大鼠胸段脊髓半切手术及开放场地运动功能评估

摘要

大鼠胸段脊髓半切术是一种有价值的、可重复的单侧脊髓损伤模型，可用于研究运动功能恢复的神经机制及治疗效果。本文提供了详细的分步操作指南，介绍如何实施脊髓半切手术，并在开放场地环境中评估动物的运动功能表现。

摘要

脊髓损伤（SCI）会导致损伤平面以下的运动、感觉和自主神经功能障碍。实验性动物模型是理解脊髓损伤后运动功能恢复所涉及的神经机制以及为临床人群设计治疗方法的重要工具。目前已建立多种实验性脊髓损伤模型，包括挫伤、压迫和横断损伤，适用于多种物种。半横断是指脊髓单侧的横断性损伤，仅破坏一侧的所有上行和下行传导束。与挫伤或压迫技术相比，脊髓半横断可产生高度选择性和可重复的损伤，适用于研究与功能恢复相关的未受损和受损神经通路中的神经可塑性。本文提供了一套详细、逐步的操作流程，用于在大鼠T8椎体水平实施胸段脊髓半横断，该操作将导致损伤同侧后肢出现初始性瘫痪，并在数周内逐步出现自发性的运动功能恢复。我们还提供了一套在开放场地中评估运动功能恢复的评分方案。该运动功能评估方法可呈现线性恢复曲线，可在损伤后早期及多次重复进行，以便准确筛选动物，确定进行更专业化行为学测试的合适时间点。本文介绍的半横断技术可轻松适用于其他横断模型和不同物种，而该运动功能评估方法也可广泛应用于多种脊髓损伤及其他损伤模型中对运动功能的评分。

引言

脊髓损伤（SCI）可导致运动、感觉和自主神经功能的严重障碍。实验性动物模型是研究脊髓损伤病理过程中涉及的解剖学和生理学事件、探索修复与恢复的神经机制，以及筛选潜在治疗干预措施的有效性和安全性的有力工具。大鼠是脊髓损伤研究中最常用的物种¹。大鼠模型成本低、易于复制，并且有大量可用的行为学测试方法来评估功能结局²。尽管在传导束位置上存在一些差异，大鼠脊髓在整体感觉运动功能上与包括灵长类在内的较大型哺乳动物具有较高的相似性^3,4。大鼠在脊髓损伤后也表现出与人类相似的生理和行为后果⁵。非人灵长类动物和大型动物模型能更接近地模拟人类脊髓损伤⁶，在开展人体试验前验证治疗的安全性和有效性方面具有关键作用，但由于伦理和动物福利考量、高昂的成本以及监管要求，其应用相对较少⁷。

大鼠横断式脊髓损伤模型通过椎板切除术后，使用解剖刀或虹膜剪对脊髓进行选择性切割，以实现脊髓的靶向中断。与完全横断相比，大鼠的部分横断造成的损伤较轻，术后动物护理更为简便，可出现自发性运动功能恢复，且更接近人类脊髓损伤的实际情况——人类脊髓损伤 predominantly....

方案

本文所述实验均遵循加拿大动物护理委员会的指导方针，并已获得蒙特利尔大学伦理委员会的批准。

1. 胸部半切手术

1. 穿戴适当的防护装备（手套、口罩和防护服），以维持手术过程中的无菌环境。使用酒精棉片清洁手术区域，并在手术区域覆盖无菌手术单。对手术器械进行灭菌处理后置于手术区域。
2. 使用异氟烷气体（3% 诱导，0.5−3% 维持）与氧气（1 L/min）混合麻醉大鼠。通过检测足趾夹捏反射消失确认手术麻醉深度 以及角膜反射反应。在整个操作过程中持续监测大鼠状态，并根据需要调整麻醉剂输送量，以维持手术所需的麻醉深度。
3. 剃除大鼠颈部至髋部背侧躯干的毛发，将大鼠置于手术区域，使用酒精棉片和聚维酮碘溶液对切口部位进行消毒，并通过直肠温度计监测，利用反馈控制的加热垫维持核心体温在37 °C。
4. 在眼睛上涂抹眼药膏以保持湿润，并根据需要在手术过程中定期重新涂抹。
5. 用手术刀在覆盖T6−T10椎骨的皮肤上做一个2.5 cm的切口。使用钝头解剖剪分离并牵开皮肤及浅层脂肪。
   注意：可通过从颅底开始向尾侧轻柔触诊背部脊髓节段，根据明显的隆起结构识别第2颈椎，进而从头侧确定T6−T10椎体节段^nd 胸椎²⁴，或通过触诊最后侧游离肋骨（第13肋）的尾侧，可诱发其移动^th 胸椎
6. 使....

