注射Gryllus bimaculatus卵

摘要

本文介绍了一种蟋蟀卵显微注射的实验方案，该技术是开展蟋蟀多种实验研究的基础方法，包括但不限于RNA干扰和基因组编辑。

摘要

在发育中的生物体中改变基因功能是多种实验的核心。尽管在传统模式生物体系中已开发出极为强大的遗传学工具，但在大多数其他生物体中操纵基因或信使RNA（mRNA）仍然困难。与此同时，进化和比较研究依赖于在多种不同物种中探索基因功能，这就需要发展和改进适用于当前非遗传操作友好型物种的基因表达操控技术。本实验方案描述了一种将试剂注入蟋蟀卵以检测特定操作对胚胎或幼虫发育影响的方法。文中详细说明了如何收集卵并使用斜面针头进行注射的操作步骤。这一相对简单直接的技术具有灵活性，且有望适用于其他昆虫。单次实验中可收集并注射数十枚卵，仅注射缓冲液的存活率随着操作熟练程度提高而提升，最高可达80%。该技术可支持多种实验方法，包括药理学试剂的注射、体外加帽mRNA的注射以表达目标基因、双链RNA（dsRNA）介导的RNA干扰、利用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）与CRISPR相关蛋白9（Cas9）试剂实现基因组编辑，以及利用转座元件构建瞬时或稳定的转基因品系。

引言

对生物体基因组进行修饰或调控基因表达的能力，是设计多种验证功能因果关系实验的基础。对于传统遗传学模式生物体系（如 Mus musculus、Danio rerio、Drosophila melanogaster 和 Caenorhabditis elegans）之外的生物体而言，拥有基因组和非基因组修饰技术对于开展具有比较意义和进化相关性的研究也至关重要。无论研究者旨在理解生物体多样性¹，还是遵循克罗格原则（Krogh's principle），即每个生物学问题都存在一种最适合解答它的生物体^2,3，能够修饰基因组或调控基因表达都是现代实验设计不可或缺的前提。

蟋蟀Gryllus bimaculatus是一种新兴的模式生物。在过去一个世纪中，它被用于神经行为学实验⁴，而近二十年来，科研人员对蟋蟀的研究兴趣日益增加，尤其关注该生物的进化与发育过程⁵。蟋蟀是一种半变态昆虫，其进化分支位于已被深入研究的全变态昆虫（如D. melanogaster和Tribolium castaneum）的基部位置⁶。由于其在进化树上的重要地位，科学家希望在此类昆虫中开展现代而复杂的实验研究，这也促使人们越来越重视将分子工具应用于G. bimaculatus的研究中。

向蟋蟀卵中注射分子试剂可用于基因组编辑实验，以及胚胎中基因表达的非基因组调控。例如，已利用转座酶 piggyBac^7,8 构建了携带 eGFP 插入片段的转基因 G. bimaculatus。研究人员已成功利用锌指核酸酶（ZFNs）和类转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）在特定基因组区域引入双链断裂，从而构建出 G. bimaculatus 基因敲除模型⁹。尽管 ZFNs 和 TALENs 能够实现四大模式生物体系之外动物的位点特异性靶向，但这些试剂很快被 CRISPR/Cas9 系统所取代，后者使用更简便、效率更高且具有高度灵活性¹⁰。在 G. bimaculatus 中，CRISPR 已被用于构建基因敲除¹¹ 和基因敲入品系^12,13。除了基因组编辑外，还可将 dsRNA 注射到卵中，以在发育中的胚胎中降低 mRNA 表达水平，从而帮助研究人员理解特定转录本在发育全过程中的功能^14,15。此前已有部分关于如何注射蟋蟀卵的简要操作细节发表¹²。

本文介绍了一种针对早期G. bimaculatus卵进行显微注射的详细实验方案。该方案高效且易于适应不同的实验室条件、注射材料，可能还可推广至其他昆虫。尽管有关基因组修饰和基因敲低实验设计与实施的更多细节已在其他文献中发表^12,13，但这些方法最终均依赖于本文所述的显微注射技术。

