本文描述了含延胡索酰乙酰乙酸水解酶结构域蛋白的表达与纯化方法，并以实例进行了说明（包括在E. coli中的表达及FPLC纯化）。纯化后的蛋白用于结晶及抗体生产，并应用于酶活性检测。文中展示了若干光度法检测方法，以体现FAHD1作为草酰乙酸脱羧酶和酰基丙酮酸水解酶的多功能性。
本文内容
摘要
摘要
富马酰乙酰乙酸水解酶（FAH）结构域蛋白（FAHD）是真核生物中FAH超家族的已鉴定成员。该超家族的酶通常具有多功能性，主要涉及水解酶和脱羧酶的作用机制。本文介绍了一系列连续的方法，用于表达和纯化FAHD蛋白，主要是不同物种（人类、小鼠、线虫、植物等）中的FAHD蛋白1（FAHD1）同源物。所涵盖的方法包括大肠杆菌（E. coli）中的蛋白表达、亲和层析、离子交换层析、制备型与分析型凝胶过滤、结晶、X射线衍射以及分光光度测定。高纯度（>98%）的浓缩蛋白可用于结晶或抗体生产。质量相似或较低的蛋白可用于酶活性测定，或作为抗原用于检测系统（如Western印迹、ELISA）。在本文的讨论部分，概述了FAHD1已鉴定的酶学机制，以更详细地描述其兼具水解酶与脱羧酶的双功能特性。
引言
富马酰乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase, FAH）1,2 酶超家族是一类具有高度保守催化FAH结构域的酶3,4,5,6,7,8,9,10。尽管这些酶具有共同的催化中心，但它们具有多种功能，且大多数存在于原核生物中，用于降解来自复杂碳源的化合物3。迄今为止，在真核生物中仅发现该家族的三个成员：命名来源的FAH2，以及富马酰乙酰乙酸水解酶结构域蛋白1（FAH domain-containing protein 1, FAHD1）11,12,13,14,15 和富马酰乙酰乙酸水解酶结构域蛋白2（FAH domain-containing protein 2, FAHD2）。FAHD1的缺失与线粒体呼吸功能受损13,16 相关，并与一种可逆性的细胞衰老表型相关14，该表型与电子传递系统中间态功能缺陷有关。人类FAHD1及其在模式系统（小鼠、线虫、癌细胞系、植物等）中的直系同源物，以及部分定点突变变体，已成为具有潜在研究价值的可成药靶点。本研究需要高纯度的重组蛋白，以及基于晶体结构和特异性抗体指导的催化机制信息。
本文描述了在大肠杆菌（E. coli）中表达FAHD蛋白、亲和层析、离子交换层析、硫酸铵沉淀、制备型和分析型凝胶过滤、结晶、X射线衍射以及光度测定等方法。所述方法与实验方案的目的是为从事细菌学、植物生物学以及动物和人类研究等不同领域研究的科研人员提供指导，以鉴定FAH超家族成员，包括在特定研究领域中可能变得重要的尚未表征的超家族成员。本文所述的实验方案可为旨在鉴定其他原核或真核生物FAH超家族成员的研究项目提供有价值的帮助。
本文所述方法的理论基础在于，对于功能尚未充分阐明的蛋白质（特别是生理相关性未知的代谢酶），从纯化的重组蛋白入手，有助于开发出一系列极为宝贵的高质量研究工具，例如体外具有活性的酶制剂、高质量抗体，以及针对特定酶的高效且特异性的药理学抑制剂。所述方法需要使用快速蛋白液相色谱（FPLC）和X射线晶体学。其他替代方法（例如，无需化学诱导即可表达蛋白，或通过加热处理后离心、脱盐及尺寸排阻色谱来展示蛋白纯化过程）可参见 elsewhere17。尽管已有更广泛的方法可用于FAH超家族酶的表达与纯化2,7,9,17,18，但本研究特别聚焦于FAHD蛋白的表达与纯化。
在本文的讨论部分，为了阐明FAHD1蛋白（水解酶、脱羧酶）所催化的反应的化学特性，对其已鉴定的催化机制进行了更详细的描述15。基于先前研究7,15,18（PDB: 6FOG, PDB:6FOH）获得的数据表明，该酶可能还具有第三种活性，即酮-烯醇异构酶活性。
方案
1. 在感受态 E. coli 中表达 FAHD 蛋白
- 转化 大肠杆菌 用于表达 FAHD 蛋白的载体
注意：本节讨论的步骤已在示意图中概括。 图1A，B该方案适用于所有FAHD蛋白，包括点突变体。此类突变体可通过定点诱变和PCR技术获得。19 （例如双侧SOE PCR）20来自野生型 cDNA。
图1：扩增有活性的 E. coli 以及蛋白表达的诱导。
（A） 插入 pET 将质粒转入感受态BL21(DE3)细胞 pLysS 大肠杆菌 细菌，见第1节 （B） 热激方案与涂布 pET 转化的 E. coli 细菌，如方案第1步所述。将转化后的细菌涂布于含抗生素的LB琼脂平板上进行筛选。 (C) 扩增 pET 转化的 E. coli 细菌，如第1节所述。从LB琼脂平板上挑取菌落，在营养培养基（LB或NZCYM）中扩增，直至菌液密度达到经验阈值0.4。 (D) 通过DE3-IPTG诱导蛋白表达pET 系统，如第1节所述并示意图所示 图2通过添加化学试剂IPTG启动蛋白质的表达。在第1部分结束时，收集含有目标蛋白质的细菌沉淀。 请点击此处以查看此图的放大版本。- 获取有感受态的 BL21(DE3) pLysS 大肠杆菌 细菌和pET表达载体（参见 材料表）。建议选择一种同样编码 N-末端His标签或相关捕获标签，以方便简化后续纯化步骤。
- 获取所选FAHD蛋白的cDNA，并将其插入pET表达载体的活性克隆位点中，位于T7启动子和T7终止子之间。
- 质粒成功扩增并经验证后［通过商业供应商测序验证（为方便起见，pET系统可使用T7引物：T7启动子正向引物：TAATACGACTCACTATAGGG；T7终止子反向引物：GCTAGTTATTGCTCAGCGG）］，将5–10 ng质粒加入100 µL BL21(DE3)感受态细胞中 pLysS 大肠杆菌 将细菌置于冰上。不要反复吹打，而是轻轻敲击试管以混匀内容物。
- 将细菌置于冰上 30 分钟，每隔几分钟轻轻敲击试管。
- 将加热装置或水浴加热至精确的 42 °C。将含有细菌的试管放入装置中，准确保持 90 秒。立即置于冰上图1A).
- 冰浴5–10分钟后，加入600 µL NCZYM培养基（参见 材料表）并将离心管放入细菌培养箱中，在37 °C下以中等速度沿摇动方向振荡1小时。
- 在10 cm LB-琼脂平板上涂布200 µL细菌培养物（参见 材料表），加入所选的选择性抗生素［例如，针对BL21(DE3)的一种特异性抗生素］ pLysS 抗性（氯霉素），以及一个用于质粒上编码的抗性 pET 载体（卡那霉素或氨苄青霉素， 图1B)].
- 在37 °C细菌培养箱中，将细菌接种于LB琼脂平板上过夜培养。
- 通过IPTG诱导表达FAHD蛋白
注意：以下部分讨论的初始步骤在示意图中进行了概括 图1C，D。该 T7 通过结合细菌DE3表达盒的表达系统 pET 载体系统的总结见于 图2.
图2DE3盒式载体/pET载体双系统详解
（A） 基因组草图 pET 转化了质粒的BL21(DE3)菌株 pLysS 大肠杆菌 细菌。该天然细菌基因组携带一个DE3盒（见图B），以及一个持续表达lac阻遏蛋白单位的lac基因。非天然 pET 载体在特定位置插入了蛋白基因 T7 聚合酶启动子和终止子序列。更多细节见图B。 （B） 原生细菌基因组中的DE3表达盒编码了相关信息 T7 聚合酶在……方面的 E. coli RNA聚合酶操纵子。然而，该蛋白并不表达，因为lac阻遏蛋白阻止了RNA聚合酶与启动子的结合。因此，T7聚合酶未被表达，外源蛋白也未被表达。.（C） 化学诱导剂IPTG的应用（材料表) 会改变lac阻遏蛋白单元的结构，阻止其与DE3盒结合。因此，RNA聚合酶得以结合该盒，从而表达T7聚合酶，最终实现外源蛋白的表达。 请点击此处以查看此图的放大版本。- 成功形成菌落后，挑取一个单一菌落（无任何卫星菌落），将其分散于5 mL含有抗生素的NZCYM或LB培养基中，抗生素种类按前述步骤（1.1.7）所选确定。置于37 °C细菌培养箱中过夜培养。图1C).
