大鼠胸段脊髓半切手术及开放场地运动功能评估

摘要

大鼠胸段脊髓半切术是一种有价值的、可重复的单侧脊髓损伤模型，可用于研究运动功能恢复的神经机制及治疗效果。本文提供了详细的分步操作指南，介绍如何实施脊髓半切手术，并在开放场地环境中评估动物的运动功能表现。

摘要

脊髓损伤（SCI）会导致损伤平面以下的运动、感觉和自主神经功能障碍。实验性动物模型是理解脊髓损伤后运动功能恢复所涉及的神经机制以及为临床人群设计治疗方法的重要工具。目前已建立多种实验性脊髓损伤模型，包括挫伤、压迫和横断损伤，适用于多种物种。半横断是指脊髓单侧的横断性损伤，仅破坏一侧的所有上行和下行传导束。与挫伤或压迫技术相比，脊髓半横断可产生高度选择性和可重复的损伤，适用于研究与功能恢复相关的未受损和受损神经通路中的神经可塑性。本文提供了一套详细、逐步的操作流程，用于在大鼠T8椎体水平实施胸段脊髓半横断，该操作将导致损伤同侧后肢出现初始性瘫痪，并在数周内逐步出现自发性的运动功能恢复。我们还提供了一套在开放场地中评估运动功能恢复的评分方案。该运动功能评估方法可呈现线性恢复曲线，可在损伤后早期及多次重复进行，以便准确筛选动物，确定进行更专业化行为学测试的合适时间点。本文介绍的半横断技术可轻松适用于其他横断模型和不同物种，而该运动功能评估方法也可广泛应用于多种脊髓损伤及其他损伤模型中对运动功能的评分。

引言

脊髓损伤（SCI）可导致运动、感觉和自主神经功能的严重障碍。实验性动物模型是研究脊髓损伤病理过程中涉及的解剖学和生理学事件、探索修复与恢复的神经机制，以及筛选潜在治疗干预措施的有效性和安全性的有力工具。大鼠是脊髓损伤研究中最常用的物种¹。大鼠模型成本低、易于复制，并且有大量可用的行为学测试方法来评估功能结局²。尽管在传导束位置上存在一些差异，大鼠脊髓在整体感觉运动功能上与包括灵长类在内的较大型哺乳动物具有较高的相似性^3,4。大鼠在脊髓损伤后也表现出与人类相似的生理和行为后果⁵。非人灵长类动物和大型动物模型能更接近地模拟人类脊髓损伤⁶，在开展人体试验前验证治疗的安全性和有效性方面具有关键作用，但由于伦理和动物福利考量、高昂的成本以及监管要求，其应用相对较少⁷。

大鼠横断式脊髓损伤模型通过椎板切除术后，使用解剖刀或虹膜剪对脊髓进行选择性切割，以实现脊髓的靶向中断。与完全横断相比，大鼠的部分横断造成的损伤较轻，术后动物护理更为简便，可出现自发性运动功能恢复，且更接近人类脊髓损伤的实际情况——人类脊髓损伤 predominantly 为不完全性损伤，伴有部分连接脊髓与脊上结构的组织得以保留。⁸单侧半横断仅破坏一侧的所有上行和下行传导束，可产生可量化且高度可重复的运动功能障碍，有助于深入探究其潜在的生物学机制。半横断最显著的功能后果是同侧病变水平以下肢体出现初期瘫痪，并在数周内表现出分级性的运动功能自发恢复。^9,10,11,12半切模型对于研究与功能恢复相关的受损及残余神经束和神经回路的神经可塑性尤为有用^{9,11,12,13,14,15,16,17,18}特别是在胸段水平进行的半切术, 即位于控制后肢运动的脊髓回路以上，对于研究运动控制的变化特别有用。由于脊髓损伤后损伤严重程度与运动功能恢复之间存在非线性关系¹⁹因此，在实验模型中，采用适当的行為學測試來評估功能結果至關重要。

