从前列腺癌的遗传工程小鼠模型生成肿瘤有机体

摘要

介绍了一种小鼠前列腺癌模型的尸检和解剖方法,重点是前列腺肿瘤解剖。提出了小鼠前列腺肿瘤器官生成分步方案。

摘要

基于同源重组来修饰基因的方法大大推进了生物学研究。基因工程小鼠模型(GEMM)是研究哺乳动物发育和疾病的严格方法。我们的实验室已经开发出几个前列腺癌(PCa)的GEMM,这些GemM缺乏使用位点特异性Cre-loxP重组酶系统和前列腺特异性促进剂表达的一个或多个肿瘤抑制基因。在本文中,我们将介绍我们这些PCa GEMM的尸检方法,主要侧重于小鼠前列腺肿瘤的解剖。过去十年开发的新方法促进了上皮衍生细胞的培养,以三维在体外模拟器官系统。我们还详细介绍了一种3D细胞培养方法,用于从小鼠PCa GEMM生成肿瘤器官。临床前癌症研究一直以二维细胞培养和细胞系衍生或患者衍生异种移植模型为主。这些方法缺乏肿瘤微环境,这是临床前使用这些技术的限制。GEMM 在生理上更相关,有助于了解肿瘤发生和癌症进展。肿瘤有机体培养是一种体外模型系统,可概括肿瘤结构及细胞系特征。此外,3D细胞培养方法允许正常细胞的生长,以便与肿瘤细胞培养进行比较,使用2D细胞培养技术很少可能。结合在临床前研究中使用 GEMM 和 3D 细胞培养,有可能提高我们对癌症生物学的理解。

引言

自20世纪80年代末以来,通过同源重组来改变基因的能力极大地推动了生物^系统1的研究。诱导、组织或细胞特异性的推进系统和位点特异性重组酶,如Cre-loxP,通过促进对基因修饰的时空控制,2、3^{、 4}.这些基因策略的结合创造了广泛的实验模型系统5,6,7。

基因工程小鼠模型(GEMMs)是评估单个基因或基因组如何影响哺乳动物发育和疾病的一个整体工具。在临床前癌症研究中,GEMM是研究癌症发展、进展和治疗的最具有生理相关性和严谨性^的方法。我们的实验室专门生产癌症 GEMM 并将其定性。

在美国男性中,诊断出最高度的非皮癌是前列腺癌(PCa)。大多数 PCa 患者患有低风险疾病和高生存可能性,但当疾病在晚期诊断或有针对性的激素治疗导致进展到侵略性、不可治愈的 PCa 时,存活率急剧下降子类型^9,10.我们的实验室已经开发出利用一个或多个肿瘤抑制基因的絮状等位基因的GEMM。肿瘤抑制基因表达的重组和丧失特别发生在前列腺,因为我们引入了一个转基因与Cre重组酶下游的前列腺启动子只激活在前列腺上皮^细胞11,12.我们还培育了我们的 GEMM,以包含一种称为mT/mG的 Cre 报告者转基因,该转基因在缺乏 Cre 和绿色荧光蛋白 (GFP) 表达的细胞中诱导番茄荧光蛋白表达,在 Cre¹³的细胞中。虽然这种方法的介绍和我们具有代表性的结果表明,我们在实验室中研究的GEMM,该协议可用于从任何小鼠模型生成前列腺癌有机体。然而,正如我们在代表性结果部分详细讨论的那样,我们已经观察到某些肿瘤特征是前列腺癌有机体生成的最佳选择。

