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方法文章

缺血再灌注损伤背景下小鼠转移性肝肿瘤模型

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DOI：

10.3791/59748

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2019年8月30日

 , 
1Department of Surgery, University of Pittsburgh

本文内容

摘要

我们详细描述了一种具有临床相关性的结直肠癌肝转移（CRLM）肿瘤模型，以及肝脏缺血再灌注（I/R）对肿瘤生长和转移的影响。该模型有助于更好地理解手术促进肝转移性生长的潜在机制。

摘要

肝脏缺血再灌注（I/R）损伤是一种常见的临床难题，仍是一种不可避免的病理生理过程，已被证实可导致多组织和器官损伤。尽管近年来在治疗手段上有所进展，但总体发病率仍不理想，尤其是在伴有基础实质异常的患者中。在癌症侵袭性生长和转移的背景下，手术相关的I/R被认为可能是调控肿瘤复发的促进因素。本文旨在描述一种具有临床相关性的肝I/R及结直肠癌肝转移小鼠模型。通过该方法，我们希望协助其他研究者建立并完善此模型，用于常规科研工作，以更深入地理解肝I/R在促进肝转移中的作用。

引言

肝脏是转移性疾病最常见的发生部位之一1。死亡几乎总是归因于肿瘤在肝脏内生长所引起的并发症。对于肝内转移性实体瘤患者，手术仍是控制疾病和实现潜在治愈的关键干预手段。然而，绝大多数患者最终会出现疾病复发，且主要发生在肝脏2,3。在肝切除手术过程中，术中出血较为常见，常需输血以及采用不同的止血技术，包括血管阻断方法。然而，这些措施会导致肝脏组织发生缺血/再灌注（I/R）损伤。I/R对肝细胞功能的不利影响已有充分报道。肝脏I/R损伤在血流恢复期间通过炎症通路触发炎症级联反应4。肝脏I/R损伤不仅可导致肝功能衰竭，现有证据还表明，I/R损伤会促进肿瘤细胞黏附，并增加转移灶形成以及已有微转移病灶生长的风险5。我们此前曾报道，手术应激可诱导免疫细胞活化，这不仅有助于原发肿瘤的生长，还可通过捕获循环中的癌细胞促进转移的发生6。

本文详细描述了一种建立肝转移小鼠肿瘤模型的技术。在该模型中，我们还介绍了一种诱导肝脏缺血再灌注损伤的方法，该损伤可作为临床上肝切除术期间手术应激的替代模型。通过结合肿瘤细胞注射与肝脏缺血/再灌注（I/R）的方法，能够成功模拟结直肠癌肝转移（CRLM）患者在原发肿瘤切除术后疾病进展的过程。

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方案

所有动物实验方案均经机构动物护理和使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南。用于任何外科手术的器械均已彻底灭菌。

1. 初始准备

  1. 在将癌细胞注入小鼠脾脏之前，对实验过程中使用的所有器械进行高压灭菌和消毒。
  2. 对加热垫、外科手套、纱布、剪刀、小夹钳、血管扩张器、手术镊和持针器进行消毒和/或高压灭菌。
  3. 准备术后镇痛药物（每千克体重0.1 mg的丁丙诺啡），在脾切除术后给予，并在之后每12小时给药一次，持续2天。

2. 细胞培养

  1. 使用支原体ELISA检测试剂盒，确保癌细胞无支原体污染。
  2. 在4 °C条件下配制500 mL的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），用于培养小鼠结直肠癌细胞（MC38）。培养基中应添加10%热灭活胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、15 mM HEPES和200 mM L-谷氨酰胺。
  3. 将癌细胞培养于无DNA酶和RNA酶的培养瓶（75 cm2）中。将细胞培养物置于含5% CO2的加湿细胞/组织培养箱中孵育，温度维持在37 °C。
  4. 当增殖细胞达到90–100%融合度时，吸除旧培养基，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后加入1×胰蛋白酶（0.25%）处理，使细胞从培养瓶上脱落。
  5. 将细胞收集至15 mL锥形管中，在700 × g条件下离心5分钟。
  6. 吸除上清液，通过重复离心，用1× PBS洗涤两次。
  7. 采用台盼蓝染色液（0.4%）染色，进一步确认细胞活力。
  8. 将细胞重悬于1× PBS中，调整浓度至1 × 106 个细胞/100 µL。充分吹打混匀，避免形成团块。注射前将癌细胞置于冰上保存。

