我们展示了一种用于小鼠前列腺癌模型的尸检及解剖方法，重点介绍前列腺肿瘤的分离。同时提供了一步一步建立小鼠前列腺肿瘤类器官的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
基于同源重组的基因修饰方法极大地推动了生物学研究。基因工程小鼠模型（GEMMs）是研究哺乳动物发育和疾病的一种严谨方法。本实验室已利用位点特异性Cre-loxP重组酶系统结合前列腺特异性启动子，建立了多种缺失一个或多个肿瘤抑制基因表达的前列腺癌（PCa）GEMMs。本文描述了这些PCa GEMMs的尸检方法，重点在于小鼠前列腺肿瘤的解剖。过去十年中发展出的新技术促进了上皮来源细胞的三维体外培养，以模拟器官系统。我们还详细介绍了从小鼠PCa GEMMs中建立肿瘤类器官的三维细胞培养方法。临床前癌症研究长期以来主要依赖二维细胞培养以及细胞系来源或患者来源的异种移植模型。这些方法缺乏肿瘤微环境，限制了其在临床前研究中的应用。相比之下，GEMMs在理解肿瘤发生和癌症进展方面具有更高的生理相关性。肿瘤类器官培养是一种体外模型系统，能够重现肿瘤的结构特征和细胞谱系特性。此外，三维细胞培养技术还允许正常细胞的生长，从而可与肿瘤细胞培养物进行比较分析，而这一点在二维细胞培养技术中极难实现。综合而言，在临床前研究中联合使用GEMMs和三维细胞培养技术，有望加深我们对癌症生物学的理解。
引言
自20世纪80年代末以来，通过同源重组技术对基因进行改造的能力极大地推动了生物系统的研究1。可诱导的、组织或细胞特异性的启动子系统以及位点特异性重组酶（如Cre-loxP系统）通过在时间和空间上精确控制基因修饰，进一步促进了遗传学研究的发展2,3,4。这些遗传策略的结合已构建出多种多样的实验模型系统5,6,7。
基因工程小鼠模型（GEMMs）是评估单个基因或基因群如何影响哺乳动物发育和疾病的重要工具。在临床前癌症研究中，GEMMs 是研究癌症发生、发展和治疗最具生理相关性和严谨性的方法8。本实验室专注于构建和鉴定癌症相关的基因工程小鼠模型。
在美国男性中，前列腺癌（PCa）是诊断率最高的非皮肤性癌症。大多数PCa患者属于低风险疾病，生存概率较高；但当疾病在晚期阶段才被诊断，或靶向激素治疗导致进展为侵袭性强且无法治愈的PCa亚型时，生存率会急剧下降9,10。我们实验室已开发出利用一个或多个肿瘤抑制基因的条件性等位基因（floxed alleles）的基因工程小鼠模型（GEMMs）。由于我们引入了一种转基因，该转基因在仅于前列腺上皮细胞中激活的前列腺素启动子（probasin promoter）下游表达Cre重组酶，因此肿瘤抑制基因的重组和表达缺失特异性地发生在前列腺组织中11,12。此外，我们将GEMMs与一种名为 mT/mG 的Cre报告转基因小鼠杂交，该报告系统可在无Cre表达的细胞中诱导番茄荧光蛋白（Tomato fluorescent protein）表达，而在有Cre表达的细胞中诱导绿色荧光蛋白（GFP）表达13。尽管本文所述方法及代表性结果展示的是我们实验室所研究的GEMMs，但本方案可用于从任何小鼠模型中生成前列腺癌类器官。然而，正如我们在代表性结果部分详细讨论的那样，我们观察到某些肿瘤特征对于前列腺癌类器官的生成更为理想。
近十年来，源自上皮组织的细胞培养新方法极大地推动了我们在体外模拟器官系统的能力14,15。术语"三维细胞培养”被用于描述建立和维持类器官所涉及的技术，类器官通常可被定义为由细胞组成的结构，这些细胞依据器官特异性的细胞谱系特征自组装形成次级结构16。这些新方法与传统的二维细胞培养不同，细胞无需经过转化或永生化即可实现长期生长；因此，可以将正常细胞的三维培养物与病变细胞进行比较。这一点在癌症研究中尤为重要，因为通常难以获得正常细胞作为对照培养物。此外，类器官能够自发形成具有适当分化细胞类型的次级组织结构，使其成为比二维细胞系更优的体外癌症研究模型17。我们实验室已从前列腺癌基因工程小鼠模型（PCa GEMMs）中分离的肿瘤组织建立了三维类器官系，以补充我们在体内的研究数据，并开展在GEMMs中不可行的实验