在过去的十年里,从上皮源组织培养细胞的新方法使我们在体外器官系统模型的能力上有了重大^进步。术语"3D细胞培养"被归因于参与建立和维护器官的技术,一般可以定义为由细胞组成的结构,这些细胞由器官特异性细胞系驱动的二次结构驱动特征¹⁶.这些新方法不同于经典的二维细胞培养,因为细胞不需要转化或永生,无法长期生长;因此,正常细胞的3D培养可以与病变细胞进行比较。这在癌症研究中特别有价值,因为通常没有正常的细胞控制培养物。此外,有机体自发地形成具有适当分化细胞类型的二次组织架构,使它们成为比2D细胞系17更好的模型系统来理解体外癌症。我们的实验室从从我们的 PCa GEMM 中分离出肿瘤问题的 3D 有机体线,以补充我们的体内数据,并进行在 GEMM 中不可行的实验。

在本文中,我们提出了PCa GEMM的完整尸体解剖的书面和视觉协议,包括解剖不同的小鼠前列腺叶和转移性病变。我们描述并展示了一种从小鼠前列腺肿瘤中产生器官的分步方法,该方法基于Drost等人先前发表的从正常小鼠前列腺上皮^组织18中衍生器官的规程。

方案

此处描述的动物程序是经纽约布法罗罗斯威尔公园综合癌症中心实验室动物资源部机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准进行的。

注:雄性小鼠被解剖以分离前列腺或前列腺肿瘤,以生成器官应至少达到性成熟年龄 - 约8-10周的年龄。小鼠的特定年龄可能因研究而异。选择年龄时需要考虑的一些因素包括前列腺细胞群的年龄依赖性变化、特定启动子驱动Cre转基因的年龄依赖性表达以及特定GEMM中前列腺肿瘤进展率。