- 细菌成功生长后，根据蛋白质产量需求，将细菌在250 mL、500 mL或1 L的培养基中进行扩增培养。
- 根据培养液体积，加入在步骤1.1.7中选定的抗生素，并添加约1%–2%的浓菌预培养液（例如，250 mL培养基中加入2.5–5.0 mL等）。取样（1 mL或以上）用于步骤1.2.5，并测定600 nm处的光密度（OD）。将细菌置于37 °C细菌培养箱中培养2–3 h（图1C).
- 2–3 小时后，取样进行光度分析。如果 600 nm 处的 OD 值达到 0.4，加入 200 µM 至 1 mM 的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG，参见 材料表).
注意：实际数值针对每种FAHD蛋白或点突变变体需通过经验确定，其中1 mM IPTG为应使用的最高浓度。该浓度可诱导蛋白表达。图1D, 图 2C). - 在37 °C细菌培养箱中再培养3–5小时后，蛋白质表达已耗尽。
注意：有关温度控制的说明，请参见讨论部分。诱导后振荡时间不建议超过5小时。取样用于步骤1.2.5（1 mL或以上），测定600 nm处的光密度（OD）。- 收集细菌沉淀 通过 5,000 × 离心 g 5 分钟。弃去上清液，将沉淀物在 -80 °C 冻存以长期保存，或在 -20 °C 短期保存（图1D).
- 通过获取的两个光度学样品（标记为“-I”（诱导前）和“+I”（诱导后））验证诱导效果。将菌体沉淀经离心和重悬后，取等量总蛋白进行SDS-PAGE分析。
注意：“+I”样品应显示与所选蛋白质分子量相对应的强条带，而“-I”样品则不应含有该条带。诱导表达水平较低是蛋白质表达过程中常见问题，但通常表达量已足以满足后续实验步骤的需求。高表达水平具有优势，但并非必需。
2. 细菌沉淀的裂解及碎片过滤
- 根据所选蛋白质是否带有His标签，选择Ni-NTA洗脱缓冲液（带His标签，参见材料表）或预冷的HIC洗脱缓冲液（无标签）。
- 每250 mL原始细菌悬液，向细菌沉淀中加入5 mL选定的缓冲液（250 mL加5 mL，500 mL加10 mL，以此类推）。每5 mL缓冲液中加入10 µL β-巯基乙醇（β-ME）。使用10 mL巴斯德吸管通过刮擦和吹打将沉淀充分悬浮（吹打时避免产生气泡）。最后将全部悬液转移至一个50 mL离心管中。
- 建议对悬液进行超声处理（中等强度，每次15秒，共6次）。
- 在4 °C条件下，以高速（10,000 × g）离心30分钟。将上清液在冰上依次用滤器单元（例如0.45 µm、0.22 µm）过滤。
注意：根据前一步离心情况，直接使用小孔径滤器过滤可能较为困难，通常需先用较大孔径滤器进行预过滤。可加入DNA酶以获得更佳效果。 - 将样品置于冰上保存，并立即根据蛋白质是否带有His标签，进入第3节或第4节操作。
3. 使用 Ni-NTA 亲和层析纯化带 His 标签的 FAHD 蛋白
注意：Ni2+ 离子通过氮川三乙酸（NTA）与用于亲和层析的琼脂糖树脂结合（固定化金属离子层析，IMAC，图3A）。多组氨酸氨基酸标签可牢固结合该Ni-螯合物，从而将His标签蛋白与大多数其他残留蛋白分离。除上述Ni-NTA柱的制备方法外，也可选用预装的Ni-NTA柱并结合FPLC系统进行操作。
图3：常见色谱类型示意图。
(A) Ni-NTA柱的树脂。NTA可螯合二价镍离子，用于固定化金属离子亲和色谱（IMAC）。多组氨酸标签优先结合该结构，并可通过咪唑洗脱。(B) 基于苯基的疏水相互作用色谱（HIC-苯基）中硅胶颗粒的典型涂层。疏水性蛋白质与涂层材料相互作用，在迁移过程中被延迟，而其他蛋白质则不受影响。(C) 离子相互作用色谱中硅胶颗粒的典型涂层。极化和带电蛋白质与涂层材料相互作用，在迁移过程中被延迟，而其他蛋白质则不受影响。(D) 尺寸排阻色谱（SEC）中硅胶树脂的结构。基于硅胶材料中定义的孔径，蛋白质可根据其大小（初步近似对应其分子质量）进行分离。小分子蛋白质可渗透进入多孔柱材料内部而被滞留，大分子蛋白质则绕过多孔颗粒快速迁移。请点击此处查看该图的放大版本。
- 从步骤2.5继续操作（即蛋白处于Ni-NTA洗脱缓冲液中，并已在冰上用0.22 µm滤器过滤）。
- 准备一个空的塑料或玻璃层析柱，清洗空柱并将其固定在稳定的支架上。根据蛋白悬液体积选择合适的层析柱大小。
- 每10 mL蛋白悬液，向层析柱中加入500 µL Ni-NTA琼脂糖凝胶浆液（使用前剧烈震荡）。用移液器将浆液缓慢、逐滴加至层析柱底部滤膜上。静置数秒，使凝胶沉降。
- 用Ni-NTA洗脱缓冲液完全充满层析柱，注意不要扰动琼脂糖树脂。依靠重力使缓冲液自然流过。可通过拇指施加压力（使用盖子或手套并用拇指按压）加速此过程，但需注意避免破坏琼脂糖树脂结构。
- 加入蛋白悬液。同前，依靠重力使样品自然流过。不建议在此步骤中使用拇指加压，因为较低的流速有助于蛋白与层析柱的结合。将穿流液收集至离心管中（材料表）。
- 待样品完全通过后，再次用Ni-NTA洗脱缓冲液充满整个层析柱。注意避免扰动琼脂糖树脂。让缓冲液依靠重力流过；与前一步不同，此步推荐使用拇指加压以加快流速，因为这样可破坏由于非特异性相互作用导致的潜在污染物结合。将洗涤液收集至离心管中，并重复此步骤一次。
- 在层析柱下方放置一个紫外透光比色皿，加入1 mL Ni-NTA洗脱缓冲液。不要对树脂施加任何拇指压力，直接收集洗脱液。
- 测定样品在280 nm处的光密度（OD），以空白样品（即Ni-NTA洗脱缓冲液）为对照。理想情况下，样品OD值应大于2.5；若OD低于0.5，则表明样品中无显著量的蛋白。
注意：如讨论部分所述，不同FAHD蛋白可能需要分别优化洗脱缓冲液中的盐浓度和咪唑浓度。 - 重复步骤3.1.7和3.1.8，直至OD值低于0.5。将所有OD较高的样品合并收集于冰上的离心管中。
- 从步骤3.1.4重新开始，将步骤3.1.5中的穿流液作为新一轮步骤3.1.5的输入样品。重复该过程，直至步骤3.1.6中首次收集的样品OD值低于0.5。
注意：如讨论部分故障排除所述，His标签蛋白可能与Ni2+-树脂结合不充分。在此类情况下，需重复本步骤或采用其他方法（如离子交换层析）。 - 取所有中间组分样品进行SDS-PAGE分析。
- FAHD蛋白在Ni-NTA洗脱缓冲液中经历冻融后会发生沉淀。因此，需将蛋白对另一种缓冲液进行透析（冰上过夜，每100 mL透析缓冲液中加入1 µL DTT）。透析缓冲液应选择低盐类型，具体取决于后续将进行的离子交换层析种类。使用常见的纤维素透析管，典型截留分子量为14 kDa（材料表）。