3. 注射肿瘤细胞

  1. 使用1 mL 25 G（0.5 mm × 16 mm）针头，通过腹腔注射氯胺酮（150 mg/kg）和赛拉嗪（12 mg/kg），对8–12周龄雄性（C57BL6）小鼠进行麻醉。
  2. 使用电推剪剃除小鼠腹部皮肤的毛发，以避免术后感染。
  3. 将小鼠置于磁性固定牵开系统上。通过轻捏脚趾或尾巴确认小鼠已完全处于麻醉状态。
  4. 向眼睛滴加生理盐水，防止手术过程中角膜干燥。
  5. 用7.5%聚维酮碘溶液擦拭已剃毛的腹壁，以在手术切口前对皮肤进行消毒。
  6. 先用有齿镊提起皮肤，借助手术剪做正中切口；然后提起腹肌和腹膜，制作一条长约3 cm的正中切口（从中腹部至剑突），以暴露腹腔内容物。注意切口不应超过剑突，以防大出血。
  7. 将止血钳置于切口两侧及剑突下方。通过向下牵拉并固定尾巴以扩展腹腔。使用6英寸无菌棉签轻轻分离胰腺脂肪组织，暴露脾脏。
  8. 在向脾脏注射前，涡旋振荡癌细胞悬液，避免细胞团块形成。
  9. 使用0.5 mL 28 G（0.36 mm × 13 mm）胰岛素注射器进行注射，避免产生气泡。
  10. 缓慢而小心地将100 µL细胞悬液注射至脾脏尖端。注射后用棉签轻压穿刺点，防止液体反流至腹腔。成功注射可通过观察肝脏在注射过程中颜色的变化来判断。
  11. 用1×PBS润湿无菌纱布，覆盖于暴露的手术区域。
  12. 将小鼠转移至加热垫上保温15分钟，以促进癌细胞在体内的循环分布。
  13. 如需继续进行手术性缺血-再灌注损伤操作，请参照步骤5.3–5.10。 
    注意：该操作旨在研究缺血-再灌注（I/R）诱导对转移灶形成的影响。

4. 脾切除术

  1. 进行脾切除术时，使用手持电凝设备。用光滑镊子小心提起脾脏，并电凝脾脏血管以避免大量出血。在电凝部位横断血管，移除脾脏。
  2. 手术完成后，立即以双层缝合方式关闭切口，先缝合肌肉层，再缝合皮肤。腹壁和皮肤均使用4-0聚丙烯缝线。
  3. 在另一只动物上重复手术前，需通过喷洒70%异丙醇或将其浸入玻璃珠灭菌器中，对所有器械进行消毒。
  4. 将小鼠放回原笼，并观察其是否有痛苦或术后疼痛的迹象。
  5. 为预防术后疼痛，每12小时注射一次术后镇痛药（丁丙诺啡 0.1 mg/kg），持续2天。