方案

1. 硬件设置与材料准备

注意：有关溶液、试剂和设备的详细信息，请参见表1和材料表。

1. 设置解剖显微镜，以便观察卵并引导注射针操作。（图1A 显示配备荧光功能的解剖显微镜。）具备荧光功能更佳，但非必需。
2. 安置三轴显微操作器，以精确操控注射针的位置（图1A）。
3. 配备带有管路和持针器的显微注射仪，用于注入微量物质（图1A）。可选配脚踏开关，图中未显示。
4. 设计并制作用于形成卵井的印模（图1C），通过3D打印机或激光雕刻机打印所需图案的反向结构。
   注意： 图中所示3D打印样本印模尺寸为4.5 cm × 5 cm，带有128个3 cm × 1 cm × 1 mm的凸起结构，用于形成独立的卵井。有关制作多种可定制模具的详细方法已在其他文献中发表¹⁶。
5. 配制10倍注射缓冲液、HEPES缓冲盐水（HBS）以及四甲基罗丹明葡聚糖染料储备液，并于4 °C保存。
6. 配制待注射的实验溶液，例如dsRNA、CRISPR/Cas9¹²、转座元件、体外加帽mRNA^7,8、药理学试剂¹⁷、ZFNs或TALENs⁹。
7. 在载玻片上粘贴数层普通实验室胶带，并在其上贴双面胶带，构建一个高出载玻片约1 mm的平台，用于放置针具以进行评估。
8. 准备一个大小约为40 cm × 60 cm、带盖且顶部有网状通气孔的蟋蟀饲养容器，以保证空气流通。
9. 添加食物、水和遮蔽材料。
10. 放入数十只健康成年雄性和雌性蟋蟀。通过翅膀的存在来识别成年蟋蟀。
    注意： 使用不同羽化后年龄的蟋蟀可能提高产卵量。饲养密度应相对较高，以确保能收集到足够的实验用卵，但不宜过于拥挤，以免发生同类相食现象。例如，在上述尺寸的容器中饲养约24只健康蟋蟀，雌雄比例大致相等，通常可在1至2小时内收集约200枚卵。蟋蟀可在室温下饲养，但若将其维持在温暖（23.5–26 °C）、湿润（40–60%相对湿度）的培养箱中，则其发育和行为表现更佳。

2. 制备注射用针头

1. 使用带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管（具体尺寸详见材料表）。拉针应在注射当天或注射完成前数天内进行准备。
2. 将一根玻璃毛细管放入拉针仪中，使其在加热丝上居中，并拧紧旋钮以固定玻璃管。
3. 将拉针仪的温度设定在接近玻璃斜坡温度的范围（-5 °C 至 +10 °C）。
4. 采用单步高温程序拉制出具有小开口的长锥形拉针，但需避免末端熔融闭合。
   注意：例如，当使用材料表中所述配备盒式加热丝的微电极拉针仪时，对于斜坡温度为478的玻璃毛细管，可采用以下参数：加热（Heat）478；拉力（Pull）45；速度（Vel）75；延迟（Del）120。用户应根据实验经验确定获得如图2B所示针头形状的最佳条件。
5. 对针尖进行斜面打磨，以备注射使用。
6. 用滴水润湿斜面研磨仪的旋转研磨面（图2A），可使用反渗透（RO）水或二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理的蒸馏水。
7. 将拉好的针插入斜面研磨仪中，并调整至20°角。
8. 缓慢下放针头直至其刚好接触研磨面，研磨2至3分钟。
9. 通过将打磨后的针头放置在粘附于玻璃载玻片上的双面胶带上，评估其斜面效果。
10. 将固定有针头的载玻片置于配备相机和图像采集软件的复合显微镜载物台上。
11. 使用20倍物镜采集针尖图像。
12. 利用成像软件测量斜面开口近端处针头内腔直径（图2C）。理想尺寸为10 µm + 2 µm。
13. 丢弃开口直径小于8 µm或大于12 µm的针头。
14. 将针头存放于带盖容器中以防灰尘污染。使用一条石蜡条或类似材料将针头垫高，使其不直接接触容器底部，以防止针尖断裂（图2D）。