- 过夜透析后，可选使用超滤离心管浓缩蛋白。进行SDS-PAGE分析（12.5%分离胶，4%浓缩胶），以检测是否存在蛋白损失、洗脱不完全或总体蛋白纯度问题。若结果良好，则进入第5节操作。
4. 通过疏水相互作用色谱法（HIC）纯化无标签FAHD蛋白
注意：FPLC 疏水相互作用色谱柱（HIC 柱）中硅胶涂层表面的苯基（图 3B）可依据蛋白质的疏水特性实现分离。所述步骤应使用配备 5 mL 苯基疏水相互作用色谱柱（HIC-苯基柱）的 FPLC 系统进行。色谱柱可用 1 M NaOH 清洗后重复用于不同蛋白质的纯化。然而，一旦色谱柱用于某一类型的 FAHD 蛋白，应仅限再次用于同种类型的 FAHD 蛋白。
- 硫酸铵（AS）沉淀
- 从步骤2.5继续操作。蛋白质处于冰冻的HIC运行缓冲液中（材料表）。
- 精确测定所制备蛋白溶液的体积（精确至微升，V初始）。缓慢逐滴加入预冷的含硫酸铵HIC运行缓冲液，直至达到35%体积比的硫酸铵饱和度：加入的VAS = V初始 × 0.538。轻轻搅拌溶液30分钟。在4 °C下以高速（≥10,000 × g）离心15分钟。
- 在冰上使用0.22 µm滤器过滤上清液。可选：取样进行SDS-PAGE分析：按1:4稀释后立即在95 °C加热5分钟，否则样品会结块。此时样品可冷冻保存（-20 °C），以便改日继续操作。
- 使用HIC柱进行FPLC纯化
- 设置FPLC系统，并用5个柱体积（CV）的20%乙醇（溶于H2O）冲洗5 mL HIC-苯基柱，随后用5 CV的H2O平衡柱子。
- 准确混合260 mL HIC运行缓冲液与140 mL含硫酸铵的HIC运行缓冲液，得到35%体积比的硫酸铵溶液。检测pH值（应为7.0）；此为缓冲液A。缓冲液B为250 mL运行缓冲液。向缓冲液A和B中各加入1 mM DTT，然后置于冰上保存。
- 按顺序用8 mL缓冲液A、8 mL缓冲液B和8 mL缓冲液A对柱子进行平衡。将步骤4.1中制备的样品上样。用缓冲液A洗涤，直至280 nm处的基线光吸收达到1000–500 mAU。
- 使用缓冲液A和B的混合液，使硫酸铵浓度为33%（w/v）。洗涤1个柱体积，使色谱图出现平台期。设置缓冲液B的梯度（随时间逐渐增加至100%缓冲液B）：3.8分钟内加入1.5 mL缓冲液B（即每毫升增加1%缓冲液B，最终达到5.7%缓冲液B）。当280 nm处的UV信号上升时，开始收集洗脱组分，并立即置于冰上。
- 最后用缓冲液B冲洗柱子。取所有组分样品进行SDS-PAGE分析。使用液氮速冻所有样品，并在-80 °C保存。
- 进行SDS-PAGE（及Western blot）分析，以检测各收集组分中的FAHD蛋白。将含有目标蛋白的组分合并，用于后续纯化步骤（如下一操作流程所述）。用H2O和20%乙醇（溶于H2O）清洗柱子。
5. 通过离子交换色谱纯化FAHD蛋白
注意：带有带电官能团的分子会结合到用于FPLC的硅胶颗粒柱上（图3C）。这使得可以根据蛋白质的离子特性（例如表面电荷）对其进行分离。所述步骤应分别使用FPLC仪器及相关操作技术来完成。该方法在阳离子交换色谱和阴离子交换色谱中均相同，但所用缓冲液略有不同。
- 选择阳离子或阴离子交换色谱系统。该选择为经验性，可能因 FAHD 蛋白的不同而有所差异。理想情况下，可依次连续使用两种方法。
- 搭建 FPLC 系统，先用 5 CV 的 20% EtOH（溶于 H2O）清洗色谱柱，随后用 5 CV 的 H2O 冲洗。按顺序用 1 CV 的低盐缓冲液、高盐缓冲液，再用一次低盐缓冲液对色谱柱进行平衡。
- 将样品（已在步骤 3.1.11 中使用正确的低盐缓冲液透析）上样至色谱柱。收集穿流组分，并用低盐缓冲液冲洗色谱柱 1 CV。
- 设置梯度洗脱程序：在 1 mL/min 流速下 30 分钟内或 0.5 mL/min 流速下 60 分钟内，由 100% 高盐缓冲液进行洗脱。可根据已知的 FPLC 色谱图重新调整条件，以优化纯化效果。收集所有洗脱峰对应的组分。
注意：高盐条件可能因 FAHD 蛋白的不同而异，详见讨论部分。 - 梯度洗脱结束后，继续用高盐缓冲液洗脱 1 CV，直至无新的洗脱峰出现（收集相应组分）。
- 取所有收集组分的样品进行 SDS-PAGE 分析（12.5% 分离胶，4% 浓缩胶）。将各样品在液氮中速冻后，于 -80 °C 保存。
- 完成 SDS-PAGE 分析后，合并含有 FAHD 蛋白的组分，弃去其余组分。可选步骤：使用超滤离心管对蛋白进行浓缩。
- 向柱内加入 1 mL 的 25% SDS（溶于 0.5 M NaOH）或其他去垢剂以清洗色谱柱。随后用 H2O 和 20% EtOH（溶于 H2O）依次冲洗色谱柱。
- 可选步骤：使用另一种类型的色谱柱（阳离子或阴离子交换色谱）重复第 5 节操作。通过该方法获得的蛋白纯度已足以进行基础活性测定，或可用于晶体学筛选实验。如需进行更高级的应用，请继续进行第 6 节操作。
6. 通过尺寸排阻色谱法（SEC）纯化FAHD蛋白
注意：FPLC 系统中硅胶柱内的多孔颗粒可根据分子大小（如流体动力学半径）对蛋白质进行分离（图 3D）。以下步骤需使用 FPLC 系统并结合尺寸排阻色谱柱（SEC 柱）进行。
- 根据通过SDS-PAGE和银染检测到的残留污染物的分子量，选择合适的凝胶过滤层析柱。所述方法适用于两种类型的层析柱。用400 mL H2O对层析柱过夜清洗，并用凝胶过滤层析缓冲液进行平衡。建议编写FPLC系统的程序以自动化此步骤。
- 向300 mL凝胶过滤层析缓冲液中加入1 mM DTT，并置于冰上。此即为流动缓冲液。将60 mL该缓冲液上样至层析柱中。
- 将蛋白样品在10,000 × g 条件下离心10分钟，以去除任何微量沉淀。将上清液上样至层析柱。通常建议在FPLC前对上清液进行过滤。
- 用流动缓冲液冲洗层析柱，直至所有蛋白被洗脱。将所有洗脱峰按适当体积（例如2 mL）分步收集。取样进行SDS-PAGE分析，并用液氮速冻所有组分。将冻存的组分于-80 °C保存。
- 在完成SDS-PAGE（及Western blot）分析后，收集并合并所有含有FAHD蛋白的组分。建议使用银染法检测可能仍存在的微量杂质。
- 使用超滤离心浓缩装置对蛋白进行浓缩。尽管FAHD蛋白不一定需要此步骤，但通常建议在进行酶活性测定或结晶前进行脱盐处理（例如透析）。
- 重复步骤6.3–6.6多次，采用不同的流速和盐浓度（经验性条件），以提高FAHD蛋白的纯度。用H2O和20%乙醇（溶于H2O）对层析柱过夜清洗。
7. 使用底物草酰乙酸和乙酰丙酮酸进行基本的FAHD活性测定
