，并展示在卡拉胶诱导炎症（C-II）大鼠表皮中检测以下成分的方法：1）炎症标志物；2）白细胞介素-6（IL-6）mRNA；以及 3）神经生长因子（NGF）mRNA 和蛋白质16,17。一项使用完全弗氏佐剂模型的初步报告表明，NGF 的 mRNA 和蛋白质水平在炎症早期即升高15。在小鼠中，通过局部涂抹唑酮致敏皮肤后，原位杂交显示 IL-6 mRNA 在早期上升36。IL-6 和 NGF 均已被证实参与 C-II18,19，但目前尚无研究报道在 C-II 急性阶段特异性来源于表皮的 IL-6 或 NGF 的 mRNA 或蛋白质水平。

蛋白酶thermolysin技术成本低廉且操作简便。此外，利用thermolysin将表皮与真皮分离，可在炎症过程中对炎症介质和神经营养因子进行mRNA、蛋白质印迹（western blot）以及免疫组织化学分析15。研究者可在皮肤炎症的临床前及临床研究中轻松应用该技术。

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方案

本方案遵循俄克拉荷马州立大学健康科学中心动物护理与使用委员会（IACUC）的动物护理指南（#2016-03）。

1. 卡拉胶诱导的炎症（C-II）

  1. 使用异氟烷（或注射用麻醉剂）对雄性和/或雌性Sprague Dawley大鼠（200–250 g；8–9周龄）进行麻醉。
  2. 通过轻触角膜并轻轻夹捏左侧后肢足掌来检查麻醉深度。当动物达到适当麻醉状态时，角膜和足掌均无反应。
  3. 在右侧无毛后足掌皮下注射100 µL含1%（w/v）λ-卡拉胶的磷酸盐缓冲液（PBS），然后让大鼠完全从麻醉中恢复20。
    1. 确保使用适当的对照组，例如本研究中未使用异氟烷的正常大鼠。初步研究表明，无论是否使用异氟烷，正常大鼠表皮IL-6和NGF的基础表达水平相同。
      注：对于炎症研究，推荐使用正常大鼠作为对照，因为皮下注射生理盐水或PBS可引起局部炎症23,37。
  4. 在6–12小时时间点，用CO2处死大鼠，并用游标卡尺测量后足跖部厚度。用锋利的手术刀切取1 mm × 2 mm大小的无毛后足皮肤组织。如果皮肤上有毛发 ，在切取皮肤前应先剃除该区域毛发。
    注：请根据具体研究选择合适的时间点。
  5. 使用显微解剖镊子将皮肤组织转移至预冷的微量离心管中，管内含1 mL冰冷的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），置于冰上保存15–60分钟。

