评估癌细胞三维球状培养物中的细胞活力与死亡

摘要

本文介绍了几种用于评估三维肿瘤细胞球体存活与死亡的简单方法。相比二维培养，三维细胞球体能更真实地模拟体内肿瘤的理化梯度环境。因此，该球体模型可更准确地评估抗癌药物的疗效，并提高向体内条件的转化预测能力。

摘要

癌细胞的三维球状体是癌症药物筛选和深入理解癌细胞生物学机制的重要工具。该模型的优势在于能够模拟肿瘤体内环境的多个方面，同时具备快速、经济和多功能的特点，适合进行相对高通量的筛选。球状体培养条件可重现肿瘤内部的理化梯度，包括从球状体外围向核心方向细胞外酸性逐渐增强、乳酸水平升高，以及葡萄糖和氧气供应逐渐减少。此外，该模型在一定程度上也模拟了体内肿瘤的机械特性和细胞间相互作用。不同类型的癌细胞所形成的三维球状体在具体特性上存在显著差异，因此其最佳生长条件也各不相同。此外，对三维球状体中细胞活力和死亡的评估方法，在部分方面需区别于二维培养所采用的方法。本文中，我们描述了多种制备癌细胞三维球状体的实验方案，以及利用此类培养体系在评估抗癌药物疗效背景下检测细胞活力与死亡的方法。

引言

多细胞球状模型在癌症生物学中的应用已有数十年历史^1,2，但近年来获得了显著发展。这在很大程度上反映了人们日益认识到癌细胞表型对其微环境和特定生长条件的高度依赖性。实体瘤中的微环境与相应正常组织中的微环境存在根本性差异，包括pH值、氧张力以及间质压力等理化条件，还有营养物质、代谢废物和分泌的信号分子（如生长因子、细胞因子）等可溶性因子的浓度梯度。此外，还包括细胞外基质（ECM）的结构、细胞间相互作用和细胞间信号传导，以及肿瘤特有的三维（3D）结构的其他方面^3,4,5,6。癌细胞所处的特定微环境条件深刻影响其基因表达谱和功能特性，显然，与二维（2D）培养的细胞相比，3D球状体的表型更接近体内肿瘤的真实状态^7,8,9,10,11。即使2D模型通过....

方案

1. 类球体的生成

1. 制备用于球体形成的细胞悬液
   注意： 不同的细胞系具有显著差异的黏附特性，因此必须针对每种细胞系建立最合适的类球体形成方案。我们发现 MCF-7 和 BxPC-3 细胞适用于自发形成球体，而 MDA-MB-231、SKBr-3、Panc-1 和 MiaPaCa 细胞则需要添加重建基底膜才能成功形成球体。目前仅 MDA-MB-231 和 BxPC-3 细胞被用于悬滴法实验，但其他细胞系也完全适用。
   1. 以单层培养细胞，直至细胞融合度达到70-80%。
   2. 用磷酸盐缓冲液（1x PBS，25 cm² 培养瓶加 5 mL）洗涤细胞² 或 10 mL 用于 75 cm² 烧瓶）中加入细胞解离酶（25 cm²培养瓶加入0.5 mL）² 或 1 mL 用于 75 cm² 培养瓶² 烧瓶）并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育细胞 2–5 分钟₂ 和95%湿度。
   3. 在显微镜下观察细胞脱落情况，并通过加入含6-10%血清（根据细胞系确定）的完全培养基至总体积5 mL，以中和细胞解离酶活性。² 或 10 mL 用于 75 cm² 培养瓶² 烧瓶
   4. 使用布氏计数板对细胞进行计数，每份细胞样本计数计数板中的8个方格，以获得....

结果

基于图 1A 和 1B 所示球状体形成方案的球状体生长实验，被用作在三维肿瘤模拟环境中分析抗癌药物处理效果的起始分析方法。球状体形成的难易程度具有细胞系特异性，某些细胞系需要添加rBM才能形成结构完整的球状体²²。添加的rBM浓度会显著影响球状体的形态。如图 1C 和 1D 所示，在0%至4%范围内改变rBM浓度，会以细胞类型依赖的方式影响球状体的致密程度和形态。图 1C 显示，添加不超过2.5%的rBM可促进SKBr-3乳腺癌细胞形成球状体，而rBM浓度高于2.5%时则无进一步影响。相比之下，具有上皮样形态的BxPC3胰腺导管.......