1. 小鼠前列腺肿瘤和转移性肿瘤的解剖和成像

1. 准备
   1. 获取必要的无菌解剖工具。在清洁无菌表面上的阶段解剖区域,具有 15 厘米尺子、精密平衡、分析平衡、70% 乙醇喷雾瓶、磷缓冲盐水 (PBS) 和纸巾。
   2. 为内脏器官和骨骼制备固定溶液,不用于器官生成
      1. 内脏器官:在PBS中制备4%的甲醛(PFA)。对于一只小鼠,将 20 mL 的 PFA、等分放入两个 15 mL 锥形管中,并保持在室温下直到使用。
      2. 长骨:在一个15 mL锥形管中预造10%中性缓冲形式(NBF),并保持在室温下,直到使用。
   3. 获得未经处理的10厘米的菜肴,并充满非无菌PBS - 这些将作为器官在精细解剖期间使用解剖显微镜的临时容器。
      注:无菌工具用于解剖组织以生成器官。非无菌工具用于后肢的初始切口和解剖。
2. 安乐死和初始切口
   1. 使用 2.0 L/min 流速将小鼠安乐死,使用 2.0 L/min 流速 5 分钟。将小鼠从笼子中取出并进行宫颈脱位。 使用精确平衡测量鼠标的体体重和记录。
   2. 将鼠标放在纸巾的顶部,并朝上解剖表面的通风面,鼠标头朝上远离调查员。将鼠标固定在板上,伸展四肢,用一根一次性针头刺穿每个前爪和后爪。
   3. 使用喷雾瓶,用70%乙醇来涂鼠皮毛。使用非无菌解剖剪刀和直钳,捏在鼠标的阴茎正上方,并只通过毛皮进行小切口。
   4. 仅通过毛皮将切口中线向上至小鼠颈部。使双边切口从初始切口点通过鼠标的腹腔平面通过毛皮。
   5. 抓住毛皮,小心地把它从老鼠的皮肤上拉开。将毛皮固定到板上,以便进入腹部和胸腔。
3. 男性泌尿生殖系统群的提取
   1. 使用无菌解剖剪刀和直钳,小心地穿过直肠上方约0.75厘米的皮肤。继续切口中线至肋骨,不干扰腹腔内的任何器官。小心地拉开皮肤,将针固定在板上,露出整个腹腔。
      注:不要让这些仪器接触鼠标外部或过渡区域的任何表面,因为这些组织将用于生成有机物。
   2. 根据图1A中的图表,解剖泌尿生殖系统和其他器官,用数字表示器官从小鼠中取出的顺序。
   3. 找到膀胱,然后抓住脂肪垫到左侧或右侧,向上拉暴露睾丸。小心地解剖睾丸从泌尿生殖器区域的其余部分,并放在一边。对另一侧执行相同的步骤。
      注:实现前列腺肿瘤的最佳组织质量和详细的肿瘤表征要求从小鼠群中去除整个泌尿生殖区域。建议首先去除泌尿生殖区域(图1A)。
   4. 抓住膀胱,小心拉起,使泌尿生殖区域一起抬起,露出下面的尿道。在握住膀胱时,将剪刀定向,使其对背前列腺的底面,并切断尿道。然后,整个泌尿生殖区域将从腹腔中释放。
   5. 将泌尿生殖区域放入一个 10 厘米的充满 PBS 的盘子中。如果仍然充满尿液,通过做一个小切口排空膀胱。使用分析平衡,称量泌尿生殖系统并记录。
4. 骨盆淋巴结、脾脏、肝脏、肾脏、肺、头骨和股骨的提取
   1. 去除泌尿生殖系统暴露骨盆淋巴结,位于泌尿生殖系统(图1A)后面和脊柱两侧。淋巴结只有在含有转移性病变或局部炎症时才可见。将直钳定向到淋巴结下方,然后向上拉以移除淋巴结。对另一侧执行相同的步骤。
   2. 用直钳抓住直肠并切割。拉动直肠,解开整个结肠和小肠,寻找肠淋巴结的转移性病变。当整个回肠被移除时,继续拉上十二指肠以暴露胃部。切食道,完全切除胃并丢弃。如果观察到淋巴结中有任何转移性病变,请仔细解剖远离肠道,并储存在 10 厘米的 PBS 盘中。
   3. 暴露和取出胃会从腹部的背侧拉出脾脏(图1A)。取出脾脏,放入4%PFA中。脾脏作为肝素的染色控制,因为它是高细胞。
      注:不用于器官生成的内脏组织将在4%PFA中过夜,用PBS洗涤,然后放入70%乙醇中。
   4. 切除腹部上部的肝脏 (图 1A)。根据肝脏的转移载荷,可以解剖单个叶,或者通过沿着隔膜仔细切割切除整个肝脏。(此时不要穿过隔膜)。将肝脏放入 10 厘米的 PBS 盘中。
   5. 切除肝脏将完全暴露脊柱两侧的肾脏 (图 1A)。将直钳放在肾脏下方并拉起,取出肾脏 - 以及肾淋巴结,如果结点有转移性病变。对另一侧执行相同的过程。