3. 卵的收集与准备

1. 通过在收集卵前的夜间或至少8–10小时内，使蟋蟀无法接触任何湿润的产卵基质（如水瓶、产卵皿），以最大化其产卵数量。
   注意： 由于雌性具有体内储存精子的能力，若实验上必须精确控制受精时间，则可能需要采用不同时间点的操作流程¹⁸.
2. 配制40 mL 1%的琼脂糖水溶液，倒入10 cm的培养皿中。
3. 在琼脂糖凝固之前，将其表面放置一个鸡蛋井印模。
4. 琼脂糖凝固后，取下印章，露出加样孔（图1C).
5. 用含有1%青霉素/链霉素的HBS填充琼脂糖凝胶孔板。
6. 将盖子盖在培养皿上，用封口膜封好，于 4 °C 保存。
   注意： 培养皿可在 4 °C 下保存数天，但使用前应恢复至室温，以避免产生冷凝水。
7. 用白色游乐场沙子填满一个35 mm的培养皿，制成蟋蟀产卵用的卵收集皿（图1B).
   注意： 指定的沙子 材料表 砂粒大小应适宜。若砂粒过大，会损伤鱼卵。
8. 用一张裁剪成约 18 cm x 18 cm 的正方形纸巾盖住盛蛋的器皿 厘米，并将其置于铺有沙子的培养皿顶部。用此纸巾覆盖装有自来水的培养皿。
9. 倾斜培养皿，轻轻挤压顶部以去除多余的水分。
10. 将纸巾方块的四个角塞入培养皿底部边缘下方，并将盛有卵的培养皿放入倒置的皿盖中，以帮助固定纸巾覆盖物。
11. 将盛有卵的培养皿放入蟋蟀饲养箱中，让成年雌性蟋蟀产卵1至2小时。
    注意： 此处相对较短的时间可确保所有卵在注射时处于相似的发育阶段。若需在细胞化之前进行注射，则应在产卵后14小时内完成注射。¹⁹.
12. 同时，将琼脂糖培养皿（来自步骤 3.6）放置于室温下回温，以备用于盛放待注射的卵。
13. 从蟋蟀饲养盒中取出装有新鲜产出卵的卵收集皿，移除纸巾覆盖物。将孔径为0.5–1 mm的筛子置于容量不小于500 mL的烧杯上图1B).
14. 将产卵皿中的内容物（沙子和卵）在缓流的自来水下冲洗至过滤器中，使沙粒穿过过滤器网孔落入下方烧杯的水中，而将蟋蟀卵留在过滤器篮中。
15. 用反渗透水（RO水）装满一个容器，并将其放入托盘中。将滤网倒扣在容器上方，轻敲培养皿，使卵粒落入水中。卵粒会沉入容器底部。
16. 用剪刀剪去P1000移液枪枪头的尖端，使其开口直径约为3 mm。将该枪头装在P1000移液器上，用于将卵从容器转移至琼脂糖卵模具培养皿中，尽量减少水分的转移。
17. 使用塑料镊子将卵整齐排列在盛有含1%青霉素/链霉素的HBS的琼脂糖孔中。每个卵将沉入单独孔的底部。在准备注射前，用培养皿盖覆盖。

4. 准备显微注射仪

1. 将显微注射仪连接至压缩空气或气体源（本实验方案使用压缩空气或N₂优化）。
   注意：若使用便携式气罐，需充气至至少75 psi。在注射过程中气罐压力会逐渐下降，可能需要重新充气；当压力低于40 psi时，注射将变得困难。
2. 打开显微注射仪。将注射时间设为0.17秒，压力设为10–15 psi。
   注意：所需的确切压力取决于针头的开口大小，必须在每次注射实验或更换新针头时通过实验经验确定。
3. 确保显微注射仪的BALANCE旋钮已调至0（通常为完全逆时针方向），且显微注射仪已加压并处于注射模式。