注意：FAHD 蛋白 1（FAHD1）具有草酰乙酸脱羧酶（ODx）和酰基丙酮酸水解酶（ApH）活性。此内容在讨论部分中有更详细的说明。由于在水溶液中存在酮-烯醇互变异构导致的不稳定（即烯醇化），草酰乙酸会随时间自发降解（自脱羧），其降解程度依赖于辅因子浓度和 pH 值。在 pH 约为 7、温度为 25 °C 时，该效应并不显著，但实验仍需设置空白对照，以校正自脱羧作用及酶浓度的影响。加样方案见图 4A。通常建议使用经过良好校准的移液器进行本实验，因为该检测对微小的移液误差较为敏感。
图4：酶活性测定的移液方案示意图。
(A) 基于底物的FAHD蛋白酶活性测定的基本移液方案示意图。底物空白组：-S/-E；底物样品组：+S/-E；酶空白组：-S/+E；酶样品组：+S/+E（S：底物，E：酶）。详见实验方案第7步。(B) 用于评估FAHD蛋白米氏动力学的移液方案示意图。底物空白组：-S/-E；底物样品组：+S/-E；酶空白组：-S/+E；酶样品组：+S/+E（S：底物，E：酶）。详见实验方案第8节。请点击此处查看该图的放大版本。
- 启动酶标仪，并在 25 °C 下平衡 30 分钟。设置程序以在 255 nm 波长下读取 12 个孔（如图 4A所示），建议使用 25 次重复读数，每次间隔 5 毫秒。设置一个循环，每 2 分钟测量一次，共测量 15 次（总计 30 分钟）。
- 默认情况下，配制含 1 mM MgCl2、pH 7.4 的酶反应缓冲液（见材料表）。不同变体的 FAHD 蛋白可能需要不同的辅因子或 pH 条件。Mg2+ 和 Mn2+ 是已知的 FAHD1 的辅因子3,11,12,21。
- 用酶反应缓冲液（材料表）稀释，制备浓度为 1 µg/µL 的蛋白溶液。
- 在酶反应缓冲液中配制 1 mL 浓度为 20 mM 的待测底物溶液（目前已鉴定的 FAHD 蛋白底物列于其他文献中3）。
- 根据图 4A所示的加样方案，准备酶空白孔和样品孔：向各孔中加入 90 µL 酶反应缓冲液（材料表），再加入 5 µL（5 µg）酶溶液。
- 根据图 4A所示的加样方案，准备底物空白孔和样品孔：向各孔中加入 95 µL 酶反应缓冲液。
- 在开始测量前，向六个空白孔中各加入 5 µL 酶反应缓冲液；向样品孔中各加入 5 µL 20 mM 底物溶液。建议使用多通道移液器。
- 将多通道移液器调至 50 µL，轻轻混匀所有孔中的液体。先从空白孔开始，再处理样品孔，注意避免产生气泡。将微孔板插入酶标仪中，按照步骤 7.1 所述，在 255 nm 波长下读取每个孔的吸光度。
- 在电子表格中进行数据分析。将分光光度计的原始数据复制到电子表格中，并将所有实验设置（即全部记录信息）填写至另一工作表中。对四种处理方式各自的三个重复孔数据取平均值，用样品值减去空白值。同时计算标准差，并将空白与样品的标准差合并计算。
- 绘制数据曲线（y 轴：光密度，x 轴：时间，单位为分钟）。应得到一条指数下降曲线。根据所用底物种类的不同，可能在前 10 分钟内观察到信号短暂上升，随后信号开始下降。此现象归因于底物的酮-烯醇互变异构，详细解释见讨论部分。
- 将随时间变化的光信号数据除以曲线的最大值，使数据归一化至 [0, 1] 范围内（示例见图 5A）。确定曲线线性下降的起始阶段，计算其负斜率（单位：1/分钟）。
- 光密度（OD）随时间下降的动力学与底物的初始浓度相关：100 nmol/孔 × 斜率。结合测定的蛋白浓度 c0,，可计算比活性：100 nmol/孔 × 斜率 × 1/c0。若将 c0 表示为 µg/孔，则由此计算出的比活性单位为 nmol/min/µg，等同于 µmol/min/mg。
8. 评估 FAHD 蛋白的米氏动力学
注意：评估 FAHD 蛋白的米氏动力学较为繁琐，因为其特异性蛋白活性依赖于蛋白-底物的相对浓度以及反应发生的物理体积。必须建立稳态动力学，才能获得可靠的结果。以下步骤概述了在 96 孔紫外透明板上经过验证的实验方案。每一步都必须谨慎操作，因为微小的误差通常会导致实验失败。建议在尝试下述更复杂的实验之前，先熟练掌握第 7 节中所述的检测方法。
图5：酶活性测定的典型结果。
(A) 基于基础底物的FAHD蛋白酶活性测定中获得的典型紫外吸收曲线（归一化至0到1范围内），并包含标准差。在任意时间点t的光密度（OD）比值 [OD(t)/OD(0)] 均相对于初始OD值 [t = 0；OD(0)] 进行归一化处理。详见实验方案第7节。(B) 人源FAHD1蛋白的典型米氏-门顿（Michaelis-Menten）动力学曲线，并包含标准差。详见实验方案第8节。请点击此处查看该图的放大版本。
- 启动酶标仪，并在 25 °C 下平衡 30 分钟。设置程序以读取 72 个孔（按文中所述方案） 图4B在255 nm处检测。建议使用25次多重读数，每次间隔5 ms。设置循环程序，每2分钟测量15次，共30分钟。
- 执行步骤 7.2 和 7.3，然后在酶活性测定缓冲液中配制 1 mL 的 100 mM 底物溶液。
- 在酶活性测定缓冲液中配制底物溶液的系列稀释液：40 mM、20 mM、10 mM、6 mM、4 mM、2 mM。实验采用成对（“调整”）的酶与底物浓度进行。为此，在酶活性测定缓冲液中配制以下酶溶液的稀释液：0.5 µg/µL、0.4 µg/µL、2.5 µg/µL、2 µg/µL、1.5 µg/µL、1 µg/µL。
- 如图所示的所有孔中 图4B 加入180 µL酶检测缓冲液。向底物（空白和样品）各孔中加入10 µL酶检测缓冲液。向酶（空白和样品）各孔中加入10 µL已配制的蛋白稀释系列。向底物空白孔和酶空白孔中各加入10 µL酶检测缓冲液。
- 测量前立即向底物样品和酶样品的孔中各加入10 µL已配制的底物稀释系列溶液。
- 使用多通道移液器在50 µL档位，从空白孔开始，依次轻柔混匀所有孔，避免产生气泡。
- 将酶标板放入微孔板读数仪中，按照步骤8.1所述，在255 nm处测定每个孔的吸光度。在电子表格中进行数据分析。将分光光度计的原始数据复制到电子表格中，并将所有设置参数（即全部记录信息）填写至另一工作表中。
- 按照步骤 7.11 至 7.14 所述，对稀释系列中的每个数据点进行独立的数据分析。最终获得所有比活性值，并将其对初始底物浓度（2 mM、1 mM、0.5 mM、0.3 mM、0.2 mM、0.1 mM）作图。
- 显示所有数据点及其各自的標準偏差。計算機米氏動力學 通过 非线性曲线拟合，或通过Lineweaver-Burk分析。可能需要重新测量个别数据点，并在步骤8.5和8.6中调整各个蛋白质浓度与底物浓度配对的比例。人FAHD1的米氏动力学图谱如下所示 图5B.