   6. 要暴露胸腔,请沿着肋骨小心地切下隔膜。穿穿隔膜会释放胸腔中的负压,并暴露心脏和肺部(图1A)。
   7. 抓住胸骨,向上拉,以进一步打开胸腔。观察胸腔沿肋骨笼的腹腔面,在胸淋巴结中转移性病变,并解剖(如果存在)。
   8. 在保持胸骨的同时,切断腹腔肋骨笼以进入心脏和肺部。抓住心脏,拉起肺底,切开肺底。要完全切除心脏和肺部,切掉所有前血管和气管。将组织置于PBS中,小心地取出心脏,而不会损伤肺组织或肺转移病变。
   9. 采取非无菌直钳和解剖剪刀,并削减股骨头部的后腿。小心地抓住股骨,从毛皮上取下后腿。
   10. 将后腿放在纸巾上,抓住后爪。使用单刃剃刀刀片从头骨和股骨中刮走/切掉所有肌肉和结缔组织。将后骨切到骨节,从股骨中取出股骨,然后取出后爪,取出骨骨。将头骨和股骨放入 10% NBF 中。对另一侧执行相同的步骤。
       注:为了检查小鼠的长骨转移性病变,纤维瘤不需要完好无损。长骨将固定在10%NBF中一周,然后用中性EDTA^溶液20进行去化。三周后,骨骼将转移到70%乙醇。
   11. 去除后肢后,采取耳朵或尾巴切割为未来的基因分型。丢弃小鼠尸体和所有不固定或用于有机物生成的组织。
5. 前列腺肿瘤切除
   注:小鼠前列腺瓣的解剖只能通过解剖^显微镜19实现。然而,前列腺肿瘤负荷可能很高,以至于单个叶无法分辨,并且无需显微镜即可进行解剖。然而,每个前列腺瓣的切除的完整方案如下所述。
   1. 将泌尿生殖区域置于 10 厘米的 PBS 中 , 置于解剖显微镜下 , 将腹腔侧朝上 , 使膀胱和囊朝离调查员。所有对泌尿生殖区域的操作都应使用无菌仪器进行。
   2. 评估前列腺肿瘤的一般表型 - 最有可能的是,在PCa GEMM中观察到充满液体或固体肿瘤的肿瘤(图2A,B)。
      注:充满液体的肿瘤通常位于前前列腺区域(图2A)。充满液体的肿瘤主要由结缔组织组成,上皮成分很少,因此,由于肿瘤上皮细胞数量少,这些肿瘤不是器官生成的最佳选择,这一点将在代表性结果中讨论。部分。
   3. 如果存在充满液体的肿瘤,在肿瘤中戳一个小孔。将泌尿生殖区域放在新的 10 厘米的 PBS 盘中。
   4. 在非主导手上拿一对直钳,在主导手中弯曲的钳子。将泌尿生殖区域翻转到其背面。寻找近端前列腺区域(图1B),可以通过尿道的粉红色/红色来识别。抓住尿道,并紧紧抓住,以便用弯曲的钳子操纵泌尿生殖道组织。
      注:在前列腺解剖过程中,始终注意膀胱的位置,因为这是找到单个前列腺叶的最简单方法(图1B)。
6. 从泌尿生殖区域去除非前列腺组织
   1. 虽然仍然在泌尿生殖区域的背面,找到精囊的基础。小心地取出精囊并丢弃。在对方执行相同的步骤。
      注:避免刺穿精囊,因为这将释放粘性和不透明的分泌液,干扰前列腺解剖。如果精囊被刺穿,将剩余的泌尿生殖区域转移到新的10厘米的新鲜PBS盘中。
   2. 使用钳子的弯曲侧,取出并丢弃血管递延和尽可能多的脂肪和结缔组织。
   3. 虽然仍然牢牢地持有尿道/近端前列腺区域,使用一对细,尖剪刀从尿道去除膀胱。
7. 个别前列腺叶的分离
   1. 找到前前列腺 (图 1B).确保用直钳牢固地抓住近端前列腺区域/尿道。通过直接抓住组织,用钳子的弯曲侧,并坚定地将其从膀胱和前列腺的其余部分拉开,去除前前列腺区域。将组织放入PBS中。
      注:对于所有前列腺区域,可能需要解剖剪刀来切除组织,具体取决于肿瘤的大小。
   2. 找到腹腔前列腺区域 (图 1B) .以与步骤 1.5.7 相同的方式切除腹腔前列腺区域。
   3. 在解剖的这一点上,只应存在侧侧和背前列腺区域,而近端前列腺区域仍然被直钳抓住。评估侧和背前列腺区域 (图1B)。如果横向区域可以与背区域区分,请切除步骤 1.5.7 中所述的侧前列腺区域。在对方执行相同的步骤。
   4. 如步骤 1.5.7 所述,切除背前列腺区域。将近端前列腺区域置于4%PFA中,因为它的结构在尿道的肌肉组织内,使其不适合器官生成。