2. 胶原酶分离表皮和真皮

  1. 准备并活化嗜热菌蛋白酶（thermolysin）。
    1. 通过将 5 mg 来自嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）的嗜热菌蛋白酶加入 10 mL、pH = 8 的磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制嗜热菌蛋白酶溶液（浓度为 500 µg/mL）。
    2. 将 1.11 g 无水氯化钙（CaCl2）溶于 10 mL 蒸馏 H2O 中，配制 1 M 的氯化钙溶液。
    3. 为防止嗜热菌蛋白酶自溶，向 10 mL 嗜热菌蛋白酶溶液中加入 10 µL 氯化钙溶液，最终氯化钙浓度为 1 mM。
    4. 将 1 mL 活化的嗜热菌蛋白酶溶液分装至预冷的 24 孔细胞培养板的 10 个孔中，置于冰上备用。
  2. 利用嗜热菌蛋白酶消化法分离表皮与真皮。
    1. 使用显微解剖镊子将一块皮肤样本转移至含有活化嗜热菌蛋白酶的孔中。注意不要将皮肤完全浸入嗜热菌蛋白酶溶液中。
    2. 轻轻敲击孔壁，帮助皮肤样本从镊子上脱离，并漂浮于嗜热菌蛋白酶溶液表面。
    3. 使皮肤漂浮时角质层（stratum corneum，即表皮外层）朝上，真皮面朝下。确保真皮面朝下至关重要，否则无法实现有效分离。
      注意：嗜热菌蛋白酶孵育时间需由使用者根据经验确定。通常，来自 Sprague Dawley 大鼠（200–250 g，8–9 周龄）的无毛后足皮肤分离所需时间为 2.0–2.5 小时。孵育时间会因物种和年龄不同而有所变化。
    4. 在适当的孵育时间后，使用显微解剖镊子将一块皮肤样本转移至含 7–8 mL 冷（4 °C）DMEM 的 6 孔细胞培养板的一个孔中，以便为表皮与真皮的进一步分离提供更大空间。
    5. 将皮肤完全浸入 DMEM 中。
    6. 用镊子沿皮肤边缘轻轻刷动表皮，直至在边缘处观察到近乎透明的表皮层。若未能实现此效果，应将皮肤样本重新放回嗜热菌蛋白酶溶液中继续孵育 15–30 分钟。
    7. 一旦观察到表皮明显与真皮分离，即用显微解剖镊子分别夹住表皮和真皮，缓慢而小心地将表皮从真皮上剥离。
    8. 评估分离所得表皮的透明度，并确保其光学特性均匀一致。参见 图 2 中大鼠表皮（1 mm × 2 mm）样本示例。若透明度不均，则表明分离未成功。
  3. 使用乙二胺四乙酸（EDTA）对已分离的表皮和真皮片段中的嗜热菌蛋白酶进行灭活。
    警告：残留在表皮和真皮中的嗜热菌蛋白酶仍具有活性，若不及时灭活，可能对组织层造成损伤。
    1. 配制 0.5 M EDTA 储存液：将 0.93 g EDTA 缓慢加入 5 mL 双蒸水中，边加边搅拌。随后逐滴加入氢氧化钠，直至溶液澄清。确保溶液 pH 值约为 8.0。
    2. 在 DMEM 中配制 5 mM EDTA 工作液：将 0.25 mL 的 0.5 M EDTA 储存液加入 25 mL DMEM 中混匀。
    3. 将分离后的表皮和真皮置于 4 °C 的 5 mM EDTA/DMEM 溶液中孵育 30 分钟，以彻底抑制嗜热菌蛋白酶活性。
  4. 采用染色组织学方法评估表皮结构8,9,10。
    1. 取部分表皮组织，置于 10% 中性福尔马林、4% 多聚甲醛或含 0.8% 苦味酸的 0.25% 多聚甲醛溶液中，在室温（RT）条件下振荡固定 1 小时。
    2. 将固定后的表皮转移至含 10% 蔗糖的 PBS 溶液中，室温振荡处理 1 小时。
    3. 将表皮包埋于组织包埋介质中并冷冻，使用恒冷切片机（cryostat）切取 14 µm 厚的横切面，并将切片贴附于明胶包被的载玻片上。
    4. 将切片置于载片加热器上干燥，随后用甲苯胺蓝工作液（TB；1% 氯化钠溶液中的 10% 甲苯胺蓝）染色 90 秒，最后用水溶性封片剂封片。
    5. 在明场显微镜下以 50x–250x 放大倍数观察表皮结构。
      注意：若分离成功，表皮将与真皮清晰分离，并可观察到五层结构：基底层（stratum basale）、棘层（stratum spinosum）、颗粒层（stratum granulosum）、透明层（stratum lucidum）和角质层（stratum corneum）。分离后的大鼠皮肤表皮示例见 图 3。

3. 蛋白质提取与蛋白质印迹分析

  1. 采用先前发表的方案21对分离的组织样本进行蛋白质印迹分析。
  2. 在含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物的50 μL裂解缓冲液（25 mM Tris HCl，pH = 7.4，150 mM NaCl，1 mM EDTA，5%甘油和1% Triton X-100）中匀浆表皮组织。
  3. 在4 °C条件下以最大转速离心15分钟，使用蛋白检测试剂盒测定上清液中的蛋白浓度。
  4. 将等量蛋白（30 µg）上样至SDS凝胶，进行电泳，随后将蛋白转移至硝酸纤维素膜或PVDF膜。
  5. 用5%脱脂牛奶封闭膜2小时，然后在一抗（小鼠抗NGF抗体，E12，1:1000稀释）中4°C孵育过夜。
  6. 用含0.3% Tween的PBS洗涤3次，每次10分钟，随后与标记的二抗（如碱性磷酸酶标记的兔抗小鼠IgG）孵育。
  7. 使用扫描系统检测蛋白质印迹信号（如ECF底物和成像平台）。

4. 免疫组织化学

  1. 将组织样本置于固定液中以获得最佳免疫反应性：0.96% (w/v) 苦味酸和 0.2% (w/v) 甲醛溶于 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH = 7.3）21,22,23，室温下固定 4 小时。随后转移至含 10% 蔗糖的 PBS 溶液中，4 °C 过夜。
  2. 对组织切片进行标准免疫组织化学染色21,22,23。
  3. 将动物表皮组织包埋于单一冷冻包埋剂中，使用恒冷切片机切取 10–30 µm 厚的切片。将切片贴附于明胶包被的玻璃载玻片上，37 °C 干燥 2 小时。
  4. 用 PBS 洗涤切片三次，每次 10 分钟，然后在含 0.3% (w/v) Triton X-100 的 PBS（PBS-T）中加入 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.5% 聚乙烯吡咯烷酮（PVP），稀释一抗血清（例如：小鼠抗 NGF 抗体 E12，1:2000；兔抗蛋白基因产物 9.5 抗体 PGP 9.5，1:2000），于该溶液中孵育 24–96 小时。
  5. 一抗孵育后，用 PBS 洗涤切片三次，每次 10 分钟，随后在室温下用 Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG（1:1000）和 Alexa Fluor 555 驴抗小鼠 IgG（1:1000）的 PBS-T 溶液孵育 1 小时。
  6. 用 PBS 洗涤切片三次，每次 10 分钟，然后用抗荧光淬灭封片剂封片，以延缓免疫荧光信号的衰减。