5. 注射

1. 使用1 mL注射器和0.45 µm针头滤器过滤约500 µL的10倍注射缓冲液。
2. 混合注射试剂（以下细节适用于按文献¹²所述方法制备的dsRNA的注射）。
   注意：在初次学习该技术时，设计并实施多个对照实验可能是明智的选择。例如，仅穿刺卵而不注射、单独注射缓冲液加染料，或注射缓冲液加染料及对照试剂（如eGFP dsRNA），这些均可有效评估注射流程中各因素可能带来的干扰程度。不同对照组的存活率见图3。
3. 以4 μL的dsRNA分装样品作为起始量。
4. 向dsRNA分装样品中加入0.5 μL过滤后的10倍注射缓冲液。
5. 加入0.5 μL浓度为50 mg/mL的四甲基罗丹明葡聚糖染料储备液。若在无荧光功能的解剖显微镜下操作，则应使用酚红替代。
6. 在整个注射过程中，所有材料均需保持在冰上。
7. 使用20 μL上样尖端和P10移液器将注射溶液装入注射针中。
8. 吸取1.5 μL注射溶液，并将上样尖端插入注射针的宽口端。
9. 尽可能将溶液推至针尖深处，并通过轻弹针管去除气泡；注意避免折断针头。
10. 将盛有卵的培养皿置于解剖显微镜下，选择约10倍的低倍放大（通过10倍目镜观察实现1倍物镜放大）。
11. 将针插入注射装置并拧紧固定。
    注意：确保针头正确且牢固地插入装置中。操作时，将针的宽口端从金属套管中稍向外拉出，同时带出套管内的硅胶管。调整硅胶管位置，使玻璃针尖略微突出于硅胶管之外。若未正确操作，硅胶管可能被夹在玻璃针与金属套管之间，导致针尖堵塞。
12. 小心地将装有针头的注射装置插入显微操作仪。注意针尖锋利，避免碰撞表面造成断裂。
13. 在显微镜下同时观察卵和针头，移动针头至培养皿网格左上角附近的卵上方。
14. 降低针头，使其尖端进入培养皿中的HBS加1%青霉素/链霉素缓冲溶液中。
15. 将针头置于视野中央，并移动卵盘，使针头位置比卵更靠近培养皿边缘数毫米。
16. 避免针头遮挡卵阵列网格的视野。
17. 将显微镜切换至适用于罗丹明的滤光片，以便观察针内荧光并聚焦于针尖。
18. 在显微注射仪上，缓慢顺时针旋转BALANCE旋钮，直至注射溶液开始从针尖渗出进入悬浮液中。此时显微注射仪屏幕上的平衡数值将开始上升，但具体数值并不重要。随后，将旋钮略微逆时针回调，直至染料停止从针尖渗出。
    注意：每次更换新针头时都必须重新设定此平衡。若未正确设定平衡，即使在注射触发结束后，显微注射仪仍会持续注射一段时间。甚至可能出现仅按一次注射按钮，未平衡的针头即将针内全部内容物排出的情况。
19. 在针头位于视野中央的情况下，移动卵盘，使针头对准第一个待注射的卵。建议从卵阵列的一个角落开始注射，例如左上角。
20. 调整放大倍数至约50倍；在此放大倍数下，单个卵将占据大部分视野。
21. 结合使用显微操作仪及手动移动卵盘，将针头调整至注射所需位置。
22. 使用显微操作仪推进针头，将其尖端插入第一个待注射的卵中。
23. 从卵的后端（较钝端）起约20–30%卵长处进针，进针方向垂直于卵的长轴（图1E）。
24. 通过显微注射仪的脚踏开关或注射按钮进行注射。卵内出现一小团荧光物质即表明注射成功（图1D）。
    注意：注射过程中部分卵黄被排出卵外是常见现象（图1F），这并不一定意味着被注射的卵将失去活力。
25. 将针头从卵中撤出。若撤针时卵被意外带出其凹槽，可在撤针的同时使用小镊子将卵轻压回原位。
26. 若注射过程中针头堵塞，应先将针头从卵中取出，并保持针头浸没于覆盖卵的HBS加1%青霉素/链霉素溶液中，然后使用Clear功能或按下注射按钮清除堵塞。
27. 继续使用同一根针头，尽可能多地重复注射操作。初学者可能仅能完成约20至30枚卵的注射，但随着熟练度提高，可超过100枚。
28. 若针头堵塞且无法清除，则丢弃该针头，更换新针头并重新开始（即返回步骤5.7）。
29. 将注射后的卵盘置于温暖的培养箱（23.5–26 °C）中，环境保持轻微湿润（以减少蒸发），直至胚胎发育至分析所需的阶段。
30. 至少每24小时移除不再存活的卵（图3A、B），并更换新鲜的HBS加1%青霉素/链霉素悬浮液。
31. 注射后两到三天，用移液器轻柔吹打或使用塑料镊子将卵转移至加盖培养皿中湿润的滤纸上，滤纸用HBS加1%青霉素/链霉素润湿，继续在温暖湿润的培养箱中发育。
32. 持续监测卵的发育情况，每天移除不再存活的卵（图3A、B）。

结果

蟋蟀容易在潮湿的基质中产卵，提供充足的潮湿沙土或土壤可诱导其大量产卵。若在产卵前先让蟋蟀缺乏产卵基质8–10小时，效果尤为显著。在洁净沙土中产出的卵可轻松分离并收集（图1B），随后可转移至定制的卵孔板中用于显微注射（图1C）。可使用解剖显微镜、显微注射仪和显微操作器（图1A）对单个卵进行多种物质的注射（图1D）。注射部位位于卵的后端附近，大约在前后轴向的20–30%处（图1E）。由于卵的前端较尖、后端较钝，但两者差异通常较细微，因此区分较为困难（图1E）。轻轻将卵左右滚动通常有助于辨别两端。注射针拔出后，有时会观察到卵黄被排出（图1F），但此现象似乎不会影响卵...