9. FAHD 蛋白的结晶
注意：FAHD 蛋白（人源 FAHD1，此前已有描述15）的结晶可通过24孔板中的悬滴气相扩散法实现（图6A）。下文提供了使用该技术结晶人源 FAHD1 的逐步操作方案15。更详细的说明见讨论部分。
图6：FAHD蛋白的结晶。
(A) 标准24孔或96孔SBS规格的结晶板。详见第9节。(B) FAHD蛋白结晶的基本板式设置流程。该图经许可重绘23。详见第9节。(C) 人源FAHD1晶体及其对应的衍射图样（小插图）。插图中标注了最小晶格间距，用以衡量晶体的衍射质量。数值越小，表明分辨率越高，所得数据信息量越大。详见本实验方案的第9节。请点击此处查看该图的放大版本。
- 确保将蛋白用凝胶过滤层析缓冲液进行透析。FAHD1 蛋白的浓度应较高（2–5 mg/mL）。浓度过低时，蛋白可能因缺乏自发成核而无法结晶。
- 准备不少于 20 mL 的结晶储液。使用蒸馏水或去离子水作为溶剂，配制三种储备液：1 M Na-HEPES（至少 25 mL，pH 调至 7.5）、50%（w/v）聚乙二醇 4000（PEG4k）（至少 65 mL）和 1 M MgCl2 (10 mL)
- 设置一个 4 × 6（共 24 个）不同的 15 mL 离心管阵列，根据对应板上的位置进行标记（例如，行（A、B、C、D）与列（1–6）组合，如“A1”、“B5”、“D6”等）.用移液器将1 mL 1 M Na-HEPES加入每个试管中。
- 将1 mL 50% (w/v) PEG4k移液至各管A行，2 mL至B行，3 mL至C行，4 mL至D行。移液100 µL 1 M MgCl₂2 向第1列的试管中加入250 µL，第2列加入250 µL，第3列加入500 µL，第4列加入1.0 mL，第5列加入1.5 mL，第6列加入2.0 mL。
- 用蒸馏水或去离子水将所有试管定容至10 mL，试管上的刻度应具有足够的准确性。
- 从冰箱（或冰上）取出人源FAHD1蛋白样品（约5 mg/mL），在4 °C下使用台式离心机以最大转速离心至少10分钟。如需与草酸盐共结晶，从储备液中加入草酸盐，使蛋白样品中草酸盐的终浓度为2 mM。加入1 mM DTT，置于冰上保存。
- 同时，在18 °C的温控室内打开一个24孔结晶板。使用细玻璃棒或塑料棒，将一层薄薄的石蜡油均匀涂布在24孔板每个孔的上缘。向结晶板各对应孔中加入800 µL已配制好的结晶缓冲液（A1至D6）。
- 将新的22 mm盖玻片放置于洁净的表面上。避免盖玻片被灰尘或污物污染。如有必要，使用压缩空气或除尘喷雾清除盖玻片上的杂质。
- 离心完成后，避免摇动蛋白质样品，以防沉淀在管底的聚集体和碎片重新悬浮。在后续步骤中，应从溶液表面下方吸取蛋白质样品，以避免搅起底部的聚集体和沉淀物。
- 每个孔（参见 图6B用移液器将1 µL蛋白质溶液加到盖玻片中央，再向蛋白液滴中加入1 µL相应的储液槽混合液，避免产生气泡。将盖玻片翻转，盖在孔的上方，使油密封盖玻片与孔之间，形成气密环境。重复操作直至完成24孔板。
- 将该培养板置于18 °C保存，并使用合适的显微镜按递进时间表观察液滴。人源FAHD1晶体通常在过夜后出现（参见 图6C).
结果
从已制备好的克隆载体和购买的BL21(DE3) pLysS E. coli出发，通过热激或任何其他合适的方法将质粒导入细菌（图1）。经过短暂扩增后，将转化后的细菌涂布于LB琼脂平板上，过夜培养。此时平板的外观可能因多种潜在误差来源而有所不同，可能无菌落生长（即无菌落）、细菌完全过度生长，或介于两者之间。在图7A中展示了转化效果理想与非理想情况下LB琼脂平板的两个示例。菌落过多通常表明涂板的细菌量过多（较可能），或所用抗生素可能已失效（较不可能）。菌落过少则可能表明转化时使用的质粒量不足（下次应增加用量），或用于筛选细菌的抗生素浓度过高。无论如何，只要出现菌落，通常即为有效转化，因为使用两种选择性抗生素意味着未转化的细菌生长的概率极低。若完全无菌落生长，则可能原因包括：细菌丧失了转化能力（如因储存不当、长期储存、反复冻融等）、热激失败（质粒未成功导入或因温度过高导致细菌死亡）、克隆载体损坏，或误用了错误的选择性抗生素（请核实质粒载体上的抗性基因）。
图7细菌转化与IMAC的代表性结果。
（A） 转化BL21(DE3)菌株的典型LB琼脂平板 E. coli，按照步骤1.1操作获得。左图：菌落分布良好的平板（阳性示例）。右图：仅有一个单菌落的平板（阴性示例）。白色圆圈标记了形态良好的菌落。红色圆圈标记了相互距离过近的菌落，只要存在孤立菌落，就不应挑选这些菌落。 （B） 一系列诱导对照的12.5%丙烯酰胺SDS-PAGE分析（“-”表示IPTG诱导前；“+”表示IPTG诱导后、收集菌体前），已调整至总蛋白量相等。此步骤详见1.2步。 (C) Ni-NTA 纯化过程的典型 12.5% 丙烯酰胺 SDS-PAGE 分析 他的标记的FAHD1蛋白。这在方案的第3节中有描述。亲和层析获得的蛋白纯度很高（>70%（黑色箭头），但也观察到一些微小的污染条带（红色箭头）。这些污染来源于非FAHD蛋白与层析柱的结合，以及与FAHD蛋白结合的其他蛋白。 请点击此处以查看此图的放大版本。
筛选并挑取已验证的菌落。在营养培养基中扩增后，通过添加化学诱导剂 IPTG 触发蛋白表达。收集含有以毫克量级表达蛋白的细菌沉淀，并通过 SDS-PAGE 验证表达情况（例如参见图 7B）。尽管该过程总体简单，但仍可能出现一些问题。第一，某些蛋白会形成包涵体，因其似乎以某种方式干扰了宿主细菌的正常代谢。在人源 FAHD1 和 FAHD2 的某些点突变中已观察到此类现象。在此类情况下，可考虑改用其他表达系统（如昆虫细胞）进行表达，可能更为合适。例如，从昆虫细胞获得沉淀后，后续蛋白纯化步骤仍可按照本方案所述进行。第二，DE3-pET 系统有时会出现“渗漏表达”现象（即在加入 IPTG 诱导前，蛋白已发生一定程度的表达）。该现象的具体原因尚不明确，但可尝试在低温培养箱中过夜缓慢诱导表达，可能有助于改善。第三，无蛋白表达。这可能是最糟糕的情况，通常提示质粒载体可能已发生突变，建议对质粒进行测序以确认。
如果使用了His标签对蛋白质进行标记，则采用Ni-NTA琼脂糖进行亲和层析是一种简便且经济的捕获方法，可去除大部分杂质（图7C）。其他标签系统也有类似的方法（例如，STREP-II）。若未使用标签，则可通过硫酸铵沉淀联合连续的疏水交换层析，将目标蛋白与大多数其他蛋白质分离（图8A）。然而，通过比较两种方法（图7C 与 图8A），SDS-PAGE分析可证明Ni-NTA方法具有更优的纯化效果。因此，建议使用带His标签的蛋白质。
图8：FPLC实验（HIC，离子交换、SEC）的代表性结果。
(A) 在未标记FAHD1蛋白经硫酸铵（AS）沉淀后，进行HIC-苯基层析的典型色谱图及12.5%丙烯酰胺SDS-PAGE分析，操作如方案第4节所述。绿色线条表示不含AS的B缓冲液梯度，在此过程中AS逐渐被洗脱出系统。将本图与图7C比较，可显示Ni-NTA亲和层析相较于HIC-苯基方法的优势，以及使用His-标签系统进行蛋白质纯化的优点。(B) 经Ni-NTA纯化后的His-标签FAHD蛋白进行阳离子交换层析的代表性色谱图及12.5%丙烯酰胺SDS-PAGE分析。通过盐梯度洗脱，上样样品被分离为不同的蛋白质组分。(C) 经阳离子交换层析后的His-标签FAHD蛋白进行G75分子筛排阻层析（SEC）的代表性色谱图及12.5%丙烯酰胺SDS-PAGE分析。请点击此处查看该图的放大版本。
随后，通过阳离子/阴离子交换色谱法（例如参见图8B）进一步将蛋白质与残留的杂质分离，再进行凝胶过滤色谱（例如参见图8C）。建议按此顺序建立初步纯化策略；然而，应组合使用这些层析柱，并依不同顺序依次调整，直至蛋白质达到足够的纯度。
为了对活性底物和/或辅因子进行“有或无”的判断，可使用经 Ni-NTA 纯化后的 His-标签蛋白，或经离子交换柱纯化后的无标签蛋白进行简单的活性测定。特异性活性和动力学常数的测定必须使用纯度最高的蛋白。可在离子交换柱纯化后的蛋白基础上尝试结晶，但晶体质量几乎总是与蛋白纯度相关。多克隆抗体可在纯化方案的任何阶段针对目标蛋白制备；然而，抗体质量同样与蛋白纯度密切相关。
讨论
关键步骤
FAHD 蛋白对盐浓度非常敏感。在低 NaCl 浓度下，蛋白质在解冻时可能发生沉淀，但通常可在较高盐浓度下完全重新溶解。也就是说，如果 FAHD 蛋白因某种原因发生沉淀，可通过提高盐浓度（>300 µM）进行回收或复性。然而，某些疏水性更强的蛋白质可能无法恢复（例如人源 FAHD2），此时可使用 CHAPS（最高 1%）或甘油（10%）等去垢剂以维持其在溶液中的稳定性。无论何种情况，均建议使用液氮速冻并保存于 -80 °C，因为这种方法解冻过程温和且缓慢。
在3.1.10步骤的Ni-NTA纯化过程中，可能会出现一些意外问题。值得注意的是，如果第二次收集的样品OD值高于第一次样品，表明琼脂糖树脂的用量过高（应记录此情况，并在下次实验中减少树脂用量）。此外，琼脂糖树脂本身在280 nm处会产生OD信号（即树脂床的破坏会产生人为的信号）。如有疑问，建议使用其他方法（如Bradford法或BSA法）测定蛋白质浓度。
在酶学测定中，有三个关键方面需要考虑。首先，准确测定蛋白质浓度对于获得正确的比活性至关重要。蛋白质的纯度水平会影响实验结果，因此需要进行估算。对于带标签的蛋白质，必须计算标签部分的质量，并相应地校正比活性。对于本方案第7节中描述的简单测定，Ni-NTA纯度足以区分活性与非活性底物、辅因子等。而在更复杂的米氏动力学（Michaelis-Menten kinetics）测定中，则必须准确确定所有反应物和底物的浓度。特别是使用草酰乙酸（其会随时间自发脱羧）时，必须根据自发脱羧反应对酶促反应部分进行校正（假设这两个反应同时发生）。此外，还需考虑底物酮-烯醇互变异构引起的光密度信号初始变化。第三，必须正确调整浓度和体积。即使酶和底物浓度相同，不同反应体系体积也可能导致不同的实验结果。如果每孔中酶量过多，液体的黏附效应实际上可能造成结果偏差。