本文提供了前列腺癌基因工程小鼠模型（PCa GEMMs）完整尸检的书面和可视化操作流程，包括小鼠前列腺各个叶及转移病灶的解剖。我们描述并展示了一种从小鼠前列腺肿瘤组织中生成类器官的逐步操作方法，该方法基于Drost等人先前发表的从小鼠正常前列腺上皮组织建立类器官的方案18。
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方案
此处所述的动物操作程序均已获得纽约州布法罗市罗斯韦尔帕克综合癌症中心实验动物资源部机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
注意：用于解剖分离前列腺或前列腺肿瘤以生成类器官的雄性小鼠，应至少达到性成熟年龄——约为8至10周龄。不同研究中所使用小鼠的具体年龄可能有所不同。在选择小鼠年龄时需考虑的因素包括：前列腺细胞群体的年龄依赖性变化、特定启动子驱动的Cre转基因表达的年龄依赖性，以及特定基因工程小鼠模型（GEMM）中前列腺肿瘤进展的速度。
1. 小鼠前列腺肿瘤及转移性肿瘤的解剖与成像
- 准备工作
- 准备必要的无菌解剖工具。在洁净的无菌表面上布置解剖区域，配备15 cm直尺、精密天平、分析天平、装有70%乙醇的喷雾瓶、磷酸盐缓冲液（PBS）和纸巾。
- 用于非类器官生成的内脏器官和骨骼的固定液制备
- 对于内脏器官：在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制4%多聚甲醛（PFA）。每只小鼠准备20 mL 4% PFA，分装至两个15 mL锥形管中，室温保存备用。
- 对于长骨：将10 mL预配的10%中性缓冲福尔马林（NBF）分装至一个15 mL锥形管中，室温保存备用。
- 获取未处理的10 cm培养皿，加入非无菌PBS，用于在解剖显微镜下进行精细解剖时临时盛放器官。
注意： 无菌工具用于分离组织以生成类器官。非无菌工具用于后肢的初始切口和解剖。
- 安乐死与初始切口
- 通过 CO 气体安乐死小鼠2 以2.0 L/min的流速窒息5分钟。将小鼠从笼中取出并实施颈椎脱位。使用精密天平测量小鼠体重并记录。
- 将小鼠置于一张纸巾上方，腹面朝上放置在解剖台面上，使小鼠头部背向操作者。通过伸展小鼠四肢，并用一次性针头分别穿刺前肢和后肢的足掌，将小鼠固定在板上。
- 使用喷雾瓶将70%乙醇喷洒于小鼠毛发上。使用非无菌解剖剪和直镊，在小鼠阴茎上方稍作夹捏，仅穿过毛发做一小切口。
- 沿中线继续切开，仅透过小鼠的毛发，直至颈部。从初始切口处开始，沿小鼠腹侧平面两侧对称地做横向切口，仅透过毛发。
- 抓住小鼠的皮毛，小心地将其从皮肤上拉开。将皮毛固定在解剖板上，以暴露腹腔和胸腔。
- 整体提取雄性泌尿生殖系统
- 使用无菌解剖剪和直镊，小心地在直肠上方约0.75 cm处切开皮肤。沿中线继续切开至肋骨区域，注意不要触碰腹腔内的任何器官。小心将皮肤拉开并用大头针固定于解剖板上，以充分暴露整个腹腔。
注意： 切勿让这些器械接触小鼠体外组织或暂存区域内的任何表面，因为这些组织将用于类器官的生成。 - 根据图示解剖泌尿生殖系统及其他器官 图1A，数字表示从小鼠体内取出器官的顺序。
- 找到膀胱，然后抓住左侧或右侧的脂肪垫并向上牵拉，以暴露睾丸。仔细将睾丸从其余泌尿生殖区域分离，并置于一旁。对另一侧执行相同操作。