结果

通过半切技术可以产生具有高度一致性的可重复损伤。为了评估和比较不同实验组之间的损伤范围，可通过脊髓切片的组织学染色，便捷地计算损伤最大面积占脊髓总横截面积的百分比。图1展示了一个典型的左侧半侧脊髓损伤，以及大鼠之间最大损伤区域重叠部分的叠加图，其平均损伤面积占脊髓横截面积的47.3% ± 4.0%（n = 6）。

图1：典型的脊髓病灶。（A）半切大鼠脊髓损伤中心冠状切面的显微照片，经焦油紫（细胞体，紫色）和劳克氏固蓝（髓鞘，蓝色）染色，显示左侧半脊髓的灰质和白质损伤。D，背侧；V，腹侧；L，左侧；R，右侧。比例尺：1 mm。（B

讨论

半切技术的一个主要优势在于其损伤的可选择性和可重复性，这使得动物之间的组织学和行为表型变异显著减少²⁵。为了确保在目标脊髓节段形成单侧损伤，准确识别相应的椎体节段和脊髓中线至关重要。在进行半切操作时，脊髓可能会因切割而发生旋转，因此在操作过程中用精细镊子轻柔地从两侧夹持固定脊髓有助于维持其稳定。将大鼠固定于立体定位仪上，并用胶带轻轻牵拉尾部施加轻微张力，有助于提高术中稳定性并保证椎体的正确对齐。也可使用连接于立体定位仪和棘突的脊柱夹来增强脊柱的稳定性，但我们发现其存在可能限制手术器械对脊髓的操作空间，并在手术过程中需要不自然的操作角度。此外，必须彻底清除椎板切除后残留在椎管内的任何骨碎片，因为这些碎片可能造成脊髓的继发性压迫损伤，并促进二次损伤的发生。

在手术过程中应持续观察大鼠，以监测核心温度和呼吸等必要的生命体征，因为低体温是麻醉期间及术后早期死亡的主要原因。使用直肠探头和反馈控制加热垫调节核心体温，可显著避免体温相关并发症。还可使用脉搏血氧仪监测血氧饱和度和心率，以调节麻醉深度。我们发现，术后立即给予体温加热的乳酸林格液进行补液.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
拜耳灵（Baytril）	CDMV	11242
钝性解剖剪	World Precision Instruments	503669
盐酸布托啡诺（Buprenorphine hydrochloride）	CDMV
相机镜头	Pentax	C31204TH	12.5-75mm，f1.8，2/3" 格式，C接口
CMOS视频相机	Basler	acA2000-165uc	2/3" 格式，2048 × 1088 像素，最高165 fps，C接口，USB3
压缩氧气气体	Praxair
棉签	CDMV	108703
精细骨剪	Fine Science Tools	16109-14
解剖刀	Fine Science Tools	10055-12
杜蒙特精细镊子（#5）	Fine Science Tools	11254-20
强生爱惜康Vicryl 4/0紫色编织FS-2 缝线（J392H）	CDMV	111689
反馈控制加热垫	Harvard Apparatus	55-7020
雌性Long-Evans大鼠	Charles River Laboratories	品系编号：006	225–250 g
明胶海绵（Gelfoam）	CDMV	102348
弯止血钳	Fine Science Tools	13003-10
热珠灭菌器	Fine Science Tools	18000-45
水凝胶	70-01-5022	Clear H20
异氟烷（Isoflurane）	CDMV	118740
乳酸林格氏液	CDMV	116373
利多卡因（2%）	CDMV	123684
30号针头	CDMV	4799
开放场区域	定制		直径96 cm、壁高40 cm的圆形聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）实验 arena
眼科软膏	CDMV	110704
个人计算机			具备USB3接口，用于与所列相机连接以录制视频
生理盐水	CDMV	1399
聚维酮碘（Proviodine）	CDMV	4568
啮齿类动物液体饲料	Bioserv	F1268
11号手术刀片	CDMV	6671
自持式牵开器	World Precision Instruments	14240
Vannas虹膜切除弹簧剪	Fine Science Tools	15002-08
兽用麻醉机及异氟烷蒸发器	Dispomed	975-0510-000
VLC媒体播放器	VideoLAN		videolan.org/vlc