为评估米氏动力学，建议先以 100 µL、200 µL 和 300 µL 的反应体系进行初步实验，以确定最佳组合。类似的因素也适用于动力学测定中酶与底物浓度的比例。每单位底物中酶过多或每单位酶中底物过多，都会使系统偏离线性稳态的米氏动力学范围。因此需要通过初步实验优化这些条件。第 8 节提供了人源 FAHD1（野生型）蛋白的示例性调整方案，结果可得到动力学图谱（例如 图 5B 所示）。
进行结晶时，将一滴蛋白质溶液用移液器滴加在盖玻片中央，并与一滴结晶缓冲液混合，该结晶缓冲液通常由缓冲剂（例如 Tris-HCl、HEPES）和沉淀剂（例如聚乙二醇、硫酸铵）组成。可选择性地加入一滴抑制剂溶液以进行共结晶（如本实验方案中的草酸盐）。随后将盖玻片倒置，覆盖在含有结晶缓冲液的储液井上方，并借助密封油将井口完全密封（图6B）。理想情况下，在实验开始时液滴内不发生沉淀，即蛋白质仍保持溶解状态。由于储液井中沉淀剂的浓度高于液滴中的浓度，液滴中的水分子会通过蒸发逐渐扩散至井内气氛中，直至与储液井达到平衡。水分向储液井的扩散导致液滴体积缓慢减少，进而引起液滴中蛋白质和沉淀剂浓度的同步升高。当蛋白质溶液达到所需的过饱和状态（即亚稳态）时，可能发生自发成核并继而生长出晶体。达到过饱和状态是结晶的必要条件，但并非充分条件。蛋白质结晶需要同时满足有利的热力学和动力学条件，并且在很大程度上取决于待结晶蛋白质本身不可预测的性质22。
修改与故障排除
在E. coli中表达蛋白时，表达效率可能较低。对于每种新蛋白，可能需要测试不同的IPTG浓度、表达温度和诱导时间（例如室温下数小时或4°C过夜），以确定最佳表达条件。对于疏水性较强的FAHD蛋白，有时会观察到蛋白在包涵体中沉淀。在此类情况下，建议在其他表达系统（如昆虫细胞）中进行蛋白表达，因为包涵体的形成概率较低26。
由于FAHD蛋白对盐浓度、辅因子浓度以及pH值敏感，不同同源物、直系同源物及点突变变体的纯化策略可能因实验条件而异。此处描述的纯化方法适用于野生型人源和鼠源FAHD1蛋白。对于等电点（pI）不同的蛋白，可能需要调整化学试剂（如NaCl和咪唑）的浓度以及pH值。值得注意的是，并非所有His标签蛋白均能有效结合Ni-NTA树脂。若蛋白在Ni-NTA柱上的结合效率较低，可通过调整Ni-NTA洗脱缓冲液中的NaCl和咪唑浓度，或改变pH条件，以提高纯化效果。若仍无效，可跳过Ni-NTA步骤，直接进行离子交换层析，这也可能实现成功的纯化。若蛋白能够结合Ni-NTA柱但无法被洗脱，加入数毫摩尔（mM）的EDTA可能有助于破坏Ni2+复合物。
关于结晶过程，需要理解的是，大而复杂的蛋白质分子自发组装成规则的周期性晶格是一种本质上极不可能发生的过程，其结果高度依赖于难以控制的动力学参数。即使结晶实验条件发生微小变化，也可能显著改变结果，导致无法形成晶体。蛋白质纯度通常至关重要。一般而言，在严重过载的SDS-PAGE凝胶中不应观察到其他条带。此外，操作步骤的顺序也可能影响实验结果。例如，为了确保可重复性，通常需要保持加样顺序一致，即先加入蛋白质，最后加入沉淀剂至结晶液滴中（或相反）。无论采用哪种方法，在尝试重复实验或放大实验规模时，都应保持操作方法一致。如果按照此方案未观察到晶体，可对化学沉淀剂的组成、pH值、液滴体积以及蛋白质与沉淀剂的比例进行小幅度调整。耐心以及对液滴持续一致的观察是成功的关键。
关于FAHD1催化机制的说明
本文所述方法专门用于获得高质量的FAHD1蛋白，从而实现了FAHD1晶体的生长，并成功构建了包含FAHD1与抑制剂（草酸盐，PDB:6FOG）复合物的晶体。X射线结构揭示了该酶催化腔的三维构象，这些结果系统地描述了可能对该酶催化机制具有重要作用的氨基酸残基。FAHD1最初被报道具有裂解酰基丙酮酸（乙酰丙酮酸、富马酰丙酮酸）的能力11。随后研究发现，FAHD1还具有催化草酰乙酸脱羧的活性12。尽管底物酰基丙酮酸与草酰乙酸在化学结构上不同，但其化学转化在机理上均涉及一个共同的C3-C4键的断裂过程，当C3-C4键轨道与C2-羰基的π轨道保持正交时，该过程在能量上更易发生15。这种构象有利于在裂解过程中瞬时形成的C3-碳负离子通过共振得以稳定。FAHD1的底物（草酰乙酸和酰基丙酮酸）为柔性分子，可存在互变异构（酮-烯醇式）以及C2-水合形式（图9A）。不同物种之间的平衡主要取决于缓冲液组成、pH值以及金属离子的存在。下文将结合X射线晶体结构分析所揭示的FAHD1催化中心特征，讨论可能的催化机制假说。
图9：人源FAHD1催化机制的详细说明。
(A) 草酰乙酸在结晶状态以及中性溶液中主要以Z-烯醇形式存在24。然而，在生理pH条件下，2-酮式是其主要存在形式25。 (B) hFAHD1活性腔的化学示意图15，显示与Mg结合的草酰乙酸（左侧）和酰基丙酮酸（右侧，R1为有机基团；红色箭头表示邻近稳定水分子的亲核攻击）（见讨论部分）。 (C) FAHD1脱羧酶机制（b到c）与水解酶机制（b’到c）中C3-C4断裂优势构象的比较：两种过程均生成与Mg配位的丙酮酸烯醇负离子（见讨论部分）。中间体b和b’预计由Q109稳定，如图B所示（见讨论部分）。 请点击此处查看该图的放大版本。
FAHD1 的脱羧酶活性
草酰乙酸以结晶态存在，且在中性溶液中主要以Z-烯醇式形式存在24。然而研究表明，在生理pH条件（pH 7.4的缓冲体系）下，草酰乙酸主要以2-酮式形式存在25（图9A），且烯醇化并非脱羧反应的先决条件27。值得注意的是，在pH 7.4或更低条件下，Mg2+离子对草酰乙酸不同存在形式的比例无显著影响28。根据结合草酸盐的FAHD1酶复合物结构（PDB: 6FOG15）的引导，将草酰乙酸的酮式构象置于FAHD1的催化中心，发现残基Q109在调控结合态草酰乙酸构象中起构象调节作用15。如另一篇文章所述15，Q109的氨基甲酰基通过氢键作用稳定了草酰乙酸围绕C2-C3键旋转后形成的构象（图9B，左图）。由于该旋转，待断裂的C3-C4键相对于C2羰基的π轨道接近正交排列（图9C）。随后可释放二氧化碳。该过程的初始产物应为共振稳定的丙酮酸镁-烯醇化物。已有对草酰乙酸-Mg复合物的研究表明，烯醇化物形式可形成最稳定的复合物28,29。若假设Mg-丙酮酸烯醇化物复合物具有类似的稳定性，则FAHD1的辅因子可能被占据而无法释放；但赖氨酸残基K123可通过质子化丙酮酸烯醇化物，建立平衡以防止辅因子的丢失15。
上述解释表明，在FAHD1的催化ODx功能中，丙酮酸烯醇式是一种明确的中间产物。在假设模型的这一步骤中，实验数据并未进一步揭示为何封闭的盖子应打开以释放产物。然而可以推断，该提出的机制类似于产物对酶的抑制作用：晶体结构显示，一个保守的水分子被定向朝向FAHD1催化中心，该水分子由残基H30和E33固定，这两个残基位于一段短α螺旋中15，而该螺旋在配体结合和盖子闭合后被诱导形成。如果初级烯醇式与烯醇负离子处于平衡状态，共振稳定的烯醇负离子可被该水分子淬灭生成丙酮酸。所产生的羟基则能够将丙酮酸从Mg辅因子上置换下来，随后盖子打开。最终，催化中心将在线粒体环境中恢复。在此假设情景中，空腔内的水分子相应地发挥酸的作用。
FAHD1 的水解酶活性
酶的水解酶活性隐含地需要形成羟基亲核中间体。该机制通常与酸碱催化活性相结合。反应的过渡态必须通过活性位点内关键氨基酸侧链的构象控制来准备。类比于脱羧酶功能的讨论，以2-酮形式存在的酶结合型酰基丙酮酸将在构象上受到控制，其中4-羰基氧通过与Q109的氢键作用而固定（图9B，右图）。草酸结合态FAHD1的晶体结构（PDB:6FOG）显示，一个保守的水分子被H30和E33残基以短α螺旋的形式定向锚定，使其朝向FAHD1的催化中心15。E33-H30二联体能够使该定向排列的水分子去质子化，所产生的羟基处于理想位置，可进攻由Q109通过构象控制所呈现的酰基丙酮酸的4-羰基15。
值得注意的是，FAH 也提出了类似的机制18。羟基亲核试剂的进攻预期会形成一种氧负离子中间体，在轨道控制的 C3-C4 键断裂过程中得以稳定（图9C）。在此模型中，C3-C4 键的旋转（图9C）发生在 图9B 所示生成的羟基进行亲核进攻之后（即该步骤为酰基丙酮酸的键断裂做好准备）。主要产物为乙酸和 Mg-丙酮酸烯醇负离子。在此假设情形下，乙酸可将烯醇淬灭为丙酮酸，并随后协助产物的释放。在 pH 高于 7.5 且存在 Mg 离子的条件下，酰基丙酮酸在酮式与烯醇式之间存在平衡，其中烯醇式略占优势30。最有可能的是，在随后的盖子结构闭合过程中，这两种形式均可与 FAHD1 的辅因子结合。由于烯醇式结构较为平坦，酶对其烯醇型酰基丙酮酸底物的催化受到阻碍。C3-C4 键的断裂将产生一个无共振稳定的乙烯型碳负离子。
因此，我们提出一个催化酮化步骤，以促进羟基亲核试剂对酰基羰基的进攻。然而，该酮化过程需要FAHD1残基对质子转移进行调控，这将赋予FAHD1固有的异构酶活性。据报道，与未络合形式相比，Mg结合的烯醇氢的酸性可增强一万倍28。结合于Mg的烯醇形式可通过未质子化的K123实现去质子化。K123的去质子化可能由D102的羧酸根协助完成。由D102-K47-K123残基形成的氢键网络可在FAHD1的催化中心充当必要的质子传递通路15。由此生成的中间体烯醇负离子随后可在底物酮化过程中被E33-H30-H2O三联体淬灭15。生成的2-酮形式将受到Q109的构象控制，同时形成的羟基将进攻酰基羰基。综上所述，该讨论表明FAHD1可通过形成空腔的残基之间的协同作用，调控一个水分子在酸与碱状态之间的转换。