注意： 为获得最佳的组织质量和对前列腺肿瘤的详细表征，需将小鼠的整个泌尿生殖区域完整切除19建议首先切除泌尿生殖区域（图1A). - 抓住膀胱并轻轻上提，使泌尿生殖区域随之抬起，暴露其下方的尿道。在固定膀胱的同时，将剪刀置于背侧前列腺的下方，切断尿道。此时整个泌尿生殖区域即可从腹腔中分离出来。
- 将泌尿生殖区放入盛有 PBS 的 10 cm 培养皿中。若膀胱内仍含有尿液，可通过做一个小切口排出尿液。使用分析天平称量泌尿生殖系统并记录重量。
- 使用无菌解剖剪和直镊，小心地在直肠上方约0.75 cm处切开皮肤。沿中线继续切开至肋骨区域，注意不要触碰腹腔内的任何器官。小心将皮肤拉开并用大头针固定于解剖板上，以充分暴露整个腹腔。
- 盆腔淋巴结、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、胫骨和股骨的提取
- 移除泌尿生殖系统后，可暴露出位于其后方的盆腔淋巴结（图1A）以及脊柱两侧。仅当淋巴结内存在转移性病灶或局部存在炎症时，淋巴结才可见。将直血管钳置于淋巴结下方，向上提起以摘除淋巴结。在另一侧重复相同操作。
- 用直头镊子夹住直肠并剪断。牵拉直肠以分离整个结肠和小肠，观察肠系膜淋巴结中是否存在转移性病灶。当整个回肠被移除后，继续牵拉十二指肠以暴露胃部。剪断食管，完全取出胃并弃去。若观察到淋巴结中存在任何转移性病灶，应仔细将其从肠道周围解剖分离，并置于盛有PBS的10 cm培养皿中保存。
- 暴露并移除胃部将使脾脏从腹腔背侧分离图1A）。取出脾脏并置于4% PFA中。脾脏可作为苏木精染色的对照，因其细胞密度高。
注意： 不用于类器官生成的内脏组织将在4%多聚甲醛中固定过夜，用PBS洗涤，然后置于70%乙醇中。 - 切除腹腔上部的肝脏（图1A）。根据肝脏的转移负荷，可分离单个肝叶，或沿膈肌小心剪切以完整切除整个肝脏（此时不要剪穿膈肌）。将肝脏置于盛有PBS的10 cm培养皿中。
- 移除肝脏将完全暴露脊柱两侧的肾脏图1A）。用直血管钳从肾脏下方插入并向上提起，摘除肾脏——如果肾淋巴结存在转移病灶，需一并切除。对另一侧肾脏采用相同操作步骤。
- 为暴露胸腔，沿肋骨小心切开膈肌。刺破膈肌将释放胸腔内的负压，从而暴露心脏和肺组织。图1A).
- 抓住胸骨并向上牵拉，以进一步打开胸腔。沿肋骨观察胸腔内壁，检查胸腔淋巴结是否存在转移性病灶，若发现病灶则进行解剖。
- 在握住胸骨的同时，剪除腹侧肋骨以暴露心脏和肺。抓住心脏，向上提起，在肺下方进行剪切。为完整整块切除心脏和肺，需切断所有前侧血管和气管。将组织置于PBS中，小心分离心脏，避免损伤肺组织或肺转移病灶。
- 用非无菌的直镊子和解剖剪在股骨头处剪断后肢。小心夹住股骨，将后肢从毛皮中取出。
- 将后肢置于纸巾上，握住后脚掌。使用单刃剃须刀片刮除或切割胫骨和股骨上的所有肌肉及结缔组织。在髌骨后方切割，将股骨与胫骨分离，并通过移除后脚掌取出胫骨。将胫骨和股骨放入10%中性缓冲福尔马林（NBF）中。对另一侧肢体执行相同操作。
注意： 为检查小鼠长骨中的转移性病灶，腓骨无需保持完整。长骨将用10%中性缓冲福尔马林（NBF）固定一周，随后使用中性EDTA溶液进行脱钙。20三周后，将骨骼转移至70%乙醇中。 - 去除后肢后，取耳朵或尾尖组织用于后续基因分型。丢弃小鼠尸体及所有不用于固定或类器官生成的组织。
- 前列腺肿瘤解剖
注意： 使用解剖显微镜才能完成小鼠前列腺叶的分离。19然而，前列腺肿瘤负荷可能极高，以致无法区分各个叶，此时可无需显微镜进行解剖。尽管如此，以下仍详细描述分离各个前列腺叶的完整操作步骤。- 将泌尿生殖区置于盛有PBS的10 cm培养皿中，在解剖显微镜下使腹面朝上，膀胱和精囊腺朝向远离操作者的方向。所有对泌尿生殖区的操作均应使用无菌器械进行。
- 评估前列腺肿瘤的一般表型 最有可能的是，在前列腺癌基因工程小鼠模型（PCa GEMMs）中将观察到充满液体的或实性肿瘤图2A, B).