5. 缺血再灌注损伤

  1. 在首次开腹手术后第5天，使用1 mL 25 G（0.5 mm × 16 mm）针头，通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（150 mg/kg）和赛拉嗪（12 mg/kg）以进行麻醉。随后执行步骤3.3–3.4。
  2. 用7.5%聚维酮碘溶液擦拭小鼠剃毛后的腹部皮肤以消毒，并按上述第3.6步所述进行腹正中切口开腹手术。
  3. 使用两个湿润的棉签，轻轻将肠管移开腹腔以暴露相关结构，包括门静脉。解剖肝门区域，清除周围组织。
  4. 将肝中叶和左外叶向上抬起，使其紧贴膈肌。在手术显微镜下使用弹簧剪解剖肝门区域，分离方叶与左外叶，以清晰暴露门管三联结构。
  5. 在中叶与右外侧叶之间放置一小块湿润的棉拭子，以创造足够的空间用于夹闭。使用血管扩张钳，小心地将10 cm长的4.0聚丙烯缝合线穿过并提起肝门三联结构。利用带锁扣的显微血管夹钳夹闭装置，在肝门三联结构（肝动脉、门静脉和胆管）位于左叶和中叶侧的位置，夹闭所有结构。
  6. 如果肺叶未出现明显苍白，应通过移除并重新施加夹钳进行调整。
    注意：如果即使重新调整夹子后肝脏仍未立即出现苍白，应仔细考虑是否继续进行缺血/再灌注操作。
  7. 移除置于中叶与右外侧叶之间的小棉签。轻柔地将肠管复位至腹腔内。用浸有1×PBS的湿纱布覆盖腹壁，并用塑料膜包裹，以尽量减少蒸发损失。
  8. 将小鼠置于加热垫上，并施加夹具持续60分钟。
  9. 在整个缺血期间，通过观察右侧中叶以及左侧中叶和侧叶的苍白变色来寻找缺血性损伤的证据。
  10. 在60分钟结束后，通过移除夹子开始再灌注。
    注意：可通过中叶和左外侧叶立即发生颜色变化来观察再灌注的证据。
  11. 再灌注后立即使用双层缝合方式关闭切口，先缝合肌肉层，再缝合皮肤。使用4-0聚丙烯缝线，在持针器的辅助下缝合腹壁和皮肤。
  12. 在对另一只动物重复该操作前，需通过将所有器械喷洒70%异丙醇或插入加热的玻璃珠灭菌器中，对其进行消毒。
  13. 将小鼠放回原始笼具，观察其是否有痛苦和术后疼痛的迹象。
  14. 术后每12小时注射一次镇痛剂（0.1 mg/kg 布托啡诺），持续2天，以避免术后疼痛。
  15. 对于肝脏缺血/再灌注假手术小鼠，进行剖腹手术、肝门分离和腹部缝合。
    注意： 手术应激在肝转移灶形成中作用的研究可通过两种不同的实验设计进行。上述方案（模型-1) 用于建立肝微转移病灶，并研究肝缺血/再灌注（I/R）对其生长的影响（图1A). 或者，可同时进行肝脏缺血-再灌注（I/R）和肿瘤细胞注射（Model-2) 以研究缺血/再灌注损伤对新转移灶形成的影响（图1B）。为此，按上述方法将癌细胞注入脾脏，使其循环15分钟。循环期结束后，进行60分钟的肝脏缺血/再灌注（I/R）或假手术。60分钟后施行脾脏侧部切除术，随后关闭腹腔切口。

6. 手术小鼠的评估

  1. 手术过程中，通过进行眼睑和角膜反射测试，确保小鼠处于III期麻醉状态。一旦出现反射迹象，必须追加麻醉剂量。
  2. 术后立即给予镇痛药物（布托啡诺 0.1 mg/kg），之后每12小时一次，持续2天，以避免术后疼痛。
  3. 让小鼠有30–60分钟的麻醉恢复时间。持续监测小鼠状态，在完全恢复前不得无人看管。
  4. 观察是否有痛苦迹象，如弓背、闭眼、行动迟缓以及不梳理毛发等。根据情况采取相应处理，直至小鼠恢复正常活动。
  5. 术后应提供补充护理措施，包括补液、保温、用于赛拉嗪的逆转剂育亨宾、柔软的纸巾垫料（以防误吸），以促进恢复期的顺利进行。

7. 肝脏缺血再灌注损伤的评估

  1. 夹闭后立即观察，确保中叶和左外叶出现苍白缺血表现，而尾状叶和方叶无此现象。
  2. 通过检测血清丙氨酸转氨酶（sALT）、血清天冬氨酸转氨酶（sAST）和血清乳酸脱氢酶（sLDH）水平评估肝脏缺血损伤。可在再灌注开始后3–6小时经面静脉采血以获取血清。进行肝脏组织学检查，分析缺血叶内肿瘤区域所占百分比。