该方法的未来应用或发展方向
本文所述方法的未来应用前景十分广泛。FAH超家族中大量原核生物成员的功能仍有待表征。即使对于已知的FAH超家族成员，目前有关其催化活性的信息也极为有限，且大多数结论基于理论推测而非实验数据。将本文所述方法应用于原核生物FAH超家族成员的研究，取决于细菌学领域的具体研究兴趣。另一方面，最近的研究表明，真核生物FAH超家族成员在不同细胞区室（例如细胞质与线粒体）中发挥着关键作用，这凸显了深入表征这些蛋白的必要性（迄今已鉴定出三种）。尤其值得注意的是，现有数据提示某些尚未表征的蛋白可能在线粒体生物学、衰老研究以及癌症研究中执行不同的功能。有观点认为，对这些真核生物FAH超家族成员进行全面的分子和生理学表征，可能为当前生物医学领域的重要研究方向提供关键见解。此外，还需进一步研究FAHD1（及相关酶）的作用机制，以更深入地理解其双功能特性的分子基础，而这一机制目前尚未完全阐明。针对FAHD1突变体的额外研究、核磁共振（NMR）分析以及抑制剂复合物的结构研究，可能有助于揭示FAHD1所具备的真实反应机制。此外，通过计算机辅助设计能够结合Mg辅因子的烯醇类似物，最终有望开发出高效的FAHD1抑制剂。
披露
作者声明无任何披露事项，且不存在竞争性财务利益。H. G. 担任 MoleculeCrafting.HuGs e.U. 的首席执行官兼首席科学官，并通过定制合成方式为本研究提供了酰基丙酮酸酯。via。P. J. D. 实验室的工作得到了奥地利科学基金（FWF）的支持：项目编号 P 31582-B26。本论文的部分出版费用由奥地利科学基金（FWF）在项目编号 P 31582-B26 下承担。A. N. 和 B. R. 由奥地利科学基金（FWF）在项目 P28395-B26 下资助。
致谢
作者非常感谢Annabella Pittl提供的专业技术支持以及Haymo Pircher进行的初步方法开发。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BL21(DE3) pLysS 感受态 E. coli | Promega | L1195 | 高效蛋白质表达（基于含T7启动子和核糖体结合位点的基因） |
| pET 大肠杆菌 T7 表达载体 | MERCK | - | http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav |
| 0.45 µm 滤膜单元 | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP，0.45 µm，PES 33 mm，未灭菌 |
| 0.22 µm 滤膜单元 | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP，0.22 µm，PES 33 mm，非无菌 |
| 1.5 mL 离心管 | VWR | 525-1042 | 微型离心管；经高压灭菌 |
| 15 mL Falcon | VWR | 734-0451 | 离心管 |
| 50 mL Falcon管 | VWR | 734-0448 | 离心管 |
| PS 比色皿 分光光度计 半微量 | VWR | 30622-758 | VIS透明比色皿 |
| 紫外比色皿分光光度计半微量 | VWR | 47727-024 | 紫外/可见光透明比色皿 |
| 异丙基-β异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG） | ROTH | 2316 | 用于DE3/pET系统中蛋白表达诱导的化学试剂 |
| 咪唑 | ROTH | X998 | 用于从镍离子负载的亲和树脂中洗脱聚组氨酸（6xHis）序列的化学物质 |
| 玻璃经济型层析柱 | 伯乐（Bio-Rad） | - | http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&&pcp_loc=catprod |
| 氯霉素 | Sigma-Aldrich | C0378 | 用于细菌生长筛选的抗生素；抗性基因ópLysS 质粒的 BL21(DE3) 大肠杆菌中表达；25 µg/mL 终浓度 |
| 卡那霉素 | Sigma-Aldrich | 60615 | 用于细菌生长筛选的抗生素；若所用pET载体编码该抗性，则使用；50 µg/mL 终浓度 |
| 氨苄青霉素 | Sigma-Aldrich | A1593 | 用于细菌生长筛选的抗生素；若所用pET载体编码该抗性，则使用；100 µg/mL 终浓度 |
| Ultra-15，截留分子量 10 kDa | Sigma-Aldrich | Z706345 | 用于蛋白质富集的离心滤器；https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de®离子=AT |
| Ultra-0.5 离心过滤装置 | Sigma-Aldrich | Z677108 | 用于蛋白质富集的离心滤器；https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&®ion=AT&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2 |
| 草酰乙酸 | Sigma-Aldrich | O4126 | TCA代谢物 |
| 草酸钠 | Sigma-Aldrich | 71800 | FAH 超家族酶的竞争性抑制剂 |
| 透析管 cellulose 膜 | Sigma-Aldrich | D9277 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277；或性能相当的产品 |
| Ni-NTA 琼脂糖 | 赛默飞世尔科技 | R90101 | 一种可用来纯化含有多聚组氨酸（6xHis）序列的重组蛋白的镍离子亲和树脂 |
| 96孔紫外微孔板 | 赛默飞世尔科技 | 8404 | 紫外/可见光透明平底96孔板 |
| PageRuler 预染蛋白标准品，10 至 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616 |
| ÄKTA FPLC 系统 | GE Healthcare Life Sciences | - | 使用GE Healthcare的FPLC系统；存在多种定制版本；本研究采用的为 "ÄKTA 纯化" 系统 |
| HiTrap Phenyl HP 柱 | GE Healthcare Life Sciences | - | https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630 |
| Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences | - | https://www.gelifesciences.com/zh/cn/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723 |
| Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences | - | https://www.gelifesciences.com/zh/cn/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608 |
| HiLoad Superdex 75 pg 柱 (G75) | GE Healthcare Life Sciences | - | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800 |
| HiLoad Superdex 200 pg 柱 (G200) | GE Healthcare Life Sciences | - | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283 |
| TECAN 酶标仪 | 帝肯生命科学 | - | https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers |
| 乙酰丙酮 | MoleculeCrafting.HuGs e.U. | - | 定制合成 |
| 苯甲酰丙酮酸 | MoleculeCrafting.HuGs e.U. | - | 定制合成 |
| VDX™ 24孔板 | 哈姆顿 | HR3-142 | 通过悬滴蒸汽扩散法用于结晶的24孔板 |
| 石蜡油 | Hampton | HR3-411 | 通过悬滴气相扩散法用于结晶 |
| 盖玻片（22 mm） | Karl Hecht KG | 14043 | 用于悬滴气相扩散法结晶的盖玻片 |
| LB培养基（Luria broth） | 自制 | - | 一种用于大肠杆菌的通用生长培养基：5 g/L 酵母提取物；10 g/L 酪蛋白胨；10 g/L 氯化钠；12 g/L 琼脂 |
| NZCYM 培养基 | 自制 | - | 一种用于大肠杆菌扩增的更优生长培养基：10 g/L NZ胺；5 g/L NaCl；5 g/L 酵母提取物；1 g/L 酪蛋白氨基酸；2 g/L MgSO₄；调节pH至7.4 |