5. RNA 提取与 cDNA 合成

  1. 对皮肤样本进行标准的逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）21。使用苯酚、异硫氰酸胍溶液提取总RNA。
  2. 利用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶进行互补DNA合成。
  3. 使用以下引物序列扩增NGF和IL-6：
    NGF（正义链）- GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
    NGF（反义链）– GTGAGTCCTGTTGAAGGAGATTGTACCATG
    IL-6（正义链）- GCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGC；
    IL-6（反义链）– GTAGAAACGGAACTCCAGAAGACCAGAG
  4. 将NGF和IL-6 mRNA的表达水平与内参基因β-actin进行比较：
    β-ACTIN（正义链）- TGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTATG
    β-ACTIN（反义链）– GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA
  5. 使用PCR仪进行定性RT-PCR分析，并使用qRT-PCR系统进行定量实时PCR（qRT-PCR）检测。

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结果

向大鼠后爪注射角叉菜胶可引起典型的炎症症状，如红肿和水肿16,17。使用机械卡尺测量后爪的肿胀程度20。在注射角叉菜胶前，记录每只大鼠后爪厚度的基线值，并在注射后6小时和12小时再次测量。与基线值相比，后爪厚度显著增加（图1）。

将大鼠无毛后足皮肤与嗜热菌蛋白酶（thermolysin）孵育后，获得了表皮层组织片。采用明场显微镜评估嗜热菌蛋白酶分离表皮与真皮的效果（图2）。通过高倍镜下对组织片进行逐层聚焦，可分辨表皮的各层结构。表皮横切面的甲苯胺蓝染色显示，表皮在基底膜处与真皮成功分离（图3）。表皮嵴（表皮钉突）以及来自真皮乳头的凹陷结构均保持完整，所有角质形成细胞层均清晰可见。

在4 ...

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讨论

该研究确定，使用含1 mM氯化钙的PBS缓冲液配制0.5 mG/mL嗜热菌蛋白酶，在4 °C条件下孵育2.5小时，可轻松将大鼠后足无毛皮肤的表皮与真皮分离。组织学评估表明，表皮与真皮在基底膜处分离，且表皮的真皮乳头结构保持完整。嗜热菌蛋白酶是一种由革兰氏阳性菌（Geo）Bacillus thermoproteolyticus24分泌的胞外金属内肽酶。该酶在4 °C时活性稳定，且在较宽的温度范围内均具有功能10,24,25。该酶已广泛应用于蛋白质化学研究24,25，同时多个研究团队已证实其可用于将皮肤分离为表皮和/或真皮片层4,8...

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致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH-AR047410，KEM）提供资助

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
λκ-卡拉胶Millipore Sigma22049皮下注射角叉菜胶可诱导炎症
7500 Fast 实时荧光定量 PCR 系统赛默飞世尔科技4351107用于 RT-PCR 分析
无水氯化钙（CaCl2）默克生命科学499609防止嗜热菌蛋白酶自溶
Crystal Mount 水性封片介质Millipore SigmaC0612甲苯胺蓝染色后水溶性封片介质
驴抗小鼠Alexa Fluor 555赛默飞世尔科技A-31570免疫组织化学用二抗
驴抗兔IgG，Alexa Fluor 488赛默飞世尔科技A-21206免疫组织化学用二抗
杜尔贝科改良伊格尔培养基赛默飞世尔科技11966-025为了保持组织完整性
乙二胺四乙酸Millipore SigmaE6758终止嗜热菌蛋白酶反应
莫洛尼鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶PromegaM1701用于互补DNA合成
小鼠抗NGF抗体（E-12）Santa Cruz Biotechnologysc-365944用于神经营养因子免疫组织化学
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂赛默飞世尔科技P36930为减缓免疫荧光淬灭
兔抗 PGP 9.5Cedarlane LabsCL7756AP用于表皮内神经染色
SAS Sprague Dawley 大鼠查尔斯河实验室菌株编号 400用于炎症研究的动物
Shandon M-1 包埋介质赛默飞世尔科技1310TS用于染色和免疫组织化学的组织包埋基质
SimpliAmp 温控循环仪赛默飞世尔科技A24811用于RT-PCR分析
SYBR Select Master Mix赛默飞世尔科技4472908用于RT-PCR分析
嗜热菌蛋白酶Millipore SigmaT7902来自嗜热脂肪地芽孢杆菌
甲苯胺蓝默克生命科学89640用于明场显微镜观察的染色
TRIzol试剂赛默飞世尔科技15596026用于RT-PCR的总RNA提取

参考文献

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利用嗜热菌蛋白酶分离大鼠表皮与真皮以检测部位特异性炎症相关mRNA和蛋白质
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