目前已有一整套全面的行为学测试方法，可用于评估大鼠功能性和运动功能恢复的特定方面^2,20。许多运动功能测试在脊髓损伤（SCI）后早期无法提供可靠的测量结果，因为大鼠功能障碍严重，无法支撑自身体重。因此，一种能够在损伤早期敏感地检测运动功能缺陷、且无需术前训练或特殊设备的自发性运动行为评估方法，对于在合适的时间点监测运动功能恢复、并适时补充专项行为学测试具有重要意义。Martinez开放场评估评分¹⁰最初是为评估大鼠颈段脊髓损伤后的运动功能而开发的，是一种20分制的等级评分系统，用于评估大鼠在开放场中自发地面行走时的整体运动表现。评分针对每个肢体独立进行，依据评分标准对一系列运动指标的具体参数进行评估，包括关节肢体运动、体重支撑能力、脚趾位置、迈步能力、前肢与后肢协调性以及尾巴位置。该评估评分源自Basso、Beattie和Bresnahan（BBB）开放场评分量表，后者最初设计用于评估胸段挫伤性脊髓损伤后的运动功能²¹。Martinez评分经过改进，能够准确且可靠地评估前肢和后肢的运动功能，允许对各个评分参数进行独立分析（而BBB评分的层级式结构不支持此类独立分析），并提供线性的功能恢复曲线¹⁰。此外，与BBB评分相比，该评估评分在更严重的损伤模型中表现出更高的敏感性和可靠性^10,11,20,22。该评分已被用于评估大鼠在单纯颈段^10,12或胸段⁹脊髓损伤，以及合并创伤性脑损伤后所导致的运动功能障碍²³。

本文详细介绍了一种在雌性Long-Evans大鼠T8椎体水平进行胸段半横断脊髓损伤（SCI）的逐步操作方案，以及在开放场地中评估后肢运动功能恢复的方法。

方案

本文所述实验均遵循加拿大动物护理委员会的指导方针，并已获得蒙特利尔大学伦理委员会的批准。

1. 胸部半切手术

1. 穿戴适当的防护装备（手套、口罩和防护服），以维持手术过程中的无菌环境。使用酒精棉片清洁手术区域，并在手术区域覆盖无菌手术单。对手术器械进行灭菌处理后置于手术区域。
2. 使用异氟烷气体（3% 诱导，0.5−3% 维持）与氧气（1 L/min）混合麻醉大鼠。通过检测足趾夹捏反射消失确认手术麻醉深度 以及角膜反射反应。在整个操作过程中持续监测大鼠状态，并根据需要调整麻醉剂输送量，以维持手术所需的麻醉深度。
3. 剃除大鼠颈部至髋部背侧躯干的毛发，将大鼠置于手术区域，使用酒精棉片和聚维酮碘溶液对切口部位进行消毒，并通过直肠温度计监测，利用反馈控制的加热垫维持核心体温在37 °C。
4. 在眼睛上涂抹眼药膏以保持湿润，并根据需要在手术过程中定期重新涂抹。
5. 用手术刀在覆盖T6−T10椎骨的皮肤上做一个2.5 cm的切口。使用钝头解剖剪分离并牵开皮肤及浅层脂肪。
   注意：可通过从颅底开始向尾侧轻柔触诊背部脊髓节段，根据明显的隆起结构识别第2颈椎，进而从头侧确定T6−T10椎体节段^nd 胸椎²⁴，或通过触诊最后侧游离肋骨（第13肋）的尾侧，可诱发其移动^th 胸椎
6. 使用钝性解剖剪和自持拉钩分离附着于T7−T9椎骨背侧的椎旁肌。用精细镊子和棉签清除残留组织，暴露棘突和椎板。
   注意：此步骤及后续步骤在显微观察（约5−15倍）下进行将大为便利。
7. 使用精细的骨剪在 T7 和 T8 椎骨上双侧小心地切除关节突（椎间关节）。用手术刀浅层切开 T8 与 T9 椎板之间的背侧结缔组织（深度 1 mm），注意避免损伤下方的脊髓。
8. 用骨剪切除T8椎骨的棘突。用弯止血钳小心夹住T7棘突，将T8椎板的尾端轻微向前旋转约20°，将骨剪插入T8椎板下方，沿椎板做中线切口。继续在横突内侧的椎板左右两侧重复切割，完成椎板切除术，以暴露脊髓。
   注意：需小心清除椎板切除术所产生的全部骨碎片。
9. 在暴露的椎管内滴加利多卡因（2%，0.1 mL），使用精细镊子和虹膜剪去除覆盖T8脊髓节段的硬脊膜。对暴露的脊髓再次给予利多卡因，并通过观察T7−T9椎骨暴露节段棘突之间形成的中线，确定脊髓的中线位置。
   注意：除了T7和T9的棘突外，暴露的T8背根神经节也可用于辅助确定中线位置，可将30 G针头置于脊髓中线，以辅助后续的半横切操作。
10. 用解剖刀从脊髓中线向一侧进行半切。注意避免切穿腹侧的脊前动脉（切勿对椎体施加过大压力）。使用虹膜剪仔细剪断脊髓损伤侧残余的组织，以确保腹外侧象限被充分横断。
11. 将无菌生理盐水浸湿的止血海绵（约6 × 2 mm）置于暴露的脊髓上方腔隙内，缝合肌层（4-0 聚乳酸-羟基乙酸共聚物910）。随后，缝合切口周围的皮肤。
12. 术后立即给予充分的镇痛剂（皮下注射布托啡诺 0.05 mg/kg）、抗生素（皮下注射恩诺沙星 10 mg/kg），并腹腔注射 5 cc 乳酸林格液以补充丢失的体液。
13. 将大鼠移出麻醉状态。将其置于温暖环境中，在加热垫或加热灯下（约 33 °C）保温，直至动物完全苏醒。
14. 术后前3天每日提供辅助镇痛，并持续监测疼痛、体重减轻、排尿异常、感染、伤口愈合问题或自噬行为等迹象。