讨论

该技术的两个主要挑战是针头尺寸的优化和胚胎存活率问题。尽管使用较细的针头可提高存活率，但内径更窄的针头会产生更强的毛细作用力，从而更容易导致卵黄进入针管并引起堵塞。在较理想的情况下，可通过注射另一枚卵或按上述方法清理针头来清除堵塞。也可尝试增加显微注射仪的平衡压力，直至将卵黄推出针头。该技术的另一大挑战是存活率问题。在我们的实验中，注射实验溶液后卵的存活率通常介于40%至80%之间。对于刚开始学习该技术的操作者，存活率可能低至10%，但随着练习会逐步提高。如上所述，阴性对照对于研究人员准确评估随着操作熟练度提升而带来的存活率变化至关重要，因为引入不同物质本身可能导致存活率下降（图3C）。

注射时机对于每种实验方法而言同样是一个重要的考虑因素。较老的卵比新鲜产下的卵更难注射，通常情况下，注射较新鲜的卵其存活率也更高。在发育较晚阶段进行针头插入和物质注射可能会导致意外的解剖学损伤。然而，随着操作经验的积累，对孵化后两到三天的卵进行注射也是可行的。在这些阶段，应靶向卵的背侧进行注射，以避免损伤最初在腹侧形成的胚胎。靶向卵的后端可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
荧光解剖显微镜	Leica	M165 FC	带荧光功能的体视显微镜
荧光外部光源	Leica	EL 6000
显微注射仪	Narishige	IM-300	配件可能包括注射针夹持器、进气管（带管路接头）、交流电源线、脚踏开关、硅橡胶垫圈
mCherry滤光立方体	Leica	M205FA/M165FC	适用于mCherry或类似红色染料的滤光立方体即可
显微操作器	World Precision Instruments, Inc.	M3301R	需与磁力支架（Narishige，型号GJ-8）配合使用
磁力支架	Narishige	MMO-202ND
移液管夹持器（针夹）	Narishige	HD-21
连接气源与显微注射仪的管路
卵井模具	3D打印	定制	使用Lulzbot Taz 5打印机以聚乳酸热塑性材料3D打印而成
微波炉	各种品牌
培养箱或温控室	各种品牌		需要维持23.5–26 °C的温度。
蟋蟀饲料	各种品牌		猫粮或鱼饲料均可作为合适的食物。
蟋蟀饮水	各种品牌		水可盛于小瓶中，并通过棉球供给蟋蟀饮用
蟋蟀庇护所	各种材料		庇护材料可包括揉皱的纸巾或蛋盒
玻璃毛细管	World Precision Instruments, Inc.	货号 1B100F-4	Kwik-Fil™ 硼硅酸盐玻璃毛细管，长度100 mm，内径0.58 mm，外径1.0 mm，带丝
微量移液管拉制仪	Flaming/Brown	型号 P-97	由Sutter Instrument Co.经销
磨针仪/微研磨器	Narishige	型号 EG-45/EG-400	EG-400包含显微镜头
培养皿	CellTreat	产品编号 229693	直径90 mm
细沙	Sandtastik Products Ltd.	B003U6QLVS	白色儿童用沙
琼脂糖	American Bioanalytical	AB000972	Agarose GPG/LE 超纯级
卵筛：超细斜纹网不锈钢锥形筛	US Kitchen Supply	型号 SS-C123	孔径应在0.5–1.0 mm之间
青霉素-链霉素	Gibco by Life Technologies	货号 15070-063	Pen Strep
塑料镊子	Sipel Electronic SA	P3C-STD	黑色防静电，118 mm
注射器滤器，直径25 mm，孔径0.45 µm	Nalgene	725-2545	与1 mL注射器配合使用
1 mL注射器，带结核菌素滑动针头	Becton Dickinson	309602	与注射器滤器配合使用以过滤注射缓冲液，Luer-Lok接头注射器也可使用
气罐（可选）	Midwest Products	Air Works®	便携式气罐
罗丹明染料	Thermofisher	D-1817	葡聚糖-四甲基罗丹明，分子量10,000
20 µL上样吸头	Eppendorf	订单号 5242 956.003	epT.I.P.S. 20 μL Microloader
复合显微镜	Zeiss	Axioskope 2 plus
20倍物镜	Ziess	Plan-Apochromat 20x/0.75 M27
相机	Leica	DMC 5400
Leica Application Suite  软件	Leica	LAS	此处使用版本4.6.2