讨论

三维癌细胞球状体的使用已被证明不仅在抗癌药物筛选方面具有重要价值和广泛适用性，而且有助于深入理解在模拟肿瘤微环境条件下癌细胞死亡与存活的调控机制。这一点尤为关键，因为化疗药物的可及性、细胞摄取以及细胞内效应会受到肿瘤内部理化条件的显著影响，这些条件包括pH值、氧张力、结构曲折性以及细胞间的物理和化学相互作用^9,17。例如，许多实体瘤中细胞外pH值可低至6–6.5^{25,26,27,28,29}，这种酸性环境会使弱碱性化疗药物（如阿霉素、米托蒽醌以及两性离子紫杉醇）发生质子化而带电，从而降低其进入肿瘤细胞的效率，并可能影响诸如P-糖蛋白等多重耐药蛋白的活性³⁰

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-(4-脒基苯基)-1H-吲哚-6-脒 (DAPI)	Invitrogen	# C10595	用于细胞核染色
5-氟尿嘧啶 (5-FU)	Sigma-Aldrich	#F6627	化疗治疗组分
5-(N-乙基-异丙基)阿米洛利 (EIPA)	Life Technologies	#E3111	NHE1 抑制剂
PARP 和 cPARP 抗体	Cell signaling	#9542	用于 Western 印迹
Ki-67 抗体	Cell signaling	#9449	用于免疫组化 (IHC)
p53 抗体	Cell Signaling	#2524	用于免疫组化 (IHC)
β-肌动蛋白抗体	Sigma	A5441	用于 Western 印迹
Bactoagar	BD Bioscience	#214010	用于琼脂糖凝胶制备
Benchmark 蛋白质分子量标准	Invitrogen	#10747-012	用于 SDS-PAGE
Bio-Rad DC 蛋白质测定试剂盒	Bio-Rad Laboratories	#500-0113, #500-0114, #500-0115	用于裂解液中的蛋白质定量
Bürker 计数板	Marienfeld	610311	用于细胞计数
BX63 正置荧光显微镜	Olympus		用于荧光成像
CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测试剂盒	Promega	#G9681	用于细胞活力检测
顺铂	Sigma-Aldrich	#P4394	化疗治疗组分
Corning 类球体微孔板，96 孔，黑色带透明圆底，  超低吸附，带盖，无菌	Corning	#4520	用于培养类球体并以发光检测为终点
Corning 96 孔，透明圆底，  超低吸附微孔板，带盖，无菌	Corning	#7007	适用于无需以发光检测为终点的类球体培养
Criterion TGX 预制胶	Bio-Rad	5671025	用于 SDS-PAGE
多柔比星	Abcam	#120629	化疗治疗组分
FLUOStar Optima 微孔板读数仪	BMG Labtech		用于记录发光信号
甲醛	VWR Chemicals	#9713.1000	用于细胞固定
Geltrex LDEV-无、生长因子减少型基底膜基质	Gibco	#A1413202	需保存于 4 °C 以防止凝固。在方案中简称为 rBM。
热灭活胎牛血清 (FBS)	Sigma	#F9665	生长培养基中的血清组分
ImageJ	NIH		科学图像分析软件
Medim Uni-safe 包埋盒	Medim Histotechnologie	10-0114	用于储存包埋的类球体
Mini 蛋白酶抑制剂混合片剂	Roche Diagnostics GmBH	# 11836153001	用于裂解缓冲液制备
MZ16 显微镜	Leica		用于明场显微图像采集
NuPAGE LDS 4x 上样缓冲液	Invitrogen	#NP0007	用于 Western 印迹
Pierce ECL Western 印迹底物	Thermo scientific	#32106	用于 Western 印迹
丽春红 S	Sigma-Aldrich	#P7170-1L	用于蛋白质条带染色
Prism 6.0	Graphpad		科学绘图与统计分析软件
碘化丙啶 (1 mg/ml 水溶液)	Invitrogen	P3566	避光保存
无菌多通道储液槽	SPL lifesciences	21002	用于接种细胞以形成类球体
Superfrost Ultra-Plus 黏附载玻片	Menzel-Gläser	#J3800AMNZ	用于包埋的显微镜载玻片
他莫昔芬	Sigma-Aldrich	#T5648	用作化疗治疗
Trans-blot Turbo 0.2 µm 硝酸纤维素膜	Bio-Rad	#170-4159	用于 Western 印迹
Tris/甘氨酸/SDS 电泳缓冲液	Bio-Rad	#161 0732	用于 SDS-PAGE
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma	#T4174	细胞解离酶