2. 开放旷场测试流程与运动能力评分

1. 在测试前1周内每天对大鼠进行抓取操作，并在开放场中进行两次各5分钟的适应训练，以使其适应被从躯干中部轻轻抓起的操作，同时确保测试期间测量结果的可靠性。
2. 将摄像机置于地面水平位置，正对圆形有机玻璃开放场装置，用于记录测试过程，以便后续离线分析（最低帧率为30−60帧/秒）。
3. 开始视频录制，并在弱光条件下将大鼠放置于开放场中央，以促进其自主运动活动。
4. 测试持续4分钟，以确保获得足够数量的运动片段用于分析。当大鼠静止时间超过20秒时，将其抓起并重新放回开放场中央，以促进运动行为的发生。
5. 根据下述各小节中的参数，使用表1中提供的评分标准对录制的测试视频进行运动表现评分。
   注意：使用支持变速播放和逐帧分析的软件（例如VLC媒体播放器）反复观看录制视频，分别对每个参数进行评分，有助于提高准确性。
   1. 关于关节肢体运动，分别对踝、膝和髋关节在自发运动过程中的后肢关节活动进行评分：若活动范围超过正常的一半，则视为正常（评分为2）；若活动范围小于正常的一半，则视为轻度（评分为1）；若无活动，则评分为0。
   2. 关于体重支撑能力，分别评估大鼠静止状态和主动运动过程中，后肢伸肌收缩并支撑负重体重的能力。若具备体重支撑能力，则评分为1；若无此能力，则评分为0。
      注意：静止状态下的体重支撑能力是实现主动运动中体重支撑的前提条件。
   3. 关于足趾位置，评估大鼠在静止状态和运动过程中后肢足趾的位置。若在超过50%的测试时间内，后肢足趾在运动中呈伸展状态、彼此分开且具有张力，则评分为2（视为正常）；若足趾主要保持屈曲状态，则评分为1；若足趾主要处于无张力状态，则评分为0。
   4. 关于迈步动作，仅当大鼠能够在迈步过程中支撑其体重时，才进行此项参数评分。通过评估后肢足垫在初次接触地面和离地时的朝向，以及迈步摆动相的流畅性来完成评分。
      注意：本参数包含3个评分项，分别在以下小节中描述：1）肢体接触地面时足垫的轴向朝向（背侧/跖侧放置）；2）初次接触和离地时足垫的纵向朝向（与身体轴线平行或向内/向外旋转）；3）摆动过程中肢体运动的质量（规律或不规律）。
      1. 关于肢体接触时的足垫放置位置，若超过50%的步态周期中出现背侧着地，则此项评分为0。
         注意：跖侧着地是进行后续足垫接触与离地朝向评分（步骤2.5.4.2）、摆动运动评分（步骤2.5.4.3）以及前肢-后肢协调性评分（步骤2.5.5）的前提条件。
      2. 关于肢体接触与离地时的足垫朝向，若足垫长轴与身体纵轴保持平行，则评分为2；若肢体在接触或离地时出现向外或向内旋转，则分别评分为1。
      3. 关于摆动运动，若后肢关节在摆动相中协调且规律地运动，则评分为2；若关节在摆动过程中出现抽动或痉挛性运动，则评分为1。
   5. 关于前肢-后肢协调性，仅当测试过程中出现连续4步以上的行走，且肢体能够主动支撑体重时，才进行此项评分。若协调性一致（>90%的步态周期），评分为3；若较频繁（50−90%的步态周期），评分为2；若偶尔出现（<50%的步态周期），评分为1；若完全无协调性（0%的步态周期），则评分为0。
      注意：前肢-后肢协调性定义为被评分的后肢与其同侧前肢在迈步过程中呈现有规律的交替模式。
   6. 关于尾部位置，评估大鼠在运动过程中的尾部位置：若尾部抬起（离开地面），评分为1；若尾部下垂（接触地面），评分为0。
      注意：运动过程中尾部抬高是大鼠躯干稳定性的指标之一。脊髓半切损伤后，由于躯干稳定性受损，尾部通常贴近或接触地面。
   7. 将各参数的单项得分相加，得出每侧后肢的总分，最高为20分。
      注意：得分为20表示运动功能正常。得分<20表示不同程度的运动功能障碍，得分为0表示肢体瘫痪。