注意： 充满液体的肿瘤常位于前列腺前区（图2A含液体的肿瘤主要由结缔组织构成，上皮成分稀少——因此由于肿瘤上皮细胞数量较少，这类肿瘤不适合用于类器官的生成，这一点将在代表性结果部分进行讨论。 - 如果存在充满液体的肿瘤，用针在肿瘤上刺一个小孔。将泌尿生殖区域放入新的盛有PBS的10 cm培养皿中。
- 非优势手持直镊，优势手持弯镊. 将泌尿生殖区翻转至背侧。寻找前列腺近端区域（图1B），可通过尿道呈现的粉红色/红色进行识别。用弯镊夹住尿道并牢固固定，以便操作泌尿生殖组织。
注意： 在前列腺解剖过程中，应始终注意膀胱的位置，因为这是定位各个前列腺叶最简单的方法（图1B).
- 去除泌尿生殖区域中的非前列腺组织
- 在仍位于泌尿生殖区背侧时，找到精囊的基部。小心地将精囊剥离并弃去。对另一侧执行相同的步骤。
注意： 避免刺破精囊，因为这会释放出黏稠且不透明的分泌物，干扰前列腺的解剖操作。如果精囊被刺破，应将剩余的泌尿生殖区域转移至新的含新鲜PBS的10 cm培养皿中。 - 使用镊子的弯曲侧去除并弃去输精管以及尽可能多的脂肪和结缔组织。
- 在牢固夹住尿道/前列腺近端区域的同时，使用一把精细的尖头剪刀将膀胱从尿道上剪下。
- 在仍位于泌尿生殖区背侧时，找到精囊的基部。小心地将精囊剥离并弃去。对另一侧执行相同的步骤。
- 前列腺叶的分离
- 定位前叶前列腺（图1B）。用直镊牢固夹住前列腺近端区域/尿道。用镊子的弯曲侧直接夹住组织，用力将前列腺前部区域从膀胱及其他前列腺组织上撕离。将组织置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。
注意： 对于所有前列腺区域，可能需要使用解剖剪根据肿瘤大小来切除组织。 - 定位腹侧前列腺区域（图1B）。以与步骤1.5.7相同的方式去除腹侧前列腺区域。
- 此时解剖过程中，仅应保留前列腺的外侧叶和背侧叶，而前列腺近端区域仍由直血管钳夹持。评估外侧叶和背侧叶前列腺组织（图1B）。如果能够区分侧叶与背叶，则按照步骤1.5.7所述方法去除侧叶前列腺组织。对另一侧进行相同操作。
- 按照步骤1.5.7所述，切除背侧前列腺区域。将前列腺近端区域置于4% PFA中固定，因其位于尿道肌层组织内，结构特殊，不适合用于类器官的生成。
- 定位前叶前列腺（图1B）。用直镊牢固夹住前列腺近端区域/尿道。用镊子的弯曲侧直接夹住组织，用力将前列腺前部区域从膀胱及其他前列腺组织上撕离。将组织置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。
2. 从前列腺肿瘤组织生成三维类器官
注意： 图3 展示了肿瘤类器官生成步骤的示意图。
- 准备
- 根据 Drost 等人的方法制备小鼠前列腺类器官培养基。18 使用条件培养基替代Noggin和R-Spondin的重组蛋白，并将Noggin和R-Spondin条件培养基的终浓度均调整为1%（v/v），而非10%。
注意： 稳定转染了HA-小鼠Noggin-Fc或HA-小鼠Rspo1-Fc的HEK293细胞分别用于制备Noggin或R-Spondin条件培养基。这些细胞系由斯坦福大学Calvin Kuo实验室惠赠。 - 在15 mL离心管中配制消化液：将20 mg/mL的胶原酶II用Advanced DMEM/F12(+++)培养基稀释至终浓度为5 mg/mL。向胶原酶II溶液中加入Y-27632 ROCK抑制剂，终浓度为10 µM。
注意： 消化缓冲液与组织的比例为1 mL:50 mg，此比例参照Drost等人的方法。18.