| Luria肉汤（LB）琼脂糖平板 | 自制 | - | 含LB培养基和抗生素的高压灭菌琼脂平板，用于细菌生长筛选；https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ |
| Ni-NTA 洗脱缓冲液 | 自制 | - | 20 mM Tris-HCl pH 7.4；50–300 mM NaCl；10–200 mM 咪唑；范围：不同FAHD蛋白的最适值有所差异 |
| Ni-NTA 洗脱缓冲液 | 自制 | - | 20 mM Tris-HCl pH 7.4；50–300 mM NaCl；200–500 mM 咪唑；范围：最适值因FAHD蛋白而异 |
| HIC 上样缓冲液 | 自制 | - | 44 mM NaH2PO4；6 mM Na2HPO4；100 mM NaCl；20 mM DTT；调至pH 7 |
| HIC 上样缓冲液 AS | 自制 | - | HIC 运行缓冲液（硫酸铵饱和）；调节至 pH 7：70 g 硫酸铵 + 90 mL 缓冲液，于冷室中搅拌过夜；调节至 pH 7.0 |
| Mono S 低盐缓冲液 | 自制 | - | 44 mM NaH₂PO₄；6 mM Na₂HPO₄；10–300 mM NaCl；范围：最适值因FAHD蛋白而异 |
| Mono S 高盐缓冲液 | 自制 | - | 44 mM NaH₂PO₄；6 mM Na₂HPO₄；1-2 M NaCl；范围：最适值因FAHD蛋白而异 |
| Mono Q 低盐缓冲液 | 自制 | - | 20 mM Tris-HCl；15 mM NaCl；调至pH 8.0 |
| Mono Q 高盐缓冲液 | 自制 | - | 20 mM Tris-HCl；1 M NaCl；10% 甘油；调至 pH 8.0 |
| G75 / G200 运行缓冲液 | 自制 | - | 15 mM Tris-HCl；300 mM NaCl；调至pH 7.4 |
| 酶活性测定缓冲液 | 自制 | - | 50 mM Tris-HCl pH 7.4；100 mM KCl；1 mM MgCl₂2 |
| 蛋白结晶缓冲液 | 自制 | - | 含1 mM DTT的G75 / G200运行缓冲液 |
| 用于结晶的储液溶液 | 自制 | - | 100 mM Na-HEPES pH 7.5；5–20 %（w/v）PEG4k；10 mM–200 mM MgCl2 |
参考文献
- Brouns, S. J. J., et al. Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily. Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).
- Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).
- Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-Dürr, P. The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria. Biochemical Society Transactions. 46, 295(2018).
- Guimarães, S. L., et al. Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous β-Keto Acid. Biochemistry. 55, 2632(2016).
- Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism. Journal of Bacteriology. 183, 700(2001).
- Izumi, A., et al. Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).
- Manjasetty, B. A., et al. X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880. Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).
- Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold. Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).
- Ran, T., et al. Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family. The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).
- Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).
- Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).
- Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).
- Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
- Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 – a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
- Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).
- Taferner, A., et al. FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans. PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).
- Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).
- Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).
- Zeng, F., et al. Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA. Scientific Reports. 8, 1714(2018).
- Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).
- Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. The FAH Fold Meets the Krebs Cycle. Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).
- Rupp, B. Origin and use of crystallization phase diagrams. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).
- Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
- Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution. The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).
- Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution. Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).
- Steinberger, R., Westheimer, F. H. Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1. Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).
- Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25. Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).
- Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25. Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).
- Brecker, L., et al. Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures. New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).
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