结果

通过半切技术可以产生具有高度一致性的可重复损伤。为了评估和比较不同实验组之间的损伤范围，可通过脊髓切片的组织学染色，便捷地计算损伤最大面积占脊髓总横截面积的百分比。图1展示了一个典型的左侧半侧脊髓损伤，以及大鼠之间最大损伤区域重叠部分的叠加图，其平均损伤面积占脊髓横截面积的47.3% ± 4.0%（n = 6）。

图1：典型的脊髓病灶。（A）半切大鼠脊髓损伤中心冠状切面的显微照片，经焦油紫（细胞体，紫色）和劳克氏固蓝（髓鞘，蓝色）染色，显示左侧半脊髓的灰质和白质损伤。D，背侧；V，腹侧；L，左侧；R，右侧。比例尺：1 mm。（B

讨论

半切技术的一个主要优势在于其损伤的可选择性和可重复性，这使得动物之间的组织学和行为表型变异显著减少²⁵。为了确保在目标脊髓节段形成单侧损伤，准确识别相应的椎体节段和脊髓中线至关重要。在进行半切操作时，脊髓可能会因切割而发生旋转，因此在操作过程中用精细镊子轻柔地从两侧夹持固定脊髓有助于维持其稳定。将大鼠固定于立体定位仪上，并用胶带轻轻牵拉尾部施加轻微张力，有助于提高术中稳定性并保证椎体的正确对齐。也可使用连接于立体定位仪和棘突的脊柱夹来增强脊柱的稳定性，但我们发现其存在可能限制手术器械对脊髓的操作空间，并在手术过程中需要不自然的操作角度。此外，必须彻底清除椎板切除后残留在椎管内的任何骨碎片，因为这些碎片可能造成脊髓的继发性压迫损伤，并促进二次损伤的发生。

在手术过程中应持续观察大鼠，以监测核心温度和呼吸等必要的生命体征，因为低体温是麻醉期间及术后早期死亡的主要原因。使用直肠探头和反馈控制加热垫调节核心体温，可显著避免体温相关并发症。还可使用脉搏血氧仪监测血氧饱和度和心率，以调节麻醉深度。我们发现，术后立即给予体温加热的乳酸林格液进行补液...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
拜耳灵（Baytril）	CDMV	11242
钝性解剖剪	World Precision Instruments	503669
盐酸布托啡诺（Buprenorphine hydrochloride）	CDMV
相机镜头	Pentax	C31204TH	12.5-75mm，f1.8，2/3" 格式，C接口
CMOS视频相机	Basler	acA2000-165uc	2/3" 格式，2048 × 1088 像素，最高165 fps，C接口，USB3
压缩氧气气体	Praxair
棉签	CDMV	108703
精细骨剪	Fine Science Tools	16109-14
解剖刀	Fine Science Tools	10055-12
杜蒙特精细镊子（#5）	Fine Science Tools	11254-20
强生爱惜康Vicryl 4/0紫色编织FS-2 缝线（J392H）	CDMV	111689
反馈控制加热垫	Harvard Apparatus	55-7020
雌性Long-Evans大鼠	Charles River Laboratories	品系编号：006	225–250 g
明胶海绵（Gelfoam）	CDMV	102348
弯止血钳	Fine Science Tools	13003-10
热珠灭菌器	Fine Science Tools	18000-45
水凝胶	70-01-5022	Clear H20
异氟烷（Isoflurane）	CDMV	118740
乳酸林格氏液	CDMV	116373
利多卡因（2%）	CDMV	123684
30号针头	CDMV	4799
开放场区域	定制		直径96 cm、壁高40 cm的圆形聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）实验 arena
眼科软膏	CDMV	110704
个人计算机			具备USB3接口，用于与所列相机连接以录制视频
生理盐水	CDMV	1399
聚维酮碘（Proviodine）	CDMV	4568
啮齿类动物液体饲料	Bioserv	F1268
11号手术刀片	CDMV	6671
自持式牵开器	World Precision Instruments	14240
Vannas虹膜切除弹簧剪	Fine Science Tools	15002-08
兽用麻醉机及异氟烷蒸发器	Dispomed	975-0510-000
VLC媒体播放器	VideoLAN		videolan.org/vlc