- 根据 Drost 等人的方法制备小鼠前列腺类器官培养基。18 使用条件培养基替代Noggin和R-Spondin的重组蛋白，并将Noggin和R-Spondin条件培养基的终浓度均调整为1%（v/v），而非10%。
- 肿瘤组织的剪碎与消化
- 在细胞培养超净台中，将前列腺肿瘤组织置于无菌的10 cm培养皿内，解剖并弃去坏死组织。
- 将剩余的前列腺肿瘤组织切碎成 1 mm3 用无菌弯镊夹住组织块，用解剖剪将其剪成小块。
- 用镊子的弯曲侧将剪碎的肿瘤组织块转移至含有消化缓冲液的15 mL离心管中。在37 °C条件下振荡消化1.5至2小时，每20分钟检查一次消化进度。
注意： 此时，从 -20 °C 保存条件下取出至少 2 mL 基质，置于冰上解冻。1 mL 基质分装样品解冻约需 3 小时。 - 组织消化后，以175 x g离心离心管 g 在4 °C下离心5分钟以形成细胞沉淀。
- 吸弃上清液，轻弹管壁以松动细胞沉淀，加入1 mL预热的含10 µM Y-27632 Rock抑制剂的胰蛋白酶溶液重悬细胞沉淀。将离心管置于37 °C水浴中孵育5分钟。
- 孵育后，用标准 P1000 吸头上下吹打 5 次。将试管放回 37 °C 水浴中继续孵育 5 分钟，并重复步骤 2.2.6。
注意： 此时，将无菌的6孔细胞培养板放入55 °C培养箱中预热。
- 细胞计数与重悬于基质中
- 加入 9 mL 冷的 AdDMEM/F12(+++) 洗涤细胞，然后将离心管在 175 x g 条件下离心 g 4 °C下离心5分钟。
- 离心后，弃去上清液，轻弹管壁以松动沉淀，再加入 10 mL 冷的 AdDMEM/F12(+++) 重悬细胞并洗涤。将管子以 175 x g 4 °C下离心5分钟。
- 离心后，弃去上清液，轻弹管壁以松动沉淀，将细胞重悬于1 mL AdDMEM/F12(+++)中，按照标准操作流程使用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 一个六孔板的单孔中可容纳7到8个类器官穹顶，当类器官接种于基质中时 通过 逐滴加入的方式。约 200 μL 基质可形成 7–8 个凝胶滴。根据后续实验所需类器官的孔数，计算所需的基质体积，然后计算含有细胞的溶液所需体积，以达到终浓度为 1.0 × 106 细胞/毫升基质
- 计数细胞后，以175 x g 4 °C下离心5分钟。弃上清，轻弹管壁使沉淀松散，然后将细胞重悬于步骤2.3.4中计算出体积的基质中。
注意： 基质在4 °C时保持液态；基质储存管及基质-细胞溶液须始终置于冰上。
- 包埋基质穹顶的制备与培养基应用
- 用P200移液器将基质-细胞溶液轻轻混匀，使细胞均匀分布，避免产生气泡。将6孔培养皿从55 °C培养箱中取出。
- 小心吸取 200 μL 基质-细胞溶液，迅速滴入孔板中形成圆顶状结构。
- 重复步骤 2.4.2，直至基质-细胞溶液用完。室温下静置 2 分钟，使穹顶状结构凝固。
- 将6孔板倒置，放入37 °C培养箱中继续凝固20分钟。
- 孵育后，向每孔加入 2 mL 小鼠前列腺类器官培养基。向每孔加入合成雄激素 R1881，使其终浓度为 1 nM，同时加入 Y-27632 Rock 抑制剂，使其终浓度为 10 μM。轻轻混匀，将培养板置于 37 °C 培养箱中进行培养。
注意： 类器官培养基仅在类器官生成后的第一周内需添加10 µM Y-27632 Rock抑制剂。
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结果
代表性的小鼠剖检图像显示，小鼠前前列腺区域存在一个充满液体的大型原发性前列腺肿瘤 图2A相比之下， 图2B，显示了一只小鼠的代表性尸检图像，该小鼠具有较大的实性原发性前列腺肿瘤，其各个前列腺区域无法分辨。荧光解剖图像展示了同一实性前列腺肿瘤的 图2B 表达GFP，表明肿瘤细胞表达Cre（图2C）。不表达前列腺素结合蛋白（probasin）的组织（如膀胱）表达Tomato，因此不表达Cre（图2C）。来自小鼠的肝脏和肺脏 图2B 具有表达GFP的转移性肿瘤，表明它们起源于原发性前列腺肿...