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结果

所有野生型（C57BL6）小鼠（n = 20）均采用上述方案建立肝转移模型。所有注射小鼠，无论是否伴有缺血再灌注损伤，均存活至预定处死时间点。示意图图1A展示了注射肿瘤细胞后肝脏的结构，其中门脉三联结构（肝动脉、门静脉和胆管）被夹闭，从而导致肝脏中叶和左外侧叶发生部分（70%）缺血损伤。在缺血再灌注损伤后2-3周内，可观察到肝转移灶数量增加。注射MC38癌细胞的小鼠被随机分为假手术组和缺血/再灌注（I/R）组。如图1B所示，第一组小鼠在注射肿瘤细胞后15分钟接受脾切除术，并在注射后第5天实施肝脏缺血再灌注手术。该模型允许循环中的癌细胞（CCs）在器官内定植。图2A显示，手术应激显著增加了肝脏内已存在微转移灶的数量。第二组小鼠（图1C）在注射肿瘤细胞后15分钟即接受手术诱导的缺血再灌注处理，并在夹闭60分钟后移除微血管夹以启动再灌注。手术应激的同步作用（图2B<...

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讨论

本文所述的动物模型基于两种主要方法。第一种方法是利用癌细胞在肝叶中定植和增殖的能力。第二种方法是研究肝缺血再灌注损伤对肿瘤生长和转移的影响。该模型可在免疫功能健全的小鼠体内特异性研究肝转移，且不出现其他继发性转移。该模型有助于探讨转移效率相关的问题，例如细胞存活、血管外渗及增殖等过程。

在第一种模型中，首先注射癌细胞，并允许形成微转移性疾病。随后，在5天后进行肝脏缺血-再灌注（I/R）。当研究手术对已形成的微转移性疾病的影响时，该模型具有重要意义。尽管过去十年中影像学技术已显著进步，但仍有可能存在影像学无法检测到的微转移病灶，在计划性肝切除术以达到治愈目的时可能被遗留下来。这些残留的微小病灶会受到伴随手术（特别是肝脏缺血-再灌注）所引起的炎症变化的影响，其生长呈指数级增加。另一方面，在第二种模型中，肝脏缺血-再灌注与肿瘤细胞注射同时进行。该模型侧重于研究肝脏缺血-再灌注对循环中癌细胞的影响以及新转移灶的形成过程。在肝手术过程中，对肿瘤的操作会导致肿瘤细胞进入血液循环。尽管大多数循环中的肿瘤细胞可被机体免疫监视系统清除，但仍有一部分细胞能够成功建立转移灶。第二种模型正是为了研究这一现...

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披露

作者声明本研究不存在相关利益冲突。

致谢

作者感谢 Sara Minemyer 和 Alexander Comerci 对语言的修改。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杜氏改良伊格尔培养基Lonza12-614F
胎牛血清Lonza900-108
L-谷氨酰胺Gibco25030-081
青霉素Fisher scientific15-140-122
链霉素Fisher scientific15-140-122
HEPESFisher ScientificSH3023701
胰蛋白酶Hyclonesh30042.02
细胞培养瓶 75 cm²5 Cells Star658170
15 ml 聚丙烯锥形管BioExcell41021037
台盼蓝染液Giibco15250-061
纱布Fisherbrand1376152
电凝器BovieAA01
微血管夹Finescience tools18055-03
带锁微血管夹施加器Fine science tooslFST-18056-14
弹簧剪Fine science tooslFST-15021-15
血管扩张器Fine science tooslFST-00276-13
磁性固定牵引系统Fine science tooslFST-18200020
微型阿德森镊Fine science tooslFST-11019-12
微型阿德森镊Fine science tooslFST-11018-12
4-0 聚丙烯缝合线EthiconK881H
持针器Harvard Apparatus72-8826
加热垫Fisher scientific1443915
动物毛发剪Oster559A
聚维酮碘溶液MedlineMDS093945
1 ml 25G 注射器BD safety Glide305903
0.5 ml 胰岛素注射器BD insulin Syringes32946
棉签Fisher Scientific23-400-101
手术显微镜LeicaLR92240
支原体ELISA检测试剂盒Roche11663925910
氯胺酮Putney#056344
赛拉嗪NADA#139-236
ALT试纸条Heska15809554
AST试纸条Heska15809542
LDH试纸条Heska15809607

参考文献

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