2. 从前列腺肿瘤组织生成3D有机体

注:图3显示了肿瘤器官生成过程的图片描述。

1. 制备
   1. 根据Drost^等人18号准备小鼠前列腺器官介质,进行以下改变。使用条件介质代替对诺金和R-Spondin的重组蛋白,并使用1%的最终浓度(v/v),而不是10%,对诺金和R-Spondin条件介质。
      注:HEK293细胞通过HA-小鼠Noggin-Fc或HA-小鼠Rspo1-Fc稳稳地转染,分别用于生产诺金或R-Spondin-条件介质。这些细胞系是斯坦福大学卡尔文·郭实验室的礼物。
   2. 将20mg/mL胶原酶II稀释至5mg/mL的最终浓度,在15 mL管中制备消化溶液,在最终浓度为10μM的胶原酶II溶液中加入Y-27632岩石抑制剂。
      注:消化缓冲液与组织的比率是1 mL到50mg,根据Drost^等人18使用。
2. 肿瘤组织的分块和消化
   1. 在细胞培养罩中,将前列腺肿瘤组织放入无菌的10厘米培养盘中,解剖并丢弃坏死组织。
   2. 用无菌弯曲钳将剩余的前列腺肿瘤组织切成1^毫米3块,用无菌弯曲的钳子将组织块切成小块,用解剖剪刀切割。
   3. 将切碎的肿瘤片与消化缓冲液一起放入15 mL管中,用钳子的弯曲侧将其铲起。在37°C下消化肿瘤组织,摇动1.5至2小时。每20分钟检查消化进度。
      注:此时,从 -20°C 储存中拿出至少 2 mL 的基质,并在冰上解冻。1 mL 等分矩阵大约需要 3 小时才能解冻。
   4. 组织消化后,离心管在175 x g下5分钟,在4°C下形成细胞颗粒。
   5. 去除上清液,轻拂管以松开细胞颗粒,并将细胞颗粒重新悬浮在1 mL的预加热胰蛋白酶中,辅以10μM Y-27632岩石抑制剂。将管子放入 37°C 水浴中 5 分钟。
   6. 孵育后,使用标准 P1000 吸头上下移器 5 次。将管返回到 37°C 水浴 5 分钟,并重复步骤 2.2.6。
      注:此时,在手术过程中,将无菌的 6 孔细胞培养皿放入 55°C 培养箱中加热。
3. 计算细胞和在矩阵中的重新悬浮
   1. 通过加入9 mL的冷AdMeM/F12(+)清洗细胞,并在4°C下以175 x g离心管5分钟。
   2. 离心后,取出上清液,轻拂管子以松开颗粒,然后加入10 mL的冷AdDMEM/F12(*),再次清洗细胞。在 4°C 下在 175 x g下将管离心 5 分钟。
   3. 离心后,取出上清液,轻拂管以松开颗粒,将细胞重新悬浮在 AdDMEM/F12(*) 的 1 mL 中,并根据标准程序使用血细胞计计算细胞数量。
   4. 七至八个圆顶适合在6孔盘的一个井,当有机物通过滴感的方式在基质中镀。约200μL的基质将产生7-8个圆顶。决定将来实验需要多少口有机物,并计算所需的基质体积。然后,计算最终浓度为1.0 x 10⁶细胞/mL的基质所需的含细胞溶液的体积。
   5. 计数细胞后,在4°C下以175 x g离心5分钟。取出上清液,轻拂管以松开颗粒,然后以步骤 2.3.4 中计算的基质体积重新悬浮细胞。
      注:基质仅在4°C处保持液态;随时将基质库存管和基质细胞溶液保存在冰上。
4. 电镀矩阵圆顶及介质的应用
   1. 将基质细胞溶液与 P200 移液混合,以均匀分布细胞,而不会引入气泡。从 55°C 培养箱中取出 6 口培养皿。
   2. 小心移液200 μL的基质细胞溶液,并迅速将溶液放入井中,以创建圆顶。
   3. 重复步骤 2.4.2。直到使用大量基质细胞溶液。让圆顶在室温下凝固2分钟。
   4. 倒置6口盘,将盘子放入37°C培养箱中,继续凝固20分钟。
   5. 孵育后,在每个井中加入2 mL的小鼠前列腺器官介质。将合成雄激素R1881添加到每口井中,最终浓度为1 nM,Y-27632岩石抑制剂的最终浓度为10 μM。仔细混合,将盘子放在37°C的培养箱中进行培养。
      注:有机体培养基在有机体生成后仅需10μM Y-27632岩石抑制剂进行补充。

结果

图2A显示了在前前列腺区域带有大量充满液体的原发性前列腺肿瘤的小鼠的代表性尸检图像。相比之下,图2B显示了具有代表性的小鼠的尸检图像,其前列腺肿瘤较大,个别前列腺区域无法区分。荧光解剖图像显示相同的固体前列腺肿瘤从图2B表达GFP,表明肿瘤细胞表达Cre(图2C)。不表达蛋白盆的组织,如膀胱,表达番茄,因此不表达Cre(图2C)。图2B中的小鼠的肝脏和肺具有表达GFP的转移性肿瘤,表明它们来自原发性前列腺肿瘤,并且被表达番茄的正常组织包围(图...

讨论

前列腺肿瘤切除和器官生成协议中的关键步骤
去除非前列腺组织和小鼠前列腺肿瘤的精细解剖对于癌症器官的最佳生成至关重要,因为非前列腺上皮细胞和正常的前列腺上皮细胞都会生成有机体。特别是对于固体前列腺肿瘤,分离活肿瘤区域以去除坏死组织的污染至关重要,这样可以减少活细胞的数量。在有机物生成期间,应努力监测胶原酶的组织消化,因为长时间接触胶原酶会限制细胞活力。对于从癌症 GEMM 衍生的有机体,关键是要完全基因型每行,以确保小鼠中设计的所有转基因和修饰等位基因都存在于有机体中。在长期传血后重复基因分型也是必要的,以确保遗传修饰得到维持。

前列腺肿瘤切除和器官生成的修改与故障排除
我们观察到小鼠对小鼠前列腺肿瘤特征的变异性,即使在基因型相同的动物中也是如此。因此,对于每只小鼠来说,可能需要对此处描述的前列腺解剖方案进行具体修改。此外,在解剖转移性肿瘤时,适应性是必要的,因为在开始解剖之前很难预测这些病变的严重程度。

有几次,我们观察到我们的细胞颗粒与结缔组织的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶 + 2.21 mM EDTA	Sigma	25-053
1 1/4 英寸，23 G，一次性注射器针头	Becton Dickinson	Z192430
10% 中性缓冲福尔马林	Sigma	HT501128
32% 多聚甲醛	电子显微镜服务	15714
A83-01	MedChemExpress	HY-10432
高级 DMEM/F12+++	Gibco	12634
分析天平	梅特勒-托利多	30216623
B27 （50x）	Gibco	17504044
胶原酶 II	Gibco	17101015
解剖板	Thermo-Fisher	36-1
EHS 肉瘤基质，Pathclear 批次#19814A10	由 Trevigen 制造	从弗雷德里克国家癌症研究所申请	癌症研究所资助的持有人可以申请基质
HEPES （1 M）	Sigma	25-060
人重组表皮生长因子 （EGF）	PeproTech	AF-100-15
L-谷氨酰胺 （200 mM）	Sigma	25-005
N-乙酰基-L-半胱氨酸	Sigma	A9165
青霉素-链霉素	Sigma	P4333
精密天平	梅特勒-托利多	30216561
手术刀 #23	世界精密仪器	504176
手术刀手柄 #7,16 厘米	世界精密仪器	500238
单刃碳剃须刀片	费舍尔布兰德	12-640
不锈钢解剖剪刀，10 厘米，直	世界精密仪器	14393
不锈钢虹膜镊子，10 厘米，弯曲尖端，锯齿状	世界精密仪器	15915
不锈钢 Nugent 实用镊子，直尖，锯齿	世界精密仪器	504489
Y-276632（岩石抑制剂）	APExBIO	编号 A3008