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讨论
前列腺肿瘤解剖和类器官生成方案中的关键步骤
去除非前列腺组织并对小鼠前列腺肿瘤进行精细解剖对于高效生成癌类器官至关重要，因为非前列腺上皮细胞和正常前列腺上皮细胞均能形成类器官。对于实性前列腺肿瘤，尤其需要分离出有活性的肿瘤区域，以去除坏死组织的污染，否则会减少可存活细胞的数量。在类器官生成过程中，必须密切监测胶原酶对组织的消化过程，因为长时间暴露于胶原酶会降低细胞活力。对于源自癌症基因工程小鼠模型（GEMMs）的类器官，必须对每一代细胞系进行完整的基因分型，以确保小鼠中设计的所有转基因和修饰等位基因均存在于类器官中。在长期传代后重复基因分型也是必要的，以确保遗传修饰得以维持。
前列腺肿瘤解剖及类器官生成的优化与故障排除
我们观察到，即使基因型相同的小鼠，其前列腺肿瘤特征也存在个体间差异。因此，针对每只小鼠可能需要对本文所述的前列腺解剖方案进行特定调整。此外，在解剖转移性肿瘤时需具备灵活性，因为在开始解剖前难以预测这些病灶的严重程度。
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披露
作者没有需要披露的财务关系。
致谢
作者谨此感谢斯坦福大学Calvin Kuo实验室提供了稳定转染HA-小鼠Noggin-Fc或HA-小鼠Rspo1-Fc的HEK293细胞。我们还要感谢Dean Tang博士允许我们使用其实验室的荧光解剖显微镜。本研究工作由美国国家癌症研究所资助项目CA179907（D.W.G.）支持。罗斯韦尔公园综合癌症中心的共享资源由美国国立卫生研究院癌症中心支持基金CA016056资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 英寸，23 G，一次性注射器针头 | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10% 中性缓冲福尔马林 | Sigma | HT501128 | |
| 32% 多聚甲醛 | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| 分析天平 | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504044 | |
| 胶原酶 II | Gibco | 17101015 | |
| 解剖板 | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS 肉瘤基质，Pathclear 批号 19814A10 | 由 Trevigen 生产 | 从弗雷德里克国家实验室的国家癌症研究所申领 | 持有国家癌症研究所资助的人员可申请该基质 |
| HEPES (1 M) | Sigma | 25-060 | |
| 人重组表皮生长因子 (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-谷氨酰胺 (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma | A9165 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | P4333 | |
| 精密天平 | Mettler Toledo | 30216561 | |
| 23号手术刀片 | World Precision Instruments | 504176 | |
| 7号手术刀柄，16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| 单刃碳钢剃刀刀片 | Fisherbrand | 12-640 | |
| 不锈钢解剖剪，10 cm，直头 | World Precision Instruments | 14393 | |
| 不锈钢虹膜镊，10 cm，弯头，带齿 | World Precision Instruments | 15915 | |
| 不锈钢Nugent通用镊，直头，带齿 | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (ROCK抑制剂) | APExBIO | A3008 